張晶晶，李艾黎，程金菊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

近年來，隨著人們生活水平的提高和食品科學(xué)的發(fā)展，將食物中天然存在的生物活性物質(zhì)添加到食品中開發(fā)功能性食品進(jìn)而促進(jìn)人們身心健康已成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而，生物活性物質(zhì)在食品加工和貯藏過程中易受諸多環(huán)境因素（高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、離子強(qiáng)度光照以及氧氣等）的影響、其低水溶性或與食品體系中其他食品成分的不相容性以及在胃腸環(huán)境中的不穩(wěn)定性等均可導(dǎo)致生物活性物質(zhì)的破壞和降解，極大降低了其生物利用率，限制其在食品工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用[1]。為解決這一問題，科研人員利用一些遞送體系對(duì)其進(jìn)行保護(hù)，以期提高其穩(wěn)定性和生物利用率。這些遞送體系包括乳狀液、復(fù)合凝聚物和納米遞送載體等。

美拉德反應(yīng)作為一種綠色的蛋白改性方法，其制備的蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物具有較好的溶解性和較高的穩(wěn)定性，這使得它們?cè)谑称泛歪t(yī)藥工業(yè)中作為生物活性物質(zhì)的遞送載體具有很好的應(yīng)用前景。酪蛋白是被廣泛使用、價(jià)格低廉、天然存在和一般認(rèn)為安全的原料，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的感官品質(zhì)。同時(shí)，酪蛋白中有大量的脯氨酸，阻礙了酪蛋白折疊成團(tuán)，使其結(jié)構(gòu)呈開放式狀態(tài)，是改性研究的良好基材[2]。利用美拉德反應(yīng)生成的酪蛋白-多糖共聚物的功能特性（如環(huán)境穩(wěn)定性、乳化性、溶解性等）相比天然酪蛋白明顯改善，且其作為營(yíng)養(yǎng)素的遞送載體在其包埋、增溶、靶向釋放等方面表現(xiàn)出良好的特性，因而逐漸受到研究者的重視[3]。

本文主要概述了酪蛋白的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白的制備方法以及其在生物活性物質(zhì)遞送體系中的應(yīng)用，探究遞送體系在胃腸模擬消化系統(tǒng)中的靶向釋放，對(duì)美拉德反應(yīng)修飾的酪蛋白在遞送生物活性物質(zhì)方面的合理利用具有指導(dǎo)意義。

1 酪蛋白的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

1.1 酪蛋白的組成與結(jié)構(gòu)

酪蛋白是指牛乳在20 ℃、pH值為4.6時(shí)沉淀的蛋白質(zhì)，呈酸性，是一種含磷蛋白質(zhì)，約占乳蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%。根據(jù)對(duì)游離態(tài)鈣離子的敏感程度，酪蛋白分為4 類，包括αs1-（38%（相對(duì)含量，下同））、αs2-（10%）、β-（34%）和κ-酪蛋白（15%），4種蛋白通過疏水和靜電相互作用共同構(gòu)成酪蛋白。酪蛋白具有核殼模型，αs1-、αs2-、β-酪蛋白的多肽鏈被磷酸鈣的微簇結(jié)構(gòu)部分連接，形成酪蛋白的“核”結(jié)構(gòu)；“殼”結(jié)構(gòu)是由κ-酪蛋白在一個(gè)外部較低密度片段區(qū)域上的“毛發(fā)層”結(jié)構(gòu)所形成，提供靜電相互作用和空間位阻。這種“核殼”結(jié)構(gòu)共同維持著酪蛋白的各種理化性能。

1.2 酪蛋白的基本性質(zhì)

作為乳中的主要蛋白質(zhì)，酪蛋白是由高含量的疏水性或親水性氨基酸殘基片段組成的嵌段共聚物，在乳中以膠束形式存在。酪蛋白膠束是天然的納米遞送系統(tǒng)，其內(nèi)部包含大量的水（平均每克蛋白結(jié)合3～4 g水）[4]，這樣的多孔結(jié)構(gòu)為其引入特定的非酪蛋白分子提供了可行性。因此，目前有研究采用酪蛋白膠束對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行包埋遞送[5-6]。

但天然酪蛋白作為營(yíng)養(yǎng)素載體在應(yīng)用過程中存在溶解度低、pH耐受范圍窄以及膠束再聚集等問題。此外，酪蛋白富含脯氨酸，其結(jié)構(gòu)中的富脯氨酸多肽不利于α-螺旋和β-折疊的形成，并且無二硫鍵，因此，酪蛋白沒有太多規(guī)則的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，被稱為流變性的或者無定形態(tài)的結(jié)構(gòu)，這種開放式的結(jié)構(gòu)使得它們易被胃蛋白酶水解，引起被包埋活性物質(zhì)在強(qiáng)酸性環(huán)境中被破壞或降解，而不能達(dá)到在小腸中靶向釋放的目的。如何通過對(duì)酪蛋白進(jìn)行修飾，提高遞送體系的環(huán)境適應(yīng)性及其在胃中的穩(wěn)定性，增強(qiáng)活性物質(zhì)的腸道吸收是研究的核心問題。通過美拉德反應(yīng)對(duì)酪蛋白進(jìn)行共價(jià)修飾，改善其功能性質(zhì)并應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的包埋遞送是目前的研究熱點(diǎn)之一。

