劉 哲，郝 倩，王金澤，任 婷，裴金金，郭耀東，金文剛

（陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 陜西漢中 723000）

生物被膜是細菌黏附在食品或接觸物的表面，自身分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)，并且將自身包裹在內(nèi)部，從而形成的大量細菌聚集的膜狀物[1-2]。成熟的生物被膜是由高度致密的細菌群體構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)及代謝非常復(fù)雜[3-4]。細菌形成生物被膜主要是為了適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境，保護自身，更好地在不利于自身的環(huán)境中生存。生物被膜內(nèi)的細菌不僅可以增強細菌對環(huán)境壓力（紫外線、酸、堿等）[5]和各種各樣的抑菌劑、殺菌劑的抵抗能力[6]，而且有助于增強細菌對宿主免疫防御系統(tǒng)的抵御能力[7-9]，使得細菌更易造成食品交叉污染并危害人體健康[10-11]。

大腸桿菌作為最主要的食源性致病菌之一，可形成生物被膜，增加環(huán)境抗性，造成食源性疾病[12]，其廣泛存在于一些生的或者未煮熟的食品中，尤其是生的或者未煮熟的肉制品和乳制品中[13]。解決大腸桿菌的污染問題成為當(dāng)前我國食品工業(yè)快速、健康發(fā)展的重要科學(xué)技術(shù)問題之一[14-16]。大腸桿菌極易產(chǎn)生生物被膜[17]，在動物體內(nèi)各個管道（消化道、尿道、呼吸道）表面極易附著，形成對自身有利的生物被膜，導(dǎo)致動物被大腸桿菌感染，后續(xù)會出現(xiàn)反復(fù)感染、難以治愈現(xiàn)象。

乳酸菌細菌素（Bactoriocins）是乳酸菌分泌產(chǎn)生的具有抗菌活性的一類多肽或多肽復(fù)合物，大多數(shù)經(jīng)核糖體加工合成，對與其近緣或生活環(huán)境類似的其它細菌具有抑制或殺滅效果[18-20]。一般分子質(zhì)量都不大、天然無毒[21-22]。在消費者對化學(xué)防腐劑日益抵觸的當(dāng)今，乳酸菌細菌素被認為是用于食品防腐及人和動物醫(yī)療保健的好材料[23-25]。

目前，已有報道發(fā)現(xiàn)超過7 個不同屬的乳酸菌能夠產(chǎn)生細菌素[20]?；诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量、熱穩(wěn)定性、作用方式和抗菌譜等特性，乳酸菌細菌素先后被分為4 大類[26]：第1 類是羊毛硫細菌素（Lantibiotics），其顯著特征為分子內(nèi)包含稀有的修飾氨基酸殘基——羊毛硫氨基酸（Lanthionine，Lan）或β-甲基羊毛硫氨基酸（β-Methyllanthionine，Melan）。第2 類為不含羊毛硫氨基酸的細菌素，一般分子質(zhì)量較?。ㄍǔＰ∮?0 ku），并且具有很強的熱穩(wěn)定，通常在N-末端有一段長度為18～21 個氨基酸的信號肽。第2 類細菌素又分為類片球菌素類（IIa）、二肽細菌素（IIb）和其它細菌素（IIc）3 類。IIa 具有抗李斯特氏菌特性，N 端一般包含Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Cys 的保守序列。乳酸菌葡萄球菌、明球菌、腸球菌、乳桿菌被報道產(chǎn)IIa 類細菌。IIb 由兩條細菌素鏈組成寡聚體共同發(fā)揮抗菌作用。IIc 則為第2 類中不屬于前兩類細菌素的其它細菌素。第3 類是熱敏感大分子蛋白（LHLP），分子質(zhì)量通常大于30 ku，對熱敏感，抑菌譜也較窄。第4 類是包含碳水化合物或類脂基團的蛋白復(fù)合物[18，20]。

