任樂樂，逄金柱，米麗娟，李依璇，鄭麗敏,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學信息與電氣工程學院，北京 100083；2.內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，北京 101107；3.中國農(nóng)業(yè)大學營養(yǎng)與健康研究院，教育部北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083）

母乳是嬰兒最佳營養(yǎng)來源，對嬰兒的生長發(fā)育有短期和長期的好處[1]。世界衛(wèi)生組織建議出生后6 月齡內進行純母乳喂養(yǎng)，并可以繼續(xù)母乳喂養(yǎng)直至2 周歲甚至更久。但是對于母乳喂養(yǎng)不足或不能實現(xiàn)母乳喂養(yǎng)的嬰兒，為滿足其生長發(fā)育的營養(yǎng)需求，嬰幼兒配方奶粉（以下簡稱嬰配粉）成為母乳的最佳代替品。近年來，嬰配粉的營養(yǎng)基礎研究受到廣泛關注，為了盡可能地模擬母乳的成分，進行包括一些生物活性物質的細微調整等多種策略[2]，母乳化是嬰配粉營養(yǎng)基礎研究的準則，加強嬰配粉的母乳化研究，明確母乳中的營養(yǎng)成分至關重要。

蛋白質是母乳中最重要的營養(yǎng)成分之一，蛋白質不僅為嬰兒提供14.06%的能量[3]，還通過多種代謝途徑參與嬰幼兒身體組織結構和功能的發(fā)育[4]。蛋白質的營養(yǎng)取決于各種氨基酸組成情況，母乳中的氨基酸是嬰兒合成蛋白質及其他物質的重要來源[5]。母乳中的氨基酸能夠為嬰兒直接提供營養(yǎng)物質，并且能夠提升嬰兒的免疫能力及促進腦部發(fā)育。氨基酸含量在不同泌乳階段是動態(tài)變化的，隨泌乳時間的延長，各氨基酸含量都呈現(xiàn)出下降趨勢，但是各氨基酸含量在總氨基酸中的占比保持穩(wěn)定[6]。有研究表明，不同民族、地理位置母親的母乳氨基酸含量隨泌乳時間延長的變化趨勢一致[7]，但是目前對于影響母乳中氨基酸含量的因素還知之甚少。嬰幼兒的氨基酸需求會隨著年齡增長發(fā)生變化，因此需要明確不同泌乳階段母乳氨基酸模式組成，并開發(fā)相應的嬰配粉產(chǎn)品，以滿足嬰兒生長發(fā)育需要。

母乳中的氨基酸模式適合嬰幼兒生長發(fā)育需求[8]，在嬰配粉研發(fā)過程中，多以某地區(qū)母乳的營養(yǎng)成分作為研究基礎，提出適合該地區(qū)的氨基酸組成模式。而母乳營養(yǎng)成分數(shù)據(jù)采集困難，鮮有公開的母乳營養(yǎng)成分庫，很難對母乳成分影響因素分類討論，提出的氨基酸組成模式較為單一。目前國際母乳氨基酸模式研究鮮有基于中國母乳營養(yǎng)特征[9-10]，難以明確其氨基酸組成模式是否符合中國嬰幼兒生長發(fā)育需要。因此，建立中國母乳氨基酸組成模式對于指導中國嬰配粉母乳化研究及營養(yǎng)學基礎研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳募集自北京、濟南、包頭、成都、昆明、深圳、南京、西寧的240 名產(chǎn)婦，年齡18～38 歲，身體健康，嬰兒身體健康，所有產(chǎn)婦母乳喂養(yǎng)嬰兒12個月。所有產(chǎn)婦均署了知情同意書。

36%（質量分數(shù)）鹽酸、苯酚、檸檬酸鈉、硫酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、硫酸銅、溴甲酚綠、甲基紅、硼酸（均為分析純） 天津市永大化學試劑有限公司；5-甲基-DL-色氨酸（分析純） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；磷酸二氫鈉（色譜純） 美國Acros Organics公司。

