孫巧玲，袁 欣，王 玉

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性傳染性疾病。根據(jù)2020年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，結(jié)核病是全球十大死亡原因之一[1]，而耐藥結(jié)核病、艾滋病以及新冠肺炎的合并感染使得結(jié)核病更難防治[2]。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)是重要的專職抗原提呈細(xì)胞，能夠激活幼稚T細(xì)胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3]。當(dāng)MTB感染時(shí)，DC通過(guò)吞噬、抗原提呈、細(xì)胞因子分泌等功能[4]，參與宿主炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[5]。

卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是牛結(jié)核分枝桿菌減毒活菌株[6]，是目前唯一公認(rèn)的結(jié)核疫苗[7]。但BCG的免疫效果，尤其是對(duì)成人結(jié)核病的免疫保護(hù)效果并不理想[8-9]，這一原因可能與CD8+T細(xì)胞活性減弱和免疫記憶持續(xù)時(shí)間受限有關(guān)[10-11]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，BCG表面肽聚糖和阿拉伯半乳糖等病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)能與DC模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)結(jié)合，刺激DC活化和分泌細(xì)胞因子[8,12-15]。而B(niǎo)CG也能調(diào)控DC功能，如BCG Hip蛋白缺失可促進(jìn)DC活化，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠肺內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答[16]。至今為止，BCG胞內(nèi)免疫機(jī)制仍未完全闡明。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，以小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(DC2.4)為模型，研究BCG感染的樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)變化，挖掘與BCG感染相關(guān)的基因，為深入解析BCG的固有免疫機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基以及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Tween-80購(gòu)自重慶川江化學(xué)試劑廠；TRizol試劑、Middlebrook 7H9培養(yǎng)基以及OADC增菌液購(gòu)自美國(guó)BD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)APE x BIO公司；引物由中國(guó)上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株及細(xì)胞 BCG以及DC2.4細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 方 法

1.3.1 BCG培養(yǎng) 將BCG接種于含有0.2%Tween-80和10% OADC增菌液的Middlebrook 7H9培養(yǎng)液中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)3周，3 000 r/min離心10 min，PBS清洗2次后，用2 mL PBS重懸后，測(cè)定OD600，計(jì)算BCG濃度。

1.3.2 DC2.4培養(yǎng)以及BCG感染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞密度為80%左右時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，以1×106個(gè)/mL密度接種于六孔板，次日更換新鮮培養(yǎng)基，加入BCG懸液(MOI=2)，3 h后換液，置于37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h，以未感染的DC2.4細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3.3 樣本制備 1×PBS洗2次后，每孔加入1 mL TRizol試劑，收集樣本，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 用TRizol提取BCG感染DC2.4細(xì)胞24 h后的總RNA，將樣本送至深圳華大基因生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。基于DNBSEQ測(cè)序平臺(tái)，將測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)(Raw data)經(jīng)SOAPnuke軟件對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾獲得純凈序列(Clean reads)，然后用HISAT軟件將得到的Clean reads比對(duì)到參考基因組序列，使用Bowtie2將Clean reads比對(duì)到參考基因序列。以“FDR≤0.05和|log2Fold Change|≥1”作為閾值來(lái)判斷基因差異表達(dá)的顯著性。并使用 R 的基礎(chǔ)函數(shù) phyper(https://stat.ethz.ch/R-manual/R-devel/library/stats/html/Hypergeometric.html)計(jì)算 Pvalue。然后對(duì) Pvalue 進(jìn)行多重檢驗(yàn)較正，校正軟件包為 qvalue(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/qvalue.html)。最后以 Qvalue(corrected Pvalue)≤ 0.05 為閾值，滿足此條件的GO term 定義為在候選基因中顯著富集的 GO term；KEGG Pathway富集分析與GO功能富集分析方法相同。

1.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及分析 為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)挑選了5個(gè)與BCG感染樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)的差異表達(dá)基因(Msr1、Ccl7、Cx3cr1、Cd86和Hmox1)并采用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。引物如表1。反應(yīng)體系為10 L，其中包括2× SYBR Green qPCR Master Mix 5 L, Forward Primer 0.5 L, Reverse Primer 0.5 L，cDNA 1 L, 50×ROX Reference Dye 0.2 L, DEPC水2.8 L。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)用2-ΔΔct法計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-Actin為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物列表Tab.1 Primer sequences for real time quantitative PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用2-ΔΔct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量；采用GraphPad Prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析 對(duì)未感染組和感染組的細(xì)胞樣本進(jìn)行RNA-Seq數(shù)據(jù)分析，共獲得27 235萬(wàn)條讀段(reads)，總長(zhǎng)度約40.86 G堿基。未感染組和感染組的Q20均大于97%，Q30均大于92%(表2)，表明原始數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistical table of sequencing data

