趙美娟，王 芳，姜澤東，3，王 力，3*，倪 輝，3

（1 集美大學海洋食品與生物工程學院 福建廈門361021 2 泉州師范學院海洋與食品學院 福建泉州362000 3 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室 福建廈門 361021）

食品添加劑是一類對人體無害或危害性極低的天然或人工合成物質(zhì)，一般用于改善食品品質(zhì)[1]。作為食品添加劑的化合物大多具有豐富的官能團，這些官能團決定了化合物所具有的多種獨特功能[2]，尤其是抗氧化劑?？寡趸瘎┰谑称分械膽檬峭ㄟ^延緩食品的氧化，來延長食品保質(zhì)期。目前，抗氧化劑不再單一地用于食品加工，已逐漸延伸于生物醫(yī)學領域，有研究表明抗氧化劑具有抑菌[3]、抗癌[4]，治療心血管疾病[5]等作用。

沒食子酸丙酯是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）承認并允許添加到食品中的合成食品抗氧化劑之一[6]，主要用于防止油炸食品、油脂、果蔬、罐頭等[7]食品氧化。同時，沒食子酸丙酯還具有許多藥理學功能，比如在抑制酶活性[8]，抗血小板凝結(jié)[9]，保護受損心肌[10]，促進血栓溶解[11]，抗炎[12]，護肝[13]及誘導肝癌細胞凋亡[14]等過程中發(fā)揮著重要作用。L-抗壞血酸棕櫚酸酯是世界衛(wèi)生組織公認的一種安全、營養(yǎng)、高效的食品添加劑[15]，也是目前我國唯一一種嬰幼兒食品中允許添加的抗氧化劑[16]，不僅作為抗氧化劑被廣泛應用，還在抗癌[17]、抗腫瘤[18]等領域發(fā)揮重要作用。

酪氨酸酶（EC1.14.18.1，Tyrosinase）也被稱為多酚氧化酶（PPO）[19]，是一種結(jié)構(gòu)復雜的含銅多功能氧化還原酶[20]，其生物活性依賴于活性中心的銅離子[21]。酪氨酸酶是黑色素形成過程中的關鍵限速酶[22]，其異常表達會導致黑色素過度沉積，從而引起色斑等由色素沉著引發(fā)的皮膚問題[23]、果蔬[24]及水產(chǎn)品[25]的褐變問題，同時黑色素的產(chǎn)生還會提高昆蟲的防御機制[26]。酪氨酸酶抑制劑能夠降低酪氨酸酶的活性，進而阻礙黑色素的合成。酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)療藥物、美白化妝品、食品保鮮及殺蟲劑的研制等方面具有良好的應用前景。然而，目前少有食品添加劑抑制酪氨酸酶活性的研究。本文以酶動力學研究沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶的抑制作用，以分子對接技術(shù)研究其抑制機理，旨為拓展食品添加劑的功能性研究提供理論參考，也為酪氨酸酶抑制劑提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

雙胞蘑菇酪氨酸酶（EC 1.14.18.1），美國Singma-Aidrich 公司；L-3，4-二羥基苯丙氨酸（LDOPA），上海寶曼生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、無水碳酸鈉（Na2CO3）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O），西隴化工股份有限公司；沒食子酸丙酯、L-抗壞血酸棕櫚酸酯，上海陸廣生物科技有限公司。

BioTek Epoch 全波長酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；FiveEasy Plus 電子酸度計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ2100E 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9037A 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；RO5 多點磁力攪拌器，艾卡（廣州）儀器設備有限公司；BSA124S 電子天平，賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸酶活性的測定 參考文獻[27-28]稍作修改，酪氨酸酶活性的測定方法如下：將底物L-DOPA 溶解于50 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）中，置于30 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)預熱30 min；隨后，以V效應物溶液∶V底物溶液∶V酪氨酸酶溶液=7∶196∶7，依次將上述溶液加入96 孔板，快速混合均勻，30 ℃恒溫反應30 min；最后，使用酶標儀測定波長475 nm 處的吸光度值[29]。每組樣品設置5 組平行試驗。

1.2.2 酶動力學

1.2.2.1 抑制效果 按照2.1 節(jié)的方法，以沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯為效應物，每種效應物設定11～14 個系列梯度濃度；固定底物和酶溶液濃度（CS=0.5 mmol/L，CE=500 U/mL）。以未添加效應物的試驗組為空白對照組，按照下列公式計算相對剩余酶活性。

式中，Ab——空白組測得吸光度值；As——樣品組測得吸光度值。

相對剩余酶活性降至50%時效應物的濃度即為IC50值，以IC50值表示效應物對酪氨酸酶的抑制效果。

1.2.2.2 抑制機理 沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對蘑菇酪氨酸酶的抑制機理基于1.2.1節(jié)的酶活性測定體系。在反應體系中，固定底物濃度及添加量，酪氨酸酶濃度分別設定為100，200，300，400 U/mL 和500 U/mL，測定不同效應物濃度下整個反應體系在波長475 nm 處的吸光度值。將酶促反應速率作為酶活性的函數(shù)繪制圖，根據(jù)得到的抑制曲線圖判斷效應物對蘑菇酪氨酸酶的抑制機理。