2 美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白的制備方法

美拉德反應(yīng)又稱羰氨反應(yīng)，是涉及氨基酸、蛋白質(zhì)或任何含氮化合物的氨基與還原糖的羰基、醛或酮之間的縮合反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外對(duì)蛋白質(zhì)和糖進(jìn)行美拉德接枝反應(yīng)的基礎(chǔ)方法主要有兩種：干熱法和濕熱法。近年來，也有研究者在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上結(jié)合輔助手段進(jìn)行方法改進(jìn)，如超聲波處理、微波處理、脈沖電場(chǎng)技術(shù)等，這些改進(jìn)方法都已被成功地應(yīng)用到美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備中。

2.1 傳統(tǒng)制備方法

2.1.1 干熱法

干熱法是最先使用的美拉德修飾蛋白質(zhì)的方法，多用于蛋白質(zhì)和多糖的接枝反應(yīng)。1990年，Kato教授首次采用干熱法制備了卵清蛋白-葡聚糖接枝物，其乳化性在pH值為3和10時(shí)得到了極大改善，可作為大分子乳化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中[7]。隨后，用干熱法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行美拉德反應(yīng)的修飾受到越來越多人的關(guān)注，并在醫(yī)藥[8]、材料[9]、化妝品[10]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

干熱法非常適合于蛋白質(zhì)與多糖之間的美拉德反應(yīng)，一方面是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在水溶液中受到多種分子間作用力及疏水相互作用的影響，許多反應(yīng)基團(tuán)被包埋在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)內(nèi)部；另一方面，多糖立體效應(yīng)較強(qiáng)，其化學(xué)反應(yīng)具有較強(qiáng)的取向性[11]。此外，干法美拉德改性技術(shù)生產(chǎn)成本低、加工技術(shù)簡(jiǎn)單且反應(yīng)條件溫和，使得美拉德反應(yīng)在食品修飾過程中更容易控制。然而，基于目前的報(bào)道，干熱法制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)間普遍較長(zhǎng)，通常為幾天到幾周。例如Spotti等[12]通過干熱法制備乳清蛋白-葡聚糖美拉德產(chǎn)物時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為5 d；Wang Yongquan等[13]在80 ℃、相對(duì)濕度為79%的條件下反應(yīng)9 d制備了脫酰胺小麥面筋蛋白-麥芽糊精接枝物。而酪蛋白不需要通過變性暴露其活性氨基基團(tuán)，從而極大縮短了達(dá)到理想反應(yīng)程度的時(shí)間。Corzo-Martínez等[14]在水分活度0.67、50 ℃條件下反應(yīng)4 h制備了酪蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，且顯著增強(qiáng)了酪蛋白的發(fā)泡性，但酪蛋白本身溶解性較差，使其在工業(yè)上的應(yīng)用受到了極大的限制，通過干熱法對(duì)酪蛋白進(jìn)行美拉德反應(yīng)修飾極大提高了其溶解性，其他功能性質(zhì)也在一定程度上有所改善。

Fechner等[15]利用干法反應(yīng)，在相對(duì)濕度79%、60 ℃條件下制備的酪蛋白酸鈉-麥芽糊精美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以穩(wěn)定水包油型乳狀液，使乳狀液的粒徑更小和更均一，且其在酸性條件下能夠降低VB12的釋放，是一種較穩(wěn)定的乳化劑。Corzo-Martínez等[16]發(fā)現(xiàn)酪蛋白與半乳糖、乳糖和葡聚糖反應(yīng)時(shí)，黏度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并且與半乳糖在50 ℃反應(yīng)48 h時(shí)黏度達(dá)到最高。張雅婷[17]研究了酪蛋白和葡聚糖在相對(duì)濕度78%、60 ℃下制備的美拉德產(chǎn)物，葡聚糖提供的空間位阻效應(yīng)使其在pH 2～7范圍內(nèi)均可保持結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定，并且明顯改善了酪蛋白等電點(diǎn)處的乳化活性。高威[18]在研究酪蛋白與葡萄糖和麥芽糖接枝物的凝膠性時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)美拉德修飾的酪蛋白凝膠強(qiáng)度是未修飾酪蛋白的1.43 倍。此外，酪蛋白經(jīng)修飾后，其溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、持水性和黏度都有不同程度的提高[18]。

雖然干熱法制得的酪蛋白-多糖復(fù)合物的溶解性、乳化性、穩(wěn)定性等均得到了一定程度的提高，但酪蛋白-多糖復(fù)合反應(yīng)的速度極慢，且蛋白質(zhì)與多糖的空間結(jié)構(gòu)對(duì)共價(jià)反應(yīng)的影響很大。另外，反應(yīng)條件的控制也很嚴(yán)格且容易生成不溶性的大分子。因此，干熱法在實(shí)際應(yīng)用過程中受到了極大的限制。

2.1.2 濕熱法

濕熱法一般用于蛋白質(zhì)與單糖或雙糖的接枝反應(yīng)，耗時(shí)較短，一般為幾到十幾個(gè)小時(shí)，當(dāng)反應(yīng)溫度≤90 ℃時(shí)反應(yīng)速率緩慢，≥100 ℃時(shí)反應(yīng)速率較快。Brands等[19]將酪蛋白和二糖（乳糖、乳果糖、麥芽糖或麥芽酮糖）在pH 6.8、120 ℃油浴下反應(yīng)60 min，建立了酪蛋白-二糖美拉德反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型，并使用多響應(yīng)建模進(jìn)行了廣泛的測(cè)試。王海霞[20]在反應(yīng)溫度為100 ℃、pH值為9.0的條件下僅需3 h即制備了牦牛乳酪蛋白-葡萄糖接枝物，研究發(fā)現(xiàn)，美拉德修飾在一定程度上改善了牦牛乳酪蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性、發(fā)泡性和泡沫穩(wěn)定性、吸油性以及抗氧化活性。