1.2 儀器與設備

L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司；Kjeltec 8400凱氏定氮儀 丹麥福斯公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳收集及保存

母乳成分具有明顯的晝夜節(jié)律變化[11]，由統(tǒng)一培訓的科研人員于上午9：00—11：00在醫(yī)院或入戶開展問卷調查及母乳采集，問卷信息主要包括母親與嬰兒基本信息，母親基本信息主要包括：年齡、民族（漢族或少數(shù)民族）、地域（南方（成都、昆明、深圳、南京）和北方（北京、濟南、包頭、西寧））、產(chǎn)次（第1、2次分娩）、分娩季節(jié)（冬春季（11—12月及1—4月）和夏秋季（5—10月））、產(chǎn)前體質量、孕前體質量、產(chǎn)后12個月體質量、分娩方式（剖宮產(chǎn)、正常分娩）、孕期疾病、服用營養(yǎng)素情況以及患病史。嬰兒基本信息主要包括出生日期、出生體質量、出生身長、性別、出生情況（足月、早產(chǎn)）以及患有疾病情況等。母乳采集使用項目組統(tǒng)一配備的電動吸奶器采空單側乳房的全部乳汁并分裝，縱向采集10 次，包括初乳1 次（產(chǎn)后1～7 d，共收集171 份有效樣本），過渡乳1 次（產(chǎn)后8～14 d，共收集143 份有效樣本），早期成熟乳6 次（產(chǎn)后15～180 d，共收集1 028 份有效樣本）及晚期成熟乳2 次（產(chǎn)后181～360 d，共收集298 份有效樣本），采集后的母乳于-80 ℃保存?zhèn)溆?，最終收集206 位母親有效母乳樣本共1 640 份。

1.3.2 氨基酸及蛋白質水平測定

目前可用于人乳氨基酸含量測定的常見方法主要有氨基酸自動分析法[12]、氣相色譜法[13]、高效液色譜法[14]等。氨基酸自動分析儀具有樣品制備簡單、結果可靠、適用于大量常規(guī)樣本檢測等優(yōu)點，因此本研究采用L-8900氨基酸自動分析儀測定母乳中氨基酸質量濃度。樣品送至北京市營養(yǎng)源研究所有限公司測定母乳中18種氨基酸的質量濃度（其中16種氨基酸質量濃度測定參考GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，半胱氨酸和色氨酸質量濃度測定采用該公司開發(fā)建立的檢測方法）。以100 mL母乳中某氨基酸質量濃度與總蛋白質量濃度的比值計，單位為mg/g。根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》采用凱氏定氮法測定母乳中蛋白質含量（單位為mg/g），每個樣品測定2 次，結果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

實驗結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析與處理，采用Origin 2016軟件作圖。采用Excel軟件構建母乳營養(yǎng)成分庫，其中包含產(chǎn)婦基本信息、嬰兒基本信息、母乳氨基酸含量。采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，采用歐氏距離（式（1））表征不同母乳樣本的相似度。歐氏距離越小表示母乳氨基酸模式越相似，通過歐氏距離篩選了80%母乳樣本，得出推薦母乳氨基酸模式。按式（1）、（2）計算母乳氨基酸的平均歐氏距離。

式中：D（mi，mj）為母乳樣本i和母乳樣本j之間的距離；aa1～aa18和bb1～bb18分別表示母乳樣本i和j中的18種氨基酸含量。

式中：D（mi）為當前母乳樣本到總體樣本的平均歐氏距離；n表示母乳樣本個數(shù)。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)婦及嬰兒的基本信息