關(guān)于乳酸菌細菌素抗菌活性機理研究，現(xiàn)有文獻集中在乳酸菌細菌素對敏感菌自身的抑制/殺滅作用機理方面[23-26]。乳酸菌細菌素可在敏感菌細胞膜上形成疏水“孔洞”，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物流失，細胞死亡[18-20]；也可與敏感菌胞內(nèi)重要的蛋白（酶）和DNA 相結(jié)合，導(dǎo)致細胞死亡[24-25]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌細菌素同樣可以影響敏感菌生物被膜的形成[26]。

研究團隊前期篩選獲得Class IIa 類乳酸菌細菌素plantaricin YKX（Lys-Tyr-Gly-Asn-Gly-Leu-Ser-Arg-Ile-Phe-Ser-Ala-Leu-Lys），對大腸感菌具有良好的殺滅效果，且能夠影響其生物被膜的形成。本研究在此基礎(chǔ)上，研究plantaricin YKX 對大腸桿菌（E.coil）ATCC25922 生物被膜的抑制及其作用機理，為大腸桿菌污染控制研究及乳酸菌細菌素抗菌機理研究提供新視角、新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

大腸桿菌大腸桿菌ATCC25922 來自美國微生物菌種保藏中心。采用LB 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，用5 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至7.2，定容至1 L，121 ℃滅菌30 min，固體培養(yǎng)基加入15%瓊脂粉。

細菌素產(chǎn)生菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YKX 分離自陜南秦巴富硒區(qū)富硒茶園中。采用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)，配方為：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.6。

菌株短期保藏在瓊脂斜面中，存放在4 ℃冰箱中。長期保存則劃線在用甘油密封的瓊脂斜面中，放置在-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 細菌素plantaricin YKX 制備及純化

將對數(shù)期中期植物乳桿菌YKX 的發(fā)酵液離心漂洗2 次（8 000×g、4 ℃、15 min），棄細胞收集上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，即為無細胞上清液（Cell-free supernatants，CFS）。

采用硫酸銨沉淀、SP-Sepharose 陽離子交換色譜（80 cm×2.0 cm，Sigma，USA）和反相高效液相色譜（RP-HPLC，Agilent Technologies，USA）純化獲得plantaricin YKX[11]。將植物乳桿菌YKX 菌株的CFS 采用冷凍干燥技術(shù)濃縮至初始體積的1/10。然后加入硫酸銨至體積分?jǐn)?shù)80%飽和度，4 ℃下靜置過夜沉淀。離心收集沉淀后復(fù)溶與20 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 5.0）中，進一步采用SPSepharose 層析柱進行純化。最后采用RP-HPLC制備液相進行純化。純化過程每一步均采用瓊脂孔擴散法[9]以酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）DSMZ3922 為指示菌測定抑 菌效果。采用Bradford 法測定蛋白濃度[9]。

1.3 最小抑菌濃度（MIC）測定

將對數(shù)期中期的大腸桿菌大腸桿菌ATCC25922 發(fā)酵液100 μL 加入96 孔板中，再分別添加100 μL 的2 倍質(zhì)量濃度梯度的plantaricin YKX 溶液使得樣品終質(zhì)量濃度分別為4，8，16，32，64，128，256，512 μg/mL。30 ℃下培養(yǎng)24 h 后采用平板涂布法檢測存活大腸桿菌ATCC25922細胞數(shù)。大腸桿菌ATCC25922 細胞生長被抑制的第一個質(zhì)量濃度為plantaricin YKX 的最小抑菌濃度（MIC）。對照組添加100 μL pH 7.0 的10 mol/L PBS 緩沖液。