2.2 差異表達(dá)基因分析 本實(shí)驗(yàn)采用韋恩圖展示未感染組和感染組基因表達(dá)情況(圖1)：未感染組表達(dá)14 817個(gè)基因，感染組有14 951個(gè)基因。其中兩組共表達(dá)基因14 149個(gè)，可見(jiàn)BCG感染導(dǎo)致DC細(xì)胞基因表達(dá)發(fā)生了變化。再以FDR<0.05(FDR是對(duì)P-value的校正值)且差異倍數(shù)絕對(duì)值≥1(|Log2Fc|≥1)為條件進(jìn)行篩選，由圖2所示，BCG感染后DCs內(nèi)共有27個(gè)差異基因，其中有26個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

圖1 BCG感染DC2.4后差異表達(dá)基因的韋恩圖Fig.1 Differentially expressed gene VEEN map of DC2.4 cells infected with BCG

圖2 BCG感染DC2.4后差異表達(dá)基因的火山圖與散點(diǎn)圖Fig.2 Differentially expressed gene volcano diagram and scatter plot of DC2.4 cells infected with BCG

2.3 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析

2.3.1 差異表達(dá)基因GO功能注釋和富集分析 對(duì)BCG感染DC差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，包括生物學(xué)過(guò)程(biological process)，細(xì)胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)3類。結(jié)果如圖3，將GO富集分析結(jié)果以氣泡圖進(jìn)行展示，氣泡顏色和大小分別代表P值大小和差異表達(dá)基因數(shù)量(圖4)。其中BCG感染DC差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、對(duì)刺激的反應(yīng)以及免疫系統(tǒng)過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程；細(xì)胞組成富集結(jié)果表明差異基因主要分布在細(xì)胞器、細(xì)胞膜等細(xì)胞部位；分子功能的富集結(jié)果顯示，差異基因主要通過(guò)影響結(jié)合、催化活性、分子功能以及分子功能調(diào)節(jié)等功能來(lái)發(fā)揮作用。GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與免疫系統(tǒng)過(guò)程、炎癥反應(yīng)以及對(duì)細(xì)菌的應(yīng)答等功能。表明BCG感染能誘導(dǎo)DC產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。

圖3 BCG感染DC2.4后差異表達(dá)基因GO功能分類圖Fig.3 Differentially expressed gene GO function classification map of DC2.4 cells infected with BCG

圖4 BCG感染DC2.4后差異表達(dá)基因GO富集圖Fig.4 Differentially expressed gene GO enrichment map of DC2.4 cells infected with BCG

2.4 KEGG富集分析結(jié)果 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，如圖5，差異基因主要參與了細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、細(xì)胞免疫等生物過(guò)程；調(diào)節(jié)了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等環(huán)境信息處理過(guò)程。此外差異表達(dá)基因還主要參與了病毒、細(xì)菌感染性疾病、癌癥等人類疾?。慌c免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、發(fā)育與再生等生物系統(tǒng)相關(guān)。差異基因的KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與了TNF、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、IL-17等信號(hào)通路(圖6)。

圖5 BCG感染DC2.4后差異基因KEGG通路分類圖Fig.5 Differentially expressed gene KEGG pathway classification map of DC2.4 cells infected with BCG

圖6 BCG感染DC2.4后KEGG Pathway富集圖Fig.6 Differentially expressed gene KEGG pathway enrichment map of DC2.4 cells infected with BCG

2.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 為了證實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(表3)的可靠性，采用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)上調(diào)基因Ccl7、Hmox1，差異表達(dá)下調(diào)基因Cx3cr1、Msr1、和Cd86的表達(dá)情況。結(jié)果表明(圖7)，5個(gè)基因表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。其中，Msr1、Cd86和Hmox1基因表達(dá)相當(dāng)，基因Ccl7和Cx3cr1的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果分別是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的1.7和0.4倍。

表3 5個(gè)差異表達(dá)基因在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的信息Tab.3 Information on five differentially expressed genes in RNA-Seq