1.2.2.3 抑制類型 基于1.2.1 節(jié)酶活性測定體系，以沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯為待測效應物，設置底物梯度濃度為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L，酪氨酸酶濃度為500 U/mL，底物LDOPA 的濃度為0.5 mmol/L。測定不同效應物濃度下整個反應體系在波長475 nm 處的吸光度值。效應物對蘑菇酪氨酸酶的抑制類型通過Lineweaver-Burk 作圖法繪制抑制類型圖進行分析，而后抑制常數(shù)KI、KIS 通過二次作Dixon 圖得到。

1.2.3 分子對接 酪氨酸酶是一種結(jié)構(gòu)復雜的氧化還原酶，目前，酪氨酸酶的主要來源為雙孢蘑菇。雙孢蘑菇酪氨酸酶與人類酪氨酸酶具有很高的相似性和同源性，廣泛用于篩選酪氨酸酶抑制劑和黑色素生成研究、酶催化反應和酶抑制劑的結(jié)構(gòu)研究的模型系統(tǒng)[30]。分子對接能夠初步模擬效應物與酪氨酸酶之間的結(jié)合作用，為進一步探索二者間的作用機制提供依據(jù)。雙孢蘑菇酪氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB：2Y9X）為所需酶蛋白分子，它的氨基酸序列以及空間三維結(jié)構(gòu)可以從UniProt 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）檢索獲得[31]，ZICN 小分子數(shù)據(jù)庫（http：//zinc.docking.org/）檢索下載沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯的三維結(jié)構(gòu)作為虛擬對接配體。使用MOE 軟件將酶蛋白分子和效應物分子進行3D 質(zhì)子化和能量最小化操作，將處理后的文件保存以備后續(xù)操作。

同時導入處理后的酶蛋白分子以及配體小分子，在酶蛋白活性口袋附近選擇對接位點，用Simulations-Dock 程序進行分子對接，設定分子對接模擬參數(shù)，使用London dG 評分函數(shù)（單位為kcal/mol）計算結(jié)合自由能，評分函數(shù)越低則結(jié)合越穩(wěn)定[32-33]。使用三維可視化PyMOL 軟件分析處理配體化合物與酶蛋白分子結(jié)合的最佳構(gòu)象，突出顯示配體化合物和酶蛋白分子間的結(jié)合方式、作用氨基酸殘基。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本試驗圖像繪制依托于Origin Pro 8.5，通過SPSS Statistics 17.0 進行試驗數(shù)據(jù)分析。分子對接結(jié)果由過Molecular Operating Environment（MOE 2008.10）計算得到，得到對接結(jié)果用PyMol 2.2.0 進行可視化分析。所有數(shù)據(jù)值均表示為平均值±標準誤差。

2 結(jié)果與討論

2.1 沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶的抑制效果

以沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯這2種食品添加劑作為效應物，研究二者對蘑菇酪氨酸酶的抑制效果。以效應物濃度為x 軸，相對剩余酶活性為y 軸，繪制抑制效果圖如圖1 所示。沒食子酸丙酯的IC50值為（18.036±0.823）mmol/L，L-抗壞血酸棕櫚酸酯的IC50值為（2.806±0.082）mmol/L。由兩者的IC50值可知，L-抗壞血酸棕櫚酸酯的抑制效果優(yōu)于沒食子酸丙酯，并且優(yōu)于標準酪氨酸酶抑制劑熊果苷（IC50=5.3～8.4 mmol/L）[34]。

圖1 2 種食品添加劑對酪氨酸酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of two food additives on the tyrosinase

2.2 沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶的抑制機理

沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯這2種食品添加劑對蘑菇酪氨酸酶的抑制機理圖如圖2 所示。圖中4 條直線分別對應效應物4 個不同濃度下的作用曲線，圖中的抑制曲線均交于原點，隨著效應物濃度的增大，添加劑與酪氨酸酶的反應速率逐漸減小，說明沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶的抑制均是可逆的，酪氨酸酶與這2 種添加劑間以非共價鍵相連。

圖2 沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶的抑制機理Fig.2 Mechanism of tyrosinase inhibition by propyl gallate and L-ascorbyl palmitate

2.3 沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶的抑制類型

以沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯為效應物，固定酶濃度，改變底物濃度，研究二者對蘑菇酪氨酸酶的抑制類型，結(jié)果如圖3 所示。圖3a為沒食子酸丙酯對酪氨酸酶的抑制類型圖，圖中直線1～4 分別代表沒食子酸丙酯4 個濃度下的抑制曲線，圖中顯示4 條直線的交點位于第2 象限，計算得到抑制常數(shù)KI=10.929 mmol/L，KIS=33.187 mmol/L，KIS>KI，與文獻[35]報道相符，說明沒食子酸丙酯對酪氨酸酶是混合型抑制，沒食子酸丙酯既可與游離酶結(jié)合，還可與酶-底物復合物結(jié)合。最大反應速率（Vmax）隨著沒食子酸丙酯濃度的增加而逐漸降低，米氏常數(shù)（Km）則呈現(xiàn)增長趨勢。