雖然濕熱法較干熱法在反應(yīng)速度上有所提高，但從目前的報(bào)道看，濕熱法主要集中在結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)和小分子糖之間的反應(yīng)。近年來，Meng Jun等[21]分別通過干熱法和濕熱法制備酪蛋白-葡聚糖納米顆粒，研究其理化性質(zhì)以及對(duì)姜黃素的封裝能力；原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與濕熱法相比，干熱法制備的納米顆粒粒徑更小且分布更均勻，并且有更好的熱穩(wěn)定性、胃腸道穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。由此可見，濕熱法制備的酪蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物也存在一定的缺陷性和局限性。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于通過新興加工技術(shù)彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法中的不足，以期尋找有效促進(jìn)酪蛋白-糖美拉德反應(yīng)的方法。

2.2 新興加工技術(shù)

2.2.1 超聲波技術(shù)

超聲波是指頻率高于20 kHz的聲波，分為低強(qiáng)度超聲波（0.1～1 MHz、≤1 W/cm2）和高強(qiáng)度超聲波（≤0.1 MHz、10～1 000 W/cm2）兩類。其中高強(qiáng)度超聲技術(shù)在食品工業(yè)中研究廣泛，其特有的空穴作用可以引起機(jī)械、物理、化學(xué)和生化作用，從而改變食品的理化性質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于超聲波技術(shù)的應(yīng)用主要集中在超聲降解、蛋白改性、催化反應(yīng)以及化學(xué)聚合等方面，而在蛋白質(zhì)-多糖的美拉德反應(yīng)修飾中的應(yīng)用報(bào)道卻較為少見?？茖W(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，超聲波在媒介中傳播時(shí)，會(huì)產(chǎn)生交替循環(huán)的波型運(yùn)動(dòng)（壓縮波和稀疏波），在循環(huán)過程中，由于壓力變化會(huì)形成空穴氣泡且氣泡會(huì)隨著循環(huán)過程不斷變大，達(dá)到臨界大小，最終劇烈崩潰。而氣泡破裂時(shí)會(huì)釋放巨大能量到周圍環(huán)境中，這為誘發(fā)美拉德反應(yīng)提供了條件[22]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，超聲對(duì)蛋白質(zhì)糖基化程度的改善效果顯著，與傳統(tǒng)的加熱相比，超聲輔助美拉德反應(yīng)可提高接枝反應(yīng)效率以及接枝產(chǎn)物的溶解性、乳化性和表面疏水性[23]。由于活性氨基酸位點(diǎn)通常隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)-多糖之間的共價(jià)作用較弱。而高強(qiáng)度超聲波產(chǎn)生的能量可以加速蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開和肽鍵斷裂，并使一些疏水性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面，從而增加了蛋白質(zhì)和多糖之間反應(yīng)基團(tuán)的碰撞，提高接枝度[24]。夏琪娜[25]在研究超聲預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)酪蛋白反應(yīng)進(jìn)程的影響中發(fā)現(xiàn)，超聲預(yù)處理后的酪蛋白-葡萄糖接枝物的接枝度、中間產(chǎn)物含量、褐變程度以及抗氧化性均顯著高于未超聲處理組。此外，超聲組酪蛋白的紫外吸收程度加強(qiáng)，說明其分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)逐漸暴露，內(nèi)源熒光光譜表明蛋白分子結(jié)構(gòu)變得松散，圓二色光譜表明超聲組酪蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得無序，蛋白分子趨于舒展。葛偉[26]研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)超聲處理的酪蛋白-葡萄糖接枝物相比，超聲預(yù)處理接枝物的抗氧化性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性、凝膠強(qiáng)度和持水性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性均在一定程度上有所改善。

超聲波技術(shù)作為一種快速、無毒且節(jié)能的新興技術(shù)，能有效改善酪蛋白美拉德產(chǎn)物的功能性質(zhì)。而對(duì)于超聲技術(shù)促進(jìn)美拉德反應(yīng)機(jī)理的闡述卻較為籠統(tǒng)，因此，構(gòu)建反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，結(jié)合產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)表征，探究超聲加速美拉德反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理還有待深入研究，從而實(shí)現(xiàn)美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白的定向調(diào)控。另外，過高的超聲功率可能會(huì)產(chǎn)生丙烯酰胺和5-羥甲基糠醛等有害成分，因此，超聲波技術(shù)帶來的負(fù)面影響也需要正確評(píng)估。

2.2.2 微波技術(shù)