首先根據(jù)方差同質檢驗分析母親信息與嬰兒的基本信息數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，當滿足正態(tài)分布時采用單因素方差分析比較組間差異[15]，否則采用Mann-Whitney U檢驗進行顯著性分析。由表1可知，地域對于母親和嬰兒均具有顯著影響：南方母親生育年齡極顯著大于北方母親（P＜0.01），而北方母親孕前體質量、產(chǎn)前體質量及產(chǎn)后12個月體質量均極顯著高于南方母親（P＜0.01），北方嬰兒出生體質量與出生身長與南方嬰兒也具有顯著性差異（P＜0.05）。在分娩方式影響因素下，剖宮產(chǎn)母親生育年齡顯著大于正常分娩的母親（P＜0.05），同時剖宮產(chǎn)分娩的嬰兒體質量極顯著高于正常分娩嬰兒體質量（P＜0.01）。年齡影響因素下，因以年齡對數(shù)據(jù)進行分類，僅生育年齡具有顯著性差異（P＜0.01），其他信息均無顯著差異。民族影響因素下，少數(shù)民族母親產(chǎn)后12個月體質量顯著大于漢族母親（P＜0.05），但是由于少數(shù)民族母親樣本數(shù)較小，關于民族因素對母親和嬰兒的影響需要擴充數(shù)據(jù)庫進一步探討。分娩季節(jié)因素下，夏秋季分娩的母親孕前體質量顯著大于冬春季母親（P＜0.05）。出生情況影響因素下，早產(chǎn)兒的體質量及身長均極顯著低于足月兒（P＜0.01）。產(chǎn)次影響因素下，第1次分娩母親年齡顯著小于第2次分娩母親（P＜0.05）。

表1 母親和嬰兒基本信息統(tǒng)計分析結果Table 1 Statistical analysis of basic information of nursing mothers and infants

2.2 母乳氨基酸模式影響因素

2.2.1 地域對母乳氨基酸模式的影響

本研究采集了8個城市母乳數(shù)據(jù)，其中南方城市母親106 名，北方城市母親100 名，如表2所示，4個泌乳時期中南方和北方母乳氨基酸含量結果表明地域因素對于初乳沒有顯著影響（P＞0.05），而北方城市母親過渡乳中絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量顯著高于南方城市（P＜0.05），早期成熟乳中具有顯著差異氨基酸數(shù)量達到了9種，晚期成熟乳含量差異氨基酸數(shù)量為6種，且均表現(xiàn)為北方氨基酸含量顯著高于南方。

表2 不同泌乳階段南北方母乳中氨基酸含量Table 2 Amino acid composition of breast milk from north and south China at different lactation stages mg/g

2.2.2 產(chǎn)次對母乳氨基酸模式的影響

本研究募集了第1次分娩母親167 名，第2次分娩母親39 名。不同產(chǎn)次下氨基酸占比隨泌乳時期的變化如圖1所示，組氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸在總氨基酸中占比隨泌乳時間的延長均呈現(xiàn)出下降的趨勢，賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和脯氨酸均呈現(xiàn)出上升的趨勢。比較不同產(chǎn)次母乳中各氨基酸占比可知，第1次分娩母乳中谷氨酸占比在晚期成熟乳階段達到最大值，第2次分娩母乳中谷氨酸占比在早期成熟乳階段即達到峰值并與晚期成熟乳中的谷氨酸占比相近，其他氨基酸占比變化趨勢相似。

圖1 不同產(chǎn)次母親的不同泌乳期乳汁中氨基酸占比變化Fig. 1 Change in relative contents of amino acids in break milk from different parities during different lactation periods