圖3b 是L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶的抑制類型圖，圖中直線1～4 幾乎平行，隨著L-抗壞血酸棕櫚酸酯濃度增大，y 軸截距（（1/Vmax）與x軸截距（1/Km）同時逐漸增大，說明L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶的抑制類型是反競爭性抑制，L-抗壞血酸棕櫚酸酯不能與游離酶結(jié)合，可以與酶-底物絡合物結(jié)合，然而，酶-底物絡合物無法形成產(chǎn)物，降低了酶的催化活性。通過計算得出L-抗壞血酸棕櫚酸酯的抑制常數(shù)KIS=3.423 mmol/L。

圖3 沒食子酸丙酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶抑制類型及抑制常數(shù)Fig.3 Inhibitory type and inhibition constant of propyl gallate and L-ascorbyl palmitate on tyrosinase

2.4 分子對接結(jié)果

沒食子酸丙酯是一種常見的抗氧化劑，含有3 個酚羥基，同時具有C=O 不飽和鍵，以化學結(jié)構(gòu)式而言，沒食子酸丙酯容易與其它化合物形成氫鍵。沒食子酸丙酯與酪氨酸酶分子對接結(jié)果如圖4 所示。圖4a 顯示，沒食子酸丙酯成功嵌入酪氨酸酶的活性口袋，由圖4c 可知，疏水氨基酸Phe90、Phe264、Met280、Val283 和Phe292 構(gòu)成酪氨酸酶的活性口袋。圖4b 和c 顯示沒食子酸丙酯與酪氨酸酶蛋白活性口袋周圍的His259 形成氫鍵，氫鍵是沒食子酸丙酯與酪氨酸酶之間的主要作用力。同時，沒食子酸丙酯結(jié)構(gòu)中的芳烴與His259 還形成金屬接觸（Metal contact）作用，增加二者的結(jié)合力。此外，沒食子酸丙酯與酪氨酸酶活性中心間還存在范德華力，參與的氨基酸包括極性氨基酸Cys83、Thr84、Asn260、Gly281，堿性氨基酸His85、His94、His259、His263，酸性氨基酸Glu256。范德華力的強弱與分子極性及分子間靜電效應成正相關，參與作用的極性氨基酸越多，分子極性越大；帶電氨基酸越多，分子間靜電效應越強，則分子間的范德華力越強。因此，氫鍵和范德華力是沒食子酸丙酯與酪氨酸酶之間的主要作用力，分子對接結(jié)果從側(cè)面印證兩者之間以非共價鍵結(jié)合，沒食子酸丙酯是酪氨酸酶的可逆性抑制劑。

圖4 沒食子酸丙酯與酪氨酸酶活性口袋的氨基酸殘基相互作用Fig.4 Interaction of propyl gallate and amino acid residues in the activity pocket of tyrosinase

L-抗壞血酸棕櫚酸酯與酪氨酸酶的分子對接結(jié)果如圖5 所示，圖5a 中，L-抗壞血酸棕櫚酸酯帶有酚羥基的一端基本完全嵌入酪氨酸酶的活性口袋中。圖5b 和c 顯示，L-抗壞血酸棕櫚酸酯與酪氨酸酶活性口袋周圍的氨基酸殘基His61、His244、Glu256 形成3 個氫鍵，與Cys83、Thr84、His85、Gly86、Phe90、His94、His259、Asn260、His263、Phe264、Val283、Phe292、His296 之間以范德華力相互作用，疏水氨基酸Phe90、Phe264、Val283、Phe292 與酪氨酸酶活性口袋的形成相關。

圖5 L-抗壞血酸棕櫚酸酯與酪氨酸酶活性口袋的氨基酸殘基相互作用Fig.5 Interaction of L-ascorbyl palmitate and amino acid residues in the pocket of tyrosinase activity

綜上所述，L-抗壞血酸棕櫚酸酯與酪氨酸酶活性中心形成的氫鍵數(shù)量多于沒食子酸丙酯，并且L-抗壞血酸棕櫚酸酯與酪氨酸酶活性口袋形成范德華力的氨基酸殘基中極性氨基酸與帶電氨基酸所占比例偏高，L-抗壞血酸棕櫚酸酯與酪氨酸酶間的范德華力更強。因此，L-抗壞血酸棕櫚酸酯與酪氨酸酶結(jié)合更穩(wěn)定，對酪氨酸酶的抑制效果更顯著。

3 結(jié)論

沒食子酸丙酯 【IC50=（18.036±0.823）mmol/L】和L-抗壞血酸棕櫚酸酯 【IC50=（2.806±0.082）mmol/L】對酪氨酸酶均展現(xiàn)出抑制效果，其中沒食子酸丙酯是可逆混合型抑制，L-抗壞血酸棕櫚酸酯是可逆反競爭性抑制。分子對接結(jié)果顯示，氫鍵和范德華力是2 種食品添加劑與酪氨酸酶之間的主要作用力，進一步印證二者對酪氨酸酶的抑制是可逆的。此試驗不僅拓寬了食品添加劑的應用，同時為酪氨酸酶抑制劑的研究提供理論基礎及新的研究方向。