微波是一種波長(zhǎng)為1 mm～1 m、頻率為0.3～300 GHz的電磁波。微波技術(shù)因其高節(jié)能等優(yōu)勢(shì)已廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，包括輔助提取、加熱、干燥、巴氏殺菌和食品保鮮等[27]。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者研究了微波場(chǎng)中的美拉德反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，微波加熱可導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂、疏水性基團(tuán)暴露，有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開。此外，微波處理還可以通過解開碳鏈間的纏結(jié)促進(jìn)多糖分子的重排及其相互作用[28]。微波引起的這些變化有利于美拉德反應(yīng)在溫和的條件下高效進(jìn)行。研究表明，影響蛋白-多糖共價(jià)反應(yīng)及產(chǎn)物性能的微波條件主要是微波功率和反應(yīng)時(shí)間。Ge Huacai等[29]研究了微波功率對(duì)丙烯酸接枝殼聚糖反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，丙烯酸-殼聚糖的接枝度和接枝效率均隨著微波功率的增大而顯著升高，且使接枝產(chǎn)物達(dá)到相同的吸水性，傳統(tǒng)干熱法需240 min，而微波輻射（120 W）僅需30 min，反應(yīng)速率提高了8 倍。另外，微波加熱能顯著改善酪蛋白的功能性質(zhì)。畢偉偉[30]研究結(jié)果表明微波加熱可以穩(wěn)定地促進(jìn)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，與水浴加熱相比，微波加熱的酪蛋白二硫鍵含量變化顯著、熒光強(qiáng)度增加，β-轉(zhuǎn)角含量上升。此外，微波加熱可顯著提高酪蛋白-β-環(huán)糊精的凝膠性、持水性、表觀黏度、起泡性和泡沫穩(wěn)定性以及自由基清除率。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，微波場(chǎng)內(nèi)酪蛋白-乳糖體系的流變性發(fā)生了改變，酪蛋白在等電點(diǎn)處的溶解度有所改善，且其在消化過程中抗氧化活性顯著提高[31]。

然而，微波加熱的不均勻性是微波技術(shù)的短板，可能會(huì)影響食品質(zhì)量，因此，應(yīng)繼續(xù)對(duì)該領(lǐng)域深入研究，以期避免微波產(chǎn)生的冷點(diǎn)和熱點(diǎn)。

2.2.3 脈沖電場(chǎng)技術(shù)

脈沖電場(chǎng)技術(shù)是一種新興的非熱食品加工技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于效率高、能耗小、副產(chǎn)物少，對(duì)環(huán)境友好且能夠充分保護(hù)物料的風(fēng)味特征等[32]。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，脈沖電場(chǎng)技術(shù)在增強(qiáng)蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用中發(fā)揮著重要作用[33]。有研究者認(rèn)為，蛋白質(zhì)-多糖混合溶液經(jīng)脈沖電場(chǎng)技術(shù)處理后能夠降低化學(xué)反應(yīng)的活化能[34]，電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的自由基會(huì)使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)部分展開，疏水性基團(tuán)和自由巰基暴露[35]。同時(shí)，脈沖電場(chǎng)提供的電能可使多糖鏈分解[36]。這些變化有利于增加反應(yīng)分子之間的碰撞概率，促進(jìn)蛋白質(zhì)和多糖之間的共價(jià)結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，利用脈沖電場(chǎng)技術(shù)（總處理時(shí)間7.35 ms、電場(chǎng)強(qiáng)度范圍10～30 kV）可成功制備牛血清白蛋白-葡聚糖美拉德產(chǎn)物，且其功能特性如溶解性、乳化活性、抗氧化性以及乳液穩(wěn)定性都得到了顯著改善[37]。

然而，國(guó)內(nèi)外關(guān)于脈沖電場(chǎng)技術(shù)輔助美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)還鮮有報(bào)道，但基于相關(guān)理論，此種方法對(duì)酪蛋白的美拉德反應(yīng)修飾是非?？尚械?。此外，脈沖電場(chǎng)技術(shù)還不能大規(guī)模地應(yīng)用于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備中，且脈沖電場(chǎng)技術(shù)處理的臨界強(qiáng)度和熱效應(yīng)之間的關(guān)系還沒有得到充分的研究論證，還需進(jìn)一步的研究。

2.2.4 靜電紡絲技術(shù)

靜電紡絲是一種利用靜電作用力將聚合物溶液或者熔體轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒓{米纖維的技術(shù)。在靜電紡絲過程中，蛋白質(zhì)-多糖混合射流通過電場(chǎng)時(shí)，電荷在其表面積聚。這些不均勻分布的電荷會(huì)引起射流的無定向噴射，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和多糖分子之間的重新排列和更為緊密的接觸。溶劑經(jīng)加熱后蒸發(fā)，蛋白質(zhì)和多糖緊密包裹成具有高比表面積和多孔性的干纖維[38]。這些特性有助于蛋白質(zhì)和多糖在較為溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，從而避免不期望的褐變發(fā)生。

靜電紡絲技術(shù)已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備方法中[39]，Kutzli等[40]采用靜電紡絲技術(shù)結(jié)合加熱處理制備乳清分離蛋白-麥芽糊精接枝物，并獲得了最高產(chǎn)率（（44.52±7.46）%）。此外，靜電紡絲輔助美拉德反應(yīng)制備的接枝物在其功能特性上也得到了極大地改善。Kutzli等[41]通過靜電紡絲法制備豌豆分離蛋白-麥芽糊精纖維，并在加熱時(shí)間12 h/24 h、加熱溫度65 ℃/70 ℃、相對(duì)濕度75%的條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，研究結(jié)果表明，較高的溫度和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間會(huì)促進(jìn)美拉德反應(yīng)；并且與未加熱的纖維相比，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有更高的蛋白溶解度。這種方法改善了蛋白的功能特性。因此將靜電紡絲技術(shù)與傳統(tǒng)干熱法相結(jié)合，可使美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的商業(yè)化制備成為可能。然而，國(guó)內(nèi)外關(guān)于靜電紡絲技術(shù)輔助美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)還鮮有報(bào)道，因此其對(duì)酪蛋白的功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征還有待深入研究。