圖7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.7 Results of RNA-Seq verification by qRT-PCR

3 討 論

DC是連接機(jī)體天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁細(xì)胞，在宿主抗感染免疫中起著非常重要的作用[5,17]。BCG感染時(shí)DC可通過(guò)吞噬、抗原呈遞、細(xì)胞因子分泌等功能，調(diào)控宿主炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過(guò)程[5]。此外，BCG除了能誘導(dǎo)DC活化[3]，還可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)DC存活[18]。但BCG的胞內(nèi)免疫機(jī)制仍未完全闡明。本研究對(duì)BCG感染DC進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及生物信息學(xué)分析，篩選出27個(gè)差異表達(dá)基因并通過(guò)生物信息學(xué)分析找到參與BCG感染的細(xì)胞信號(hào)通路，為深入揭示BCG的胞內(nèi)免疫機(jī)制提供方向。qRT-PCR驗(yàn)證Msr1、Ccl7、Cx3cr1、Cd86和Hmox1基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組能用于篩選差異基因。

巨噬細(xì)胞清道夫受體1(Macrophage scavenger receptor 1，Msr1)屬于A類清道夫受體[19]，作為模式識(shí)別受體參與了宿主炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。有研究發(fā)現(xiàn)，Msr1能促進(jìn)單核細(xì)胞增生性李斯特菌的內(nèi)化作用[20]；在BCG以及MTB感染的巨噬細(xì)胞中，Msr1的表達(dá)增加[21]；而在本研究中，Msr1表達(dá)下降。據(jù)此推測(cè)Msr1在DC與巨噬細(xì)胞中的作用可能不同；此外，血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase 1,Hmox-1)和Cd86等基因也與免疫細(xì)胞吞噬、活化功能相關(guān)。Hmox-1在未成熟的DC中高表達(dá)，可限制其促炎作用[22-23]。而卡諾醇和姜黃素能上調(diào)Hmox-1來(lái)誘導(dǎo)DC成熟[24]。結(jié)合本研究中BCG感染導(dǎo)致Hmox-1表達(dá)上調(diào)，推測(cè)BCG可誘導(dǎo)DC活化。當(dāng)Toll受體(TLRs)激活時(shí)，Cd86表達(dá)增加，DC活化[25]。而本研究中Cd86基因表達(dá)下調(diào)，這些矛盾的結(jié)果提示BCG可能并不能很好地激活DC；這可能也與BCG的免疫保護(hù)效果會(huì)隨著時(shí)間的推移而減弱有關(guān)[26]。

趨化因子7(C-C motifchemokine 7，CCL7)和趨化因子受體1(CX3C chemokine receptor 1,Cx3cr1)基因與免疫細(xì)胞遷移和趨化相關(guān)。通常情況下，CCL7基因缺失或阻斷會(huì)減少固有免疫細(xì)胞的招募，限制炎癥反應(yīng)，使機(jī)體更易被感染[27]；相反地，腫瘤中CCL7過(guò)表達(dá)會(huì)招募更多的DC,限制腫瘤的生長(zhǎng)[28-29]。分泌高水平小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白3的牛分枝桿菌BCG(即BCG MCP-3)接種小鼠后，導(dǎo)致更多的淋巴細(xì)胞遷移，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[29]。本研究進(jìn)一步證實(shí)BCG可誘導(dǎo)DC產(chǎn)生CCL7，進(jìn)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞遷移，激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。與CCL7不同，Cx3cr1主要與CSF-1R+髓系前體細(xì)胞向巨噬細(xì)胞/樹(shù)突狀細(xì)胞譜系分化有關(guān)[30]。本研究中Cx3cr1基因下調(diào)，提示BCG可能通過(guò)影響DC的分化來(lái)調(diào)控DC的免疫功能。由此可知，BCG感染調(diào)節(jié)了DC的活化、分化和遷移功能，進(jìn)而影響T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

另外，在本研究中，以“FDR≤0.05和|log2Fold Change|≥1”為條件只篩選出27個(gè)差異表達(dá)基因，這可能與BCG不能很好地刺激DC細(xì)胞活化，從而影響DC細(xì)胞的抗原提呈功能有關(guān)。

綜上，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析研究了BCG感染DC中基因表達(dá)的變化，并通過(guò)qRT-PCR證實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，為深入探討B(tài)CG的胞內(nèi)免疫機(jī)制提供依據(jù)。

利益沖突：無(wú)