不同產(chǎn)次的初乳和過渡乳氨基酸模式?jīng)]有明顯差異，但是在早期成熟乳和晚期成熟乳中，第2次分娩母乳中甘氨酸占比明顯高于第1次分娩母乳。

2.2.3 分娩季節(jié)對母乳氨基酸模式的影響

不同季節(jié)溫度、濕度也不同，已有研究表明牛乳、羊乳中多種營養(yǎng)成分呈現(xiàn)出季節(jié)性的變化[16]，且冬春季分娩牛乳的部分營養(yǎng)成分含量要顯著高于夏秋季[17]。本研究募集冬春季分娩母親86 名，夏秋季分娩母親120 名，探討了母乳不同泌乳階段中氨基酸模式季節(jié)性變化。如表3所示，不同季節(jié)分娩母親的各泌乳階段氨基酸含量存在明顯，初乳時期氨基酸含量不會受到季節(jié)因素的影響，而隨泌乳時間的延長，季節(jié)因素會極顯著影響半胱氨酸含量（P＜0.01）。在早期成熟乳階段酪氨酸冬春季含量（（35.14±6.44）mg/g）極顯著高于夏秋季（（32.22±6.04）mg/g）（P＜0.01），丙氨酸和天冬氨酸冬春季含量（分別為（32.8±2.38）、（77.27±4.49）mg/g）顯著高于夏秋季（分別為（31.78±2.42）、（75.49±5.18）mg/g）（P＜0.05）；晚期成熟乳階段冬春季丙氨酸和精氨酸含量（分別為（34.02±3.14）、（31.82±3.10）mg/g）極顯著高于夏秋季（分別為（31.85±2.93）、（29.53±2.72）mg/g）（P＜0.01），天冬氨酸、絲氨酸和谷氨酸冬春季含量（分別為（76.38±6.08）、（40.06±3.36）、（163.64±16.17）mg/g）顯著或極顯著高于夏秋季（分別為（73.77±5.39）、（38.28±3.11）、（156.20±12.56）mg/g）（P＜0.05、P＜0.01）。分析結果表明季節(jié)因素對各泌乳階段必需氨基酸含量均無明顯影響。

表3 不同泌乳階段冬春季與夏秋季母乳中氨基酸含量Table 3 Amino acid composition of breast milk from different seasons at different lactation stages mg/g

2.2.4 出生情況、分娩方式對母乳各氨基酸模式的影響

本研究根據(jù)嬰兒出生情況對母乳進行劃分，其中早產(chǎn)分娩母親11 名，足月分娩母親194 名。如表4所示，除足月分娩母親早期成熟乳纈氨酸含量顯著高于相同泌乳階段早產(chǎn)分娩母親母乳（P＜0.05），足月與早產(chǎn)對其他泌乳時期中氨基酸模式均無顯著影響（P＞0.05）。另外根據(jù)母親分娩方式進行劃分，本研究中剖宮產(chǎn)母親113 名，正常陰道分娩母親93 名，如表5所示，初乳階段正常分娩母親母乳絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸含量顯著高于剖宮產(chǎn)母親（P＜0.05），分娩方式對于過渡乳和早期成熟乳各氨基酸含量沒有顯著影響（P＞0.05），而到晚期成熟乳階段剖宮產(chǎn)母親母乳蛋氨酸含量會顯著高于正常分娩母親（P＜0.05）。

表4 不同泌乳階段早產(chǎn)兒與足月兒母乳中氨基酸含量Table 4 Amino acid composition of breast milk of premature and fullterm infants at different lactation stages mg/g

表5 不同泌乳階段剖宮產(chǎn)與正常分娩母親母乳中氨基酸含量Table 5 Amino acid composition of breast milk from caesarean section and normal delivery mothers at different lactation stages mg/g

2.3 氨基酸模式分析結果

2.3.1 氨基酸相似度分析

本研究采用歐氏距離衡量母乳相似度，計算每個母乳樣本到其他全部母乳樣本的平均距離，將其作為各母乳的氨基酸相似度，并對相似對進行排序。根據(jù)歐氏距離進行排序，得到的最小母乳模式與最大母乳模式如圖2所示，各氨基酸含量差異非常明顯。表6描述了最小母乳樣本與最大母乳樣本的歐氏平均距離，可以發(fā)現(xiàn)隨泌乳時間的延長，母乳歐氏平均距離逐漸減小，進一步說明隨泌乳時間的延長，各氨基酸含量趨于穩(wěn)定。但是最大模式中晚期成熟乳歐氏平均距離產(chǎn)生波動，說明母乳樣本中存在變異樣本。因此為消除變異母乳帶來的影響，本研究根據(jù)歐氏距離排序結果取80%母乳樣本作為推薦母乳，提出了不同泌乳時期推薦母乳氨基酸模式（表7）。