2.2.5 高靜水壓技術(shù)

高靜水壓處理技術(shù)作為一種新型的非熱食品加工技術(shù)，普遍應(yīng)用于果蔬、乳制品及肉制品加工中，且主要用于食品的殺菌[42]、保藏[43]以及生物活性成分的提取[44]等。但國(guó)內(nèi)鮮有研究報(bào)道高靜水壓在蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合方面的應(yīng)用，國(guó)外的一些學(xué)者卻已逐步將高靜水壓技術(shù)運(yùn)用到蛋白-多糖的美拉德反應(yīng)中，以提高其反應(yīng)速率以及蛋白質(zhì)的功能特性。

Ma Xiaojuan等[45]在研究不同氨基酸-糖模型體系中高靜水壓技術(shù)對(duì)美拉德反應(yīng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在賴氨酸-糖模型體系中，Amadori化合物的降解速率降低，而在精氨酸-糖模型體系中，其降解速率增加；此外，研究還表明除了高靜水壓對(duì)美拉德反應(yīng)造成的影響外，高溫也能加速美拉德反應(yīng)的發(fā)生。Tian Yuting等[46]研究了高靜水壓處理對(duì)紅曲米酒在陶器貯存期間揮發(fā)性成分的變化和感官品質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，高靜水壓處理可顯著降低酒中雜醇類的含量并保持內(nèi)酯的濃度，貯存18個(gè)月后，經(jīng)高靜水壓處理的酒總糖分下降更快，游離氨基酸含量更低，酮含量更高，這些變化可歸因于高靜水壓處理加快了體系中美拉德反應(yīng)和氧化反應(yīng)的反生。Santos等[47]在一項(xiàng)類似的研究中同樣得出了高靜水壓處理可加速釀酒體系中美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

目前，關(guān)于高靜水壓法對(duì)蛋白-多糖共價(jià)復(fù)合反應(yīng)的影響的研究還略顯不足，關(guān)于高靜水壓的工藝條件、壓力對(duì)不同種類的蛋白與多糖共價(jià)反應(yīng)的影響，以及壓力對(duì)共價(jià)復(fù)合產(chǎn)物性質(zhì)的影響等還需要做進(jìn)一步深入的研究。

3 美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白作為遞送載體的類型

作為一種綠色安全的蛋白改性方法，美拉德反應(yīng)不僅能改善蛋白質(zhì)的功能特性，還賦予了食品誘人的色澤和濃郁的芳香。因此，研究人員將蛋白質(zhì)與糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物作為食品級(jí)遞送系統(tǒng)的新型載體來封裝、保護(hù)和控制生物活性物質(zhì)的釋放，以期提高其生物利用率。下文介紹了基于美拉德反應(yīng)修飾的酪蛋白作為遞送載體的不同類型，包括乳狀液、復(fù)合凝聚物以及納米遞送載體。

3.1 乳狀液

乳狀液是一種以水包油或油包水形式穩(wěn)定分散相的功能因子傳遞體系，可將疏水性生物活性物質(zhì)及其他功能因子包裹在乳狀液油滴中，從而提高其在水溶液中的穩(wěn)定性和溶解度[48]。以蛋白質(zhì)為載體制備的乳狀液體系易受到pH值、離子強(qiáng)度、溫度以及消化酶等因素的影響而發(fā)生聚集以及相分離，此外，乳狀液是熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，往往會(huì)由于乳析、絮凝和聚合等不穩(wěn)定現(xiàn)象導(dǎo)致破乳，不能完全滿足有效載體體系的要求[49]。所以必須用其他方法改善乳狀液的性能。乳狀液的穩(wěn)定性與乳化劑有關(guān)，乳化劑可以吸附在油滴表面形成界面層[50]。酪蛋白作為一種大分子乳化劑，通過美拉德反應(yīng)將蛋白質(zhì)和多糖共價(jià)連接在一起形成新的乳化劑，其界面膜及其所帶的靜電荷間排斥作用和空間位阻共同使得熱力學(xué)不穩(wěn)定的兩相混合體系具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性[51]，以此可解決上述問題。

越來越多的研究已經(jīng)證實(shí)，通過美拉德反應(yīng)制備的酪蛋白-多糖共聚物作為乳化劑可明顯改善乳狀液的物理化學(xué)穩(wěn)定性[52]。Wang Lixin等[53]在干熱條件下制備了由酪蛋白-羧甲基殼聚糖共聚物穩(wěn)定的水包油乳狀液，研究發(fā)現(xiàn)，與單一酪蛋白穩(wěn)定的乳狀液相比，共聚物穩(wěn)定的乳狀液具有更高的凍融穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及貯藏穩(wěn)定性。O’regan等[54]研究了VB12在由酪蛋白酸鈉-麥芽糊精接枝物穩(wěn)定的雙重乳液中的穩(wěn)定性和釋放特性，與純蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液相比，美拉德改性復(fù)合物由于可以在油滴周圍形成致密的保護(hù)膜，減少水相和油滴的接觸，防止油滴聚結(jié)而具有更小的乳液粒徑和更穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。此外，該遞送體系在生物活性物質(zhì)的生物利用度和控釋方面均有所提升，使其成為有前景的生物活性物質(zhì)遞送載體[55]。Gumus等[56]將葉黃素包埋于由酪蛋白和葡萄糖經(jīng)美拉德反應(yīng)穩(wěn)定的乳狀液中，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定乳液與單純的酪蛋白穩(wěn)定的乳狀液相比具有更高的pH穩(wěn)定性，這可歸因于葡聚糖產(chǎn)生的空間位阻和靜電排斥作用防止油滴聚集；體外胃腸模擬實(shí)驗(yàn)表明，美拉德改性酪蛋白乳液能有效抵抗胃蛋白酶的消化。