1.4 結(jié)晶紫染色法檢測

吸取對數(shù)期中期的大腸桿菌ATCC25922 發(fā)酵液100 μL 分別加入96 孔板中，再分別加入100 μL plantaricin YKX 溶液，使得細菌素終質(zhì)量濃度為1/4MIC，1/2MIC 和3/4MIC（為避免因高質(zhì)量濃度plantaricin YKX 對浮游大腸桿菌細胞的殺滅作用而造成其生物被膜的減少干擾，試驗采用亞抑菌濃度的plantaricin YKX），37 ℃下培養(yǎng)3 d 至大腸桿菌生物被膜形成。對照組添加100 μL pH 7.0 的10 mol/L PBS 緩沖液。吸去孔內(nèi)懸浮菌液，用無菌生理鹽水輕輕沖洗生物被膜。用甲醇固定15 min，倒掉液體，風(fēng)干。加入200 μL，2 mg/mL的結(jié)晶紫染色20 min，倒掉結(jié)晶紫，用蒸餾水清洗浮色后風(fēng)干。再向各孔加入200 μL 95%乙醇搖床（100 r/min）脫色30 min 后，吸取100 μL 染液至另一潔凈96 孔板中，酶標(biāo)儀測定波長595 nm 下的OD 值。

1.5 大腸桿菌生物被膜菌落計數(shù)試驗

參考1.4 節(jié)方法，制備大腸桿菌ATCC25922生物被膜。吸去孔內(nèi)菌懸液，用蒸餾水清洗2 次去除浮游菌。用無菌槍頭刮取各孔生物被膜，分別轉(zhuǎn)移至另一潔凈96 孔板中，加入200 μL 無菌生理鹽水，超聲波處理10 min 分散細胞后，涂布于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)。

1.6 掃描電鏡觀察

參考1.4 節(jié)方法，制備大腸桿菌ATCC25922生物被膜。使用無菌生理鹽水輕輕洗掉浮游菌，加入2.5%的戊二醛溶液固定。PBS 緩沖液漂洗2 次之后分別用50%，70%，80%，90%的乙醇脫水15 min，最后用無水乙醇脫水2 次。用乙醇與醋酸異戊酯的混合液（體積比1∶1）處理樣品30 min，再用純醋酸異戊酯處理樣品1 h。臨界點干燥、鍍膜后，使用SU-8010 型場發(fā)射掃描電鏡觀察樣品。

1.7 激光共聚焦顯微鏡

參考1.4 節(jié)方法，制備大腸桿菌ATCC25922生物被膜。使用無菌生理鹽水洗去浮游菌。采用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit（SYTO9/PI 染料）25 ℃下避光染色30 min，于激光共聚焦顯微鏡上（1 000 倍油鏡）拍攝，SYTO 9 激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為500 nm：PI 激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為635 nm。

1.8 熒光顯微鏡觀察

參考1.4 節(jié)方法，制備大腸桿菌ATCC25922生物被膜。使用無菌生理鹽水洗去浮游菌后用10 μg/mL FITC-ConA 的染料37 ℃避光染色30 min。吸出多余染色液并用生理鹽水洗去浮色后，于熒光顯微鏡（1 000 倍油鏡）拍攝。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌素plantaricin YKX 純化制備

純化所得乳酸菌細菌素plantaricin YKX 的RP-HPLC 圖譜如圖1 所示為，在20.8 min 時觀察到一個明顯的活性峰，此結(jié)構(gòu)與實驗室前期研究結(jié)果一致。說明本研究通過得到高純度的plantaricin YKX，并用于后續(xù)試驗。

圖1 純化所得乳酸菌細菌素plantaricin YKX 的RP-HPLC 圖譜Fig.1 The RP-HPLC spectrum of purified bacteriocin plantaricin YKX

本文純化plantaricin YKX 的三步法是乳酸菌細菌素純化制備的經(jīng)典方法，被廣泛用于純化制備其它已報道的乳酸菌細菌素，譬如plantaricin 163、plantaricin FT259、garvicin 以 及 enterocins 7A 和7B 等[14，18，21，25]。plantaricin YKX 標(biāo)準(zhǔn)化制備方法的建立為本文后續(xù)研究所需高純度試驗材料提供技術(shù)保障。