圖2 最小母乳樣本與最大母乳樣本模式Fig. 2 Recent breast milk and furthest breast milk sample patterns

表6 最大母乳樣本與最小母乳樣本歐氏平均距離Table 6 Average Euclidean distance from furthest breast milk to nearest breast milk

表7 推薦母乳氨基酸模式Table 7 Recommended breast milk amino acid pattern

2.3.2 不同影響因素氨基酸模式

通過分析地域、產(chǎn)次、分娩季節(jié)、出生情況、分娩方式5個因素對各泌乳時期母乳氨基酸含量的影響，可以看出地域和分娩季節(jié)對于早期成熟乳和晚期成熟乳影響均較大，因此，研究對篩選后的母乳樣本根據(jù)地域和季節(jié)進行分類，提出針對南方和北方、冬春季和夏秋季的中國母親泌乳模式（表8）。

表8 不同地域與分娩季節(jié)母乳氨基酸模式Table 8 Amino acid patterns of breast milk from different regions and delivery seasons mg/g

3 討 論

研究共采集了206 名母親不同泌乳期的1 640 份樣本，分析比較了地域、產(chǎn)次、分娩季節(jié)、出生情況、分娩方式5個因素下我國不同泌乳階段氨基酸模式及其變化趨勢，豐富了我國母乳庫數(shù)據(jù)，為后續(xù)制定我國嬰幼兒氨基酸攝入標準以及嬰幼兒配方粉的母乳化研究提供依據(jù)。

分析多種因素下母乳中氨基酸含量差異的文獻相對較少，多見于關于某一因素的氨基酸含量差異，主要受限于樣本采集、樣本保存、監(jiān)測等多方面因素，難以進行多維度的比較。近年來，逄金柱等[6]針對北京和深圳兩地30 名健康乳母開展研究，探討了地域因素對于母乳氨基酸質量濃度以及相對含量的影響。段一凡等[19]選取了來自11個省市區(qū)的20個調查點，分析了中國城市和農(nóng)村間母乳氨基酸質量濃度的差異。Sundekilde等[20]研究表明早產(chǎn)兒母乳代謝組在產(chǎn)后5～7 周內發(fā)生變化，足月兒母乳與早產(chǎn)兒母乳的代謝組相似，說明母乳代謝組差異與妊娠時間無關。Zhang Zhiying等[10]系統(tǒng)分析了全世界婦女及各泌乳時期氨基酸濃度，從而確定妊娠時間、地理位置和泌乳階段對母乳總氨基酸和游離氨基酸濃度的影響。翁梅倩等[21]以45 名產(chǎn)婦為研究對象，認為是否足月分娩對母乳中氨基酸含量有顯著影響。關于分娩季節(jié)、分娩方式和產(chǎn)次對人乳氨基酸成分影響的研究較少，很多研究表明，季節(jié)因素對牛乳、羊乳的產(chǎn)奶量、營養(yǎng)成分均有顯著影響[22-24]。本研究分析了分娩季節(jié)對人乳氨基酸含量的影響，研究結果表明分娩季節(jié)可以顯著影響成熟乳階段非必需氨基酸。近年來由于各種原因使剖宮產(chǎn)率、二胎率逐年上升，且剖宮產(chǎn)會導致產(chǎn)婦哺乳延遲，泌乳量減少[25-26]。產(chǎn)次和孕婦年齡、分娩方式相互影響，如二胎母親通常年齡較大且高齡產(chǎn)婦通常需要剖宮產(chǎn)等。分析產(chǎn)次和分娩方式需要結合年齡進行多因素的分析，因此未來將會隨樣本數(shù)據(jù)的補充，進行這部分研究。