由此可見，以美拉德酪蛋白-多糖共聚物作為乳化劑形成的乳狀液具有更高的物理化學(xué)穩(wěn)定性，在制備功能性飲料方面具有良好的應(yīng)用前景。此外，當(dāng)酪蛋白與多糖通過美拉德反應(yīng)形成共價(jià)復(fù)合物時(shí)，多糖阻礙了胃蛋白酶對(duì)酪蛋白的水解，從而使其在胃中具有較高的穩(wěn)定性[57]，這使得此種遞送載體可用于設(shè)計(jì)腸道特異性藥物的傳遞，從而預(yù)防或治療腸道疾病。

3.2 復(fù)合凝聚物

復(fù)合凝聚法是一種新興的包埋技術(shù)，是指帶相反電荷聚電解質(zhì)間發(fā)生去溶劑化而導(dǎo)致相分離，最后形成了兩相體系，即富含去電解質(zhì)的凝聚相和與之平衡的稀釋相[58]。復(fù)凝聚反應(yīng)形成的可溶性復(fù)合物或者復(fù)聚物作為活性物質(zhì)的遞送載體已成功應(yīng)用于β-胡蘿卜素[59]、功能性油脂[60]以及益生菌[61]等的包埋，并顯示出了高包封率和控釋能力[62]，而廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)藥領(lǐng)域[63]。

值得注意的是，蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合凝聚物主要依靠靜電相互作用、氫鍵、疏水鍵和空間位阻等非共價(jià)鍵相互作用形成[64]，這些作用力又容易受到離子強(qiáng)度、溫度、電荷密度、pH值以及體系濃度等條件的影響，導(dǎo)致復(fù)凝物出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，從而影響體系穩(wěn)定性[65]。目前常用交聯(lián)劑的交聯(lián)作用通過表面修飾降低顆粒的表面能，從而減少顆粒的聚集[66]。但是化學(xué)交聯(lián)劑（如戊二醛）存在一定的安全性問題，而酶類（如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）對(duì)pH值、底物和溫度有嚴(yán)格的要求，都不適合食品工業(yè)化的生產(chǎn)[67]。近年來，由蛋白質(zhì)和糖通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的共價(jià)接枝復(fù)合物通過增加空間排斥作用穩(wěn)定復(fù)合凝聚體，進(jìn)而用于包封活性物質(zhì)，獲得了越來越多的關(guān)注[68]。Ifeduba等[69]將硬脂酸大豆油包埋于經(jīng)美拉德改性的明膠-阿拉伯膠復(fù)合凝聚體中，研究發(fā)現(xiàn)，與未改性體系相比，美拉德改性的微膠囊表現(xiàn)出更高的膠體穩(wěn)定性和抗氧化能力。研究者還將其應(yīng)用于酸奶中，在80 ℃下加熱30 min時(shí)，美拉德改性的微膠囊表現(xiàn)出了更高的熱穩(wěn)定性，且其在冷藏14 d內(nèi)也表現(xiàn)出了更高的氧化穩(wěn)定性[69]。美拉德改性的微膠囊體系氧化穩(wěn)定性的提高可能是由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以通過螯合金屬離子、自由基鏈和過氧化氫的分解、活性氧的清除，顯示出優(yōu)異的抗氧化能力。Zhou Huihui等[70]制備了由明膠-葡聚糖美拉德接枝物穩(wěn)定的復(fù)合凝聚體包埋茶多酚，平均粒徑為86 nm，體外胃腸模擬實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出了其對(duì)茶多酚的高負(fù)載率和緩釋作用。此外，茶多酚對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有抗腫瘤活性，噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，游離茶多酚與復(fù)合凝聚體包埋的茶多酚相比，細(xì)胞活性無顯著差異，這為開發(fā)茶多酚的遞送體系治療乳腺癌提供了科學(xué)的指導(dǎo)方法[70]。

由此可見，基于美拉德反應(yīng)的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合凝聚物可成功應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的遞送載體中，并能顯著提高遞送體系的穩(wěn)定性，在包埋益生菌和功能性油脂方面顯現(xiàn)出了極大優(yōu)勢(shì)，可作為功能性食品的開發(fā)應(yīng)用于食品工業(yè)中。此外，還可作為藥物遞送載體應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。然而，美拉德反應(yīng)修飾的酪蛋白基復(fù)合凝聚物的功能性質(zhì)、結(jié)構(gòu)表征以及在生物活性物質(zhì)的遞送方面的報(bào)道較少，還有待進(jìn)一步深入研究。