2.2 plantaricin YKX 的MIC 測定

隨著plantricin YKX 質(zhì)量濃度的增加，大腸桿菌ATCC25922 活細胞數(shù)下降。如圖2 所示，當(dāng)加入最低質(zhì)量濃度細菌素時，觀察不到任何抑菌效果。當(dāng)細菌素質(zhì)量濃度升至32 μg/mL 時，大腸桿菌ATCC25922 生長被抑制。因此，plantricin YKX 針對大腸桿菌ATCC25922 的最小抑菌濃度定義為32 μg/mL。

圖2 plantricin YMX 對大腸桿菌大腸桿菌ATCC25922 的最小抑菌濃度Fig.2 The MIC of plantaricin YKX against E.coil ATCC25922

傳統(tǒng)認為乳酸菌細菌素只對革蘭氏陽性菌具有良好殺滅作用?？咕V窄成為限制乳酸菌細菌素產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用的瓶頸之一。隨著乳酸菌細菌素研究的廣泛深入，越來越多的學(xué)者報道篩選獲得對革蘭氏陽性菌和陰性菌都具有良好殺滅效果的廣譜抗菌肽。不同細菌素針對大腸桿菌的MIC值有所不同，部分學(xué)者報道其所篩選純化制備所得細菌素對大腸桿菌的MIC 范圍為8～64 μg/mL，本文plantaricin YKX 針對大腸桿菌ATCC25922的MIC 為32 μg/mL。

2.3 結(jié)晶紫染色法對大腸桿菌生物被膜的形成抑制

采用結(jié)晶紫染色法定量分析plantaricin YKX對大腸桿菌ATCC25922 在微孔板內(nèi)黏附并形成生物膜能力的影響。試驗結(jié)果如表1 所示，亞抑菌濃度plantaricin YKX 對大腸桿菌ATCC25922 生物膜的形成均有一定的抑制作用。隨著plantaricin YKX 質(zhì)量濃度增大，樣品OD595nm值不斷減小。大腸桿菌ATCC25922 生物被膜形成量隨著plantaricin YKX 質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，特別當(dāng)plantaricin YKX 質(zhì)量濃度增加到3/4MIC時，大腸桿菌ATCC25922 生物被膜形成抑制率可達到50%以上。

表1 不同質(zhì)量濃度plantaricin YKX 對大腸桿菌ATCC25922 生物被膜形成抑制率的影響Table 1 The effect of different mass concentrations of plantaricin YKX on the formation of biofilm

2.4 大腸桿菌生物被膜菌落計數(shù)結(jié)果

對 以3/4MIC、1/2MIC、1/4MIC 質(zhì) 量 濃 度 的plantaricin YKX 處理的和未處理過的大腸桿菌ATCC25922 生物被膜計數(shù)，結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度plantaricin YKX 處理后的菌落總數(shù)與對照組相比，顯著減少（P<0.05）。說明亞抑菌濃度的plantaricin YKX 能夠減少生物被膜中的活菌數(shù)，且隨著plantaricin YKX 質(zhì)量濃度的增加，抑制效果相應(yīng)增強。與結(jié)晶紫染色試驗結(jié)果相一致，菌落計數(shù)結(jié)果也表明plantaricin YKX 能夠抑制形成生物膜的大腸桿菌ATCC25922 生物量。綜合生物膜結(jié)晶紫染色和菌落計數(shù)結(jié)果得出plantaricin YKX 對大腸桿菌ATCC25922 生物膜形成具有一定的抑制作用。

表2 不同質(zhì)量濃度plantaricin YKX 對生物被膜菌落計數(shù)的影響Table 2 Effect of different mass concentrations of plantaricin YKX on the colony count of biofilm

2.5 細菌素plantaricin YKX 對大腸桿菌生物被膜的抑制作用

如圖3 所示，未經(jīng)plantaricin YKX 處理的大腸桿菌ATCC25922 形成了較為致密的生物被膜。而經(jīng)1/2MIC plantaricin YKX 處理后的大腸桿菌ATCC25922 生物被膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，表面細菌附著數(shù)較少，分布較稀疏，細菌輪廓清晰。