母乳中的氨基酸是嬰兒合成體內蛋白質及其生物活性物質的重要來源，滿足嬰兒的生長發(fā)育需求[27-29]。母乳混合蛋白質氨基酸組成研究較少，徐麗[30]、段一凡[19]等的研究中母乳氨基酸含量平均值相對本研究較高，如前人研究中早期成熟乳中酪氨酸含量為（43.19±21.10）mg/g，本研究為（33.37±4.97）mg/g，前人研究數(shù)據(jù)[18,29]波動較大，而本研究氨基酸標準差較小，更加具有代表性。而母乳氨基酸含量平均值的差異可能與多種因素相關，如氨基酸檢測方法、樣品保存方式等。如表7所示，與FAO標準相比，本研究中0～6 月齡母乳氨基酸模式除精氨酸和半胱氨酸，其余氨基酸含量均小于FAO標準。為進一步探討各泌乳階段數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，本研究基于不同泌乳階段母乳氨基酸模式的變異系數(shù)分析各泌乳階段氨基酸組成相對于FAO標準的穩(wěn)定性。如圖3所示，蛋氨酸、甘氨酸、酪氨酸、精氨酸和半胱氨酸變異系數(shù)均高于FAO標準，而其他氨基酸含量的變異系數(shù)均低于FAO標準，即平均值比FAO標準波動范圍小，更具有代表性。

圖3 各泌乳時期混合母乳氨基酸變異系數(shù)Fig. 3 Amino acid dispersion coefficient of mix breast milk in each lactation period

早期成熟乳和晚期成熟乳階段南方和北方、冬春季和夏秋季氨基酸模式變異系數(shù)如圖4所示。北方母乳的蛋氨酸、色氨酸含量的變異系數(shù)較大，南方母乳酪氨酸含量的變異系數(shù)較大，其余南方母乳的氨基酸含量相對穩(wěn)定，平均值更加具有代表性（圖4A）。早期成熟乳中夏秋季賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、酪氨酸變異系數(shù)大于夏秋季，其余氨基酸冬春季更加穩(wěn)定。晚期成熟乳中，夏秋季母乳的蛋氨酸、色氨酸含量較為不穩(wěn)定，其余氨基酸含量在冬春季母乳中相對穩(wěn)定（圖4B）。在地域和季節(jié)影響下，晚期成熟乳相較于早期成熟乳大部分氨基酸變異系數(shù)較小，表明晚期成熟乳混合蛋白質氨基酸含量更加穩(wěn)定。

圖4 不同地域（A）與季節(jié)（B）早期成熟乳和晚期成熟乳氨基酸模式變異系數(shù)Fig. 4 Discrete coefficient of amino acid model in different regions (A)and season (B)

母乳在嬰兒的生長發(fā)育階段具有關鍵作用，健康的母乳氨基酸模式有利于嬰兒的生長發(fā)育，母乳營養(yǎng)成分受到多種因素的影響[31]。本研究探討了地域、產(chǎn)次、分娩方式、出生季度和出生情況對母乳氨基酸模式的影響。通過計算母乳樣本間的歐氏平均距離相似度，獲取了最小和最大母乳樣本，建立了不同泌乳階段氨基酸模式，提出了不同地域與季節(jié)下的母乳氨基酸模式。與FAO標準相比，本研究中母乳氨基酸模式離散程度更低，平均值代表性更強，且南方和北方、冬春季和夏秋季母乳氨基酸模式具有明顯差異，未來可以此模式為基礎進行動物試驗，探討不同母乳氨基酸模式對于生長發(fā)育的影響。本研究為嬰配粉的研發(fā)提供了參考。