3.3 納米遞送載體

納米遞送載體是指利用機(jī)械或化學(xué)方法制備的平均粒徑為10～1 000 nm的遞送體系，有研究表明，運(yùn)用納米尺度的載體遞送生物活性物質(zhì)，不僅可以在食品加工、貯藏過程中提高生物活性物質(zhì)在氧氣、pH值、酶解等極端條件下的穩(wěn)定性，還可以更有效地調(diào)控被包埋的生物活性物質(zhì)的溶解性、穩(wěn)定性、釋放速率以及在消化道中的滯留情況[71]，以及影響載體的消化特性，如胃蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解和脂肪酶對(duì)脂質(zhì)的水解等。因此，納米載體遞送是生物活性物質(zhì)理想的生物效價(jià)增效途徑[72]。而遞送載體對(duì)生物活性物質(zhì)的遞送特性以及對(duì)其生物效價(jià)的增效作用是與載體的尺寸大小密切相關(guān)的，當(dāng)載體的粒徑小于500 nm，尤其是小于100 nm時(shí)，可顯著地提高被遞送生物活性物質(zhì)的生物效價(jià)，而且當(dāng)載體粒徑為10～100 nm時(shí)，納米載體可通過上皮細(xì)胞滲透、腸細(xì)胞和M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等方式直接進(jìn)入血液循環(huán)中，從而更有效地提高活性物質(zhì)的生物效價(jià)[73]。

酪蛋白作為一種天然生物大分子，綠色、安全、生物相容性好等特征賦予其得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，使其作為營(yíng)養(yǎng)素納米載體的研究日益受到關(guān)注。Wei Xuelin等[74]成功制備了負(fù)載酚類物質(zhì)咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）的酪蛋白納米靶向給藥系統(tǒng)，其粒徑分布均勻（（211.0±5.1）nm），并在室溫下貯存4 周后保持穩(wěn)定；通過傅里葉變化紅外光譜和圓二色光譜分析證實(shí)了CAPE通過疏水作用與酪蛋白結(jié)合。天然酪蛋白在等電點(diǎn)附近pH值條件下溶解性和乳化性較差，且易受胃蛋白酶消化，目前美拉德反應(yīng)是蛋白改性中最為理想的方法之一。

一些具有生物活性的抗氧化組分包括類胡蘿卜素、多酚、黃酮類等可預(yù)防心血管疾病、抗炎、抗癌和清除自由基等多種生物學(xué)功能，但其極易氧化，研究表明，可通過酪蛋白基納米遞送載體包埋從而提高其抗氧化性及生物利用率[75]。Sun Xianbao等[76]通過美拉德反應(yīng)制備酪蛋白-麥芽糊精接枝物，并成功包埋原花青素（procyanidins，PAs），得到了酪蛋白-麥芽糊精PAs納米顆粒（casein-maltodextrin-PAs nanoparticles，CMPN），其粒徑和包封率分別為（158.69±1.70）nm和（93.48±0.20）%。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)陽離子自由基清除實(shí)驗(yàn)表明，CMPNs的體外抗氧化活性在28 d貯藏期和不同溫度條件下（40、60 ℃和80 ℃）均保持良好的穩(wěn)定性。細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力的分析也證實(shí)了CMPNs抗氧化保護(hù)作用的存在。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，與游離PAs的快速釋放（釋放率80%）相比，包埋后的PAs1在20 min后的釋放率僅為30%，表明經(jīng)納米載體包埋的PAs在很大程度上防止了胃蛋白酶的降解，這可能是由于糖基化蛋白質(zhì)較大的空間位阻覆蓋了蛋白質(zhì)上的酶水解位點(diǎn)，提高了其穩(wěn)定性和生物利用率[76]。Xue Jin等[77]將表沒食子兒茶素沒食子酸脂（epigallocatechin gallate，EGCG）包埋于美拉德反應(yīng)修飾的酪蛋白中，發(fā)現(xiàn)修飾后的酪蛋白對(duì)EGCG有較強(qiáng)的包封和保留能力，能有效保護(hù)EGCG在堿性pH值下的降解，并在腸液中表現(xiàn)出緩慢而持續(xù)的釋放。

以上研究結(jié)果表明，經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾的酪蛋白作為納米遞送載體是生物活性物質(zhì)理想的生物效價(jià)增效途徑。

4 美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白運(yùn)載體系在消化系統(tǒng)中的靶向釋放

有研究已證實(shí)，遞送載體包埋生物活性物質(zhì)能有效提高其穩(wěn)定性，保護(hù)被包埋物質(zhì)免受光照、溫度、pH值、離子強(qiáng)度等環(huán)境因素的影響而降解[78]。但由于生物活性物質(zhì)的口服生物利用度低，而使其潛在的促進(jìn)健康作用并未完全實(shí)現(xiàn)，因此，如何提高各種生物活性物質(zhì)的生物利用度，充分發(fā)揮其生理功能已成為研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)有研究人員設(shè)計(jì)了一些遞送體系提高生物利用率，主要通過保護(hù)被包埋物質(zhì)不被胃蛋白酶水解，并在腸道pH條件下實(shí)現(xiàn)控制釋放以及實(shí)現(xiàn)靶向釋放，從而改善生物活性物質(zhì)的口服吸收效果[79]。