圖3 大腸桿菌ATCC25922 生物被膜掃描電鏡微觀形態(tài)圖Fig.3 Scanning electron microscopic morphology of E.coli ATCC25922 biofilm

2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜內(nèi)活菌和死菌數(shù)量

進一步選用熒光探針染色進行黏附細菌觀察。活菌會被SYTO-9 染為綠色，而死菌會被PI染為紅色。結(jié)果如圖4 所示，對照組生物膜細菌落十分密集，生物被膜內(nèi)的活菌數(shù)量明顯比經(jīng)plantaricin YKX 處理的多。plantaricin YKX 存在時的生物膜黏附細菌較少，且死菌數(shù)量比未處理的對照組多很多。

圖4 激光共聚焦觀察plantaricin YKX 處理和未處理的大腸桿菌生物被膜中活菌和死菌（×1 000）Fig.4 Confocal laser observation of the live/dead cells in E.coli ATCC25922 biofilm with and without the treatment of plantaricin YKX（×1 000）

2.7 熒光顯微鏡觀察生物被膜多糖的黏附作用

終質(zhì)量濃度1/2MIC 的plantaricin YKX 與大腸桿菌大腸桿菌ATCC25922 生物被膜共培養(yǎng)3 d，待生物被膜形成后，在1 000 倍油鏡熒光顯微鏡下觀察大腸桿菌的胞外多糖的黏附作用，結(jié)果如圖5 所示。對照組可以看出分泌了較為明顯的胞外多糖，并形成團狀，細菌的黏附性好，與此相比，1/2MIC plantaricin YKX 處理組熒胞外多糖分泌減少，分布較為稀疏，說明亞抑菌濃度plantaricin YKX 能夠較好的抑制大腸桿菌的黏附。

生物膜形成需要經(jīng)過細菌起始黏附、生物膜黏附、生長、成熟和散播等階段，細菌黏附是生物膜形成過程中的重要步驟之一。細菌在載體表面的黏附是一個復(fù)雜的過程，黏附機制復(fù)雜，且受諸多因素影響。當(dāng)細菌黏附于載體表面的數(shù)量達到一定程度后，聚集過程被啟動，隨后細菌之間相互黏附、分化、增殖，大量胞外基質(zhì)被分泌，形成高度組織化的多細胞團塊結(jié)構(gòu)，最終形成生物膜結(jié)構(gòu)。生物膜中的胞外聚合物由多糖、蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)組成，在生物膜形成中，參與細菌黏附，聚集環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)，夠限制環(huán)境有害成分滲透、增強環(huán)境的耐受力，以及在生物膜立體結(jié)構(gòu)形成中起到重要作用。胞外聚合物的瓦解不僅能夠降低生物膜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，也會增加細菌生物膜對抗生素的敏感性。FITC-ConA 是能夠與D2 甘露糖和D2葡萄糖胺結(jié)合而顯色，從而可以通過熒光顯微鏡觀察FITC-ConA 的熒光強度、分布等情況，進而直觀的觀察胞外多糖的變化。

3 結(jié)論

本論文探索了實驗室前期分離所得plantaricin YKX 對大腸桿菌ATCC25922 生物被膜的抑制作用及其機理。plantaricin YKX 的MIC 為32 μg/mL；結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示在3/4MIC 的plantaricin YKX 作用下，大腸桿菌ATCC25922 生物被膜顯著抑制，同時菌落總數(shù)減少3 個數(shù)量級。掃描電鏡觀察到plantaricin YKX 處理大腸桿菌ATCC25922 生物被膜可使結(jié)構(gòu)遭到破壞；激光共聚焦結(jié)果顯示，經(jīng)plantaricin YKX 處理的大腸桿菌ATCC25922 生物被膜，死菌數(shù)量比未處理的對照組要增加很多；熒光染料結(jié)合熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，1/2MIC plantaricin YKX 處理組熒胞外多糖分泌減少，分布較為稀疏。本研究所得乳酸菌細菌素plantacin YKX 能夠有效抑制大腸桿菌ATCC25922 生物被膜的形成。