張存環(huán), 劉 朗, 彭 雄, 郄杏桃, 陳茂華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 楊凌 712100)

昆蟲(chóng)電壓門(mén)控的鈉離子通道(voltage-gated sodium channel, VGSC)(簡(jiǎn)稱(chēng)“鈉通道”)是擬除蟲(chóng)菊酯等殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)，鈉通道基因突變是導(dǎo)致昆蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯產(chǎn)生抗性的主要原因(Lietal., 2013; Rinkevichetal., 2013; Dongetal., 2014)。脊椎動(dòng)物鈉通道由1個(gè)α亞基和1個(gè)或者幾個(gè)β亞基組成，α亞基能夠獨(dú)立行使鈉通道的基本功能，因此，一般提到的鈉通道基因即指α亞基的編碼基因，β亞基為功能輔助性亞基，在調(diào)節(jié)鈉通道的功能中有輔助作用(Catterall, 2012)。以往的研究認(rèn)為，昆蟲(chóng)的鈉通道和其他真核生物鈉通道相似，由D-Ⅰ, D-Ⅱ, D-Ⅲ和D-Ⅳ 4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，由1個(gè)基因編碼，4個(gè)結(jié)構(gòu)域都由S1-S6 6個(gè)跨膜螺旋(transmembrane helix, TM)組成，即鈉通道為4×6 TM結(jié)構(gòu)。本研究組研究發(fā)現(xiàn)，禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi鈉通道與其他類(lèi)群的昆蟲(chóng)不同，其結(jié)構(gòu)域D-Ⅱ和D-Ⅲ之間分開(kāi)，形成2個(gè)獨(dú)立的基因(RpNavH1和RpNavH2)，即其鈉通道為2×6 TM+2×6 TM結(jié)構(gòu)， RpNavH1的D-Ⅰ-D-Ⅱ結(jié)構(gòu)域與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster鈉通道的有約64%的氨基酸序列一致性，RpNavH2的D-Ⅲ-D-Ⅳ與黑腹果蠅鈉通道的有約63%的氨基酸序列一致性(Zuoetal., 2016a)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，赤擬谷盜Triboliumcastaneum體內(nèi)也存在兩個(gè)鈉離子通道基因，鈉離子通道基因不僅是擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)，而且和昆蟲(chóng)的發(fā)育相關(guān)(Qianetal., 2021)。因此，深入開(kāi)展鈉離子通道相關(guān)的研究，對(duì)于害蟲(chóng)的抗藥性治理和農(nóng)藥新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)具有重要的意義。

昆蟲(chóng)體內(nèi)沒(méi)有鈉通道β亞基，但在昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了與β亞基功能相似的鈉通道輔助亞基TipE, TEH1, TEH2, TEH3和TEH4。關(guān)于昆蟲(chóng)鈉通道輔助亞基功能研究較少，主要集中在黒腹果蠅(Derstetal., 2006; Wangetal., 2013)、美洲大蠊Periplanetaamericana(Bourdinetal., 2015)和西方蜜蜂Apismellifera(Gosselin-Badaroudineetal., 2015)等昆蟲(chóng)。本研究組在前期的研究工作中克隆了禾谷縊管蚜的鈉通道輔助亞基基因RpTipE,RpTEH1,RpTEH2,RpTEH3和RpTEH4，發(fā)現(xiàn)亞致死劑量的擬除蟲(chóng)菊酯能影響這5個(gè)鈉通道輔助亞基基因的表達(dá)，推測(cè)鈉通道輔助亞基在調(diào)節(jié)禾谷縊管蚜鈉通道門(mén)控中可能有重要作用(林芳菲, 2017)。

禾谷縊管蚜屬半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，是重要的麥類(lèi)作物害蟲(chóng)(Blackman and Eastop, 2007)，每年給小麥生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失(Wangetal., 2020; Gongetal., 2021)。擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑長(zhǎng)期應(yīng)用在禾谷縊管蚜的防治之中，禾谷縊管蚜對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了高水平抗性(Wangetal., 2020; Gongetal., 2021)。禾谷縊管蚜鈉通道結(jié)構(gòu)與果蠅鈉通道結(jié)構(gòu)不同，其鈉通道輔助亞基與果蠅鈉通道輔助亞基序列差異較大(Zuoetal., 2016a; 林芳菲, 2017)，禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基的功能研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究分析了禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基對(duì)鈉通道功能及高效氯氟氰菊酯敏感性的影響，研究結(jié)果對(duì)于闡明禾谷縊管蚜鈉通道結(jié)構(gòu)的功能特性以及分析該蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗藥性機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試動(dòng)物：供試禾谷縊管蚜為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)的敏感種群，置于溫度22±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16L∶8D的人工培養(yǎng)箱；供試性成熟的雌性非洲爪蟾Xenopuslaevis購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心。