4.1 胃

食物在經(jīng)過口腔的初步消化后，通過食管到達(dá)胃，并與胃液混合。鹽酸、胃蛋白酶原和電解質(zhì)等是胃液的主要成分。以蛋白質(zhì)為乳化劑的乳狀液在胃消化過程中通常會(huì)由于pH值變化導(dǎo)致電荷損失、離子強(qiáng)度增強(qiáng)發(fā)生靜電屏蔽以及胃蛋白酶的水解作用，導(dǎo)致遞送體系發(fā)生顯著變化[80]。美拉德改性復(fù)合物相比單一蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳狀液相比，其在胃消化過程中通常具有更高的穩(wěn)定性。Davidov-Pardo等[81]將白藜蘆醇包埋于酪蛋白酸鈉-葡聚糖美拉德復(fù)合物納米顆粒中，在模擬胃液條件下，不含復(fù)合物的納米顆粒懸浮液的粒徑顯著增加（＞1 000 nm），而改性復(fù)合物納米顆粒懸浮液的粒徑增加較?。s為530 nm），這可能是由于葡聚糖產(chǎn)生了較大的空間位阻以及美拉德修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)上的酶水解位點(diǎn)減少，有效阻止了顆粒的絮凝和聚結(jié)，從而提高了美拉德改性復(fù)合物穩(wěn)定的納米顆粒在胃消化過程中的穩(wěn)定性。

Qiu Jiahuan等[82]通過干法美拉德反應(yīng)制備酪蛋白-卡拉膠納米膠囊包埋辣椒紅色素（paprika oleoresin，PRP），在胃液中孵育3 h后，未經(jīng)美拉德反應(yīng)的物理混合物的平均粒徑和聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）值由513.4 nm和0.236增大到1 025.6 nm和1.000，而改性復(fù)合物的平均粒徑和PDI值分別由306.8 nm和0.153增加至575.9 nm和0.460，且其在孵育0.5 h后的釋放速率分別為56.2%和13.6%，由此可見，改性復(fù)合物納米膠囊在模擬胃液中具有相對(duì)較好的穩(wěn)定性，并且PRP仍能與美拉德修飾產(chǎn)物有效結(jié)合，維持分散狀態(tài)，從而有利于其進(jìn)入腸道完成釋放與消化。這可歸因于蛋白酶水解蛋白或多肽時(shí)，其傾向于剪切疏水氨基酸之間的肽鍵，即κ-酪蛋白肽鍵斷裂，這破壞了物理混合物中酪蛋白結(jié)構(gòu)，酪蛋白之間聚集沉淀，導(dǎo)致物理混合物中PRP的快速釋放并且累計(jì)釋放率較大。而酪蛋白共聚物納米粒將疏水氨基酸保護(hù)在內(nèi)核區(qū)域，使表面形成了具有保護(hù)作用的界面層，防止了胃蛋白酶和低pH值對(duì)其剪切和破壞，另外，PRP被包埋在疏水內(nèi)核中，其空間位阻和范德華力也是阻止胃蛋白酶對(duì)PRP作用的重要因素，使得PRP不完全釋放，從而保持結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定[82]。

4.2 小腸

經(jīng)胃消化后的食糜進(jìn)入小腸后與腸液混合，小腸液呈弱堿性，pH值約為8～9，主要包括胰液和膽汁。小腸是食物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所。

在Qiu Jiahuan等[82]的研究中，模擬小腸消化后，酪蛋白-卡拉膠美拉德反應(yīng)改性復(fù)合物納米膠囊包埋PRP的釋放量和釋放速率均略高于混合物，這說明共聚物的形成及包埋并未對(duì)在腸液中PRP的釋放產(chǎn)生影響。Larissa等[83]分別制備了酪蛋白酸鈉-麥芽糊精和酪蛋白酸鈉-葡萄糖美拉德改性復(fù)合物包埋白藜蘆醇，在模擬腸液條件下，白藜蘆醇的釋放量在3 h內(nèi)達(dá)到了90%。胰蛋白酶首先作用于共聚物表面的κ-酪蛋白，將其位于116～117位的賴氨酸殘基的羧基端肽鍵切斷后形成不同分子質(zhì)量的多肽，導(dǎo)致共聚物結(jié)構(gòu)被破壞，最后共聚物被完全水解，核內(nèi)生物活性物質(zhì)得到釋放。由此可見，共聚物表面所接枝的多糖形成的界面層對(duì)胰復(fù)合酶基本無阻礙作用。

美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白改性復(fù)合物作為生物活性物質(zhì)的遞送體系，能在消化過程中防止或減少生物活性成分的降解，并將其充分轉(zhuǎn)運(yùn)和溶解到混合膠束中以供小腸吸收。由此，其可作為理想的生物活性載體，有效提高生物活性物質(zhì)的生物利用度。

5 結(jié) 語

本文綜述美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白的制備方法，在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上加以新興技術(shù)（超聲波、微波、脈沖電場(chǎng)、靜電紡絲以及高靜水壓技術(shù)）的輔助，能夠?qū)崿F(xiàn)制備效率的提高和功能性質(zhì)的改善；美拉德反應(yīng)制備的酪蛋白-多糖共價(jià)復(fù)合物作為生物活性物質(zhì)的遞送載體類型，包括乳狀液、復(fù)合凝聚物及納米遞送載體；探究遞送體系在胃腸模擬環(huán)境中的變化。大量研究表明，美拉德反應(yīng)修飾酪蛋白作為生物活性物質(zhì)的遞送載體顯著提高了其環(huán)境穩(wěn)定性和生物利用率，使其能廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)化的生產(chǎn)中。然而，對(duì)于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物功能特性的驗(yàn)證、控制反應(yīng)過程中有害物質(zhì)和晚期產(chǎn)物的生成以及選擇較為合適的美拉德產(chǎn)物設(shè)計(jì)不同生物活性物質(zhì)的遞送載體還需進(jìn)一步研究。