1.1.2菌種、質(zhì)粒、試驗(yàn)動(dòng)物及培養(yǎng)基：大腸桿菌EscherichiacoliStble3購(gòu)自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；攜帶果蠅鈉通道基因DmNav22和鈉通道輔助亞基基因DmTipE編碼序列的質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)胡兆農(nóng)教授惠贈(zèng)，表達(dá)載體為pGH19；大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體或固體培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)用主要試劑包括Trizol-RNA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒(Promega公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Roche公司)、凝膠膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒(Omega公司)、T7 RiboMAXTMExpress RNAi System 試劑盒(Promega公司)、限制性?xún)?nèi)切酶(NotⅠ,NheⅠ,KpnⅠ,BamHⅠ,EcoRⅠ和XbaⅠ)(TaKaRa公司)、Message Machine?Kit試劑盒(Ambion公司)、96%高效氯氟氰菊酯原藥(中國(guó)鹽城農(nóng)博生物技術(shù)有限公司)。試驗(yàn)用ND-96膠原處理和沖洗溶液、ND-96細(xì)胞培養(yǎng)液、ND-96細(xì)胞記錄液培養(yǎng)液的配制參照文獻(xiàn)(Qieetal., 2022)。爪蟾卵母細(xì)胞使用ND-96培養(yǎng)液培養(yǎng)，其組分(1 L)為：NaCl (96 mmol/L) 5.610 g, KCl (2.0 mmol/L) 0.149 g, MgCl2(1.0 mmol/L) 0.203 g, CaCl2(1.8 mmol/L) 0.265 g, HEPES (5.0 mmol/L) 1.192 g, Na-pyruvate (2.5 mmol/L) 0.275 g, Theophyline (0.5 mmol/L) 0.090 g溶解于滅菌的ddH2O，定容至1 L。溶解后入2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，過(guò)0.22 μm濾膜除菌，并加入100 mg/L慶大霉素4℃保存。

主要儀器包括Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、Nanoject II Autu-Nanoliter Injector 顯微注射儀(美國(guó)WPI公司)、微電極拉制儀(型號(hào)：P-97, 美國(guó)Sutter公司)cRNA顯微注射儀(型號(hào)：Nanoliter2000, 美國(guó)Sutter公司)、微電極放大器和數(shù)模轉(zhuǎn)換器雙電極電壓鉗系統(tǒng)(型號(hào)：AXOCLAMP900A, 美國(guó)Molecular Devices Corporation公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本研究組之前獲得的禾谷縊管蚜鈉通道及其輔助亞基基因序列(林芳菲, 2017)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)RT-PCR引物，以β-actin作為內(nèi)參基因。根據(jù)之前獲得的cDNA序列，在http:∥www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl 網(wǎng)站設(shè)計(jì)各基因RNA干擾(RNAi)所用引物，并將T7轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列加到靶標(biāo)區(qū)域兩端，引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)鈉通道輔助亞基基因的編碼區(qū)序列以及表達(dá)載體的可用酶切位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì) 1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，引物序列見(jiàn)表2。

表1 禾谷縊管蚜鈉通道基因和鈉通道輔助亞基基因RpTipE的熒光定量PCR及dsRNA合成引物Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR and dsRNA synthesis of sodium channel genes and sodium channel auxiliary subunit gene RpTipE of Rhopalosiphum padi

表2 禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基基因表達(dá)所用引物Table 2 Primers for gene expression analysis of sodium channel auxiliary subunit genes of Rhopalosiphum padi

1.4 基因RNAi 和殺蟲(chóng)劑生物測(cè)定

RpNavH1,RpNavH2和RpTipE基因的RNAi：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究和預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別注射dsGFP、ddH2O和緩沖液作對(duì)照時(shí)，目標(biāo)基因在3種處理?xiàng)l件下表達(dá)水平無(wú)顯著差異，本研究以注射dsGFP(陰性對(duì)照)和不注射(空白對(duì)照)作為對(duì)照。參照Z(yǔ)uo等(2016a)的RNAi方法，隨機(jī)取禾谷縊管蚜無(wú)翅成蟲(chóng)，分別注射dsRpNavH1, dsRpNavH2, dsRpTipE和dsGFP，每種dsRNA注射100頭蚜蟲(chóng)，根據(jù)本研究組前期的研究和預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果，dsRpNavH1在注射后24 h干擾效率相對(duì)最高時(shí)，dsRpNavH2在注射后72 h干擾效率最高時(shí)(Zuoetal., 2016a)，dsRpTipE在注射后24, 48和72 h時(shí)，分別挑取存活的成蚜10頭，提取總RNA，進(jìn)行下一步基因的表達(dá)量分析。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

殺蟲(chóng)劑生物測(cè)定：隨機(jī)取禾谷縊管蚜無(wú)翅成蟲(chóng)，分別注射dsRpTipE和dsGFP，每種dsRNA注射100頭蚜蟲(chóng)，空白對(duì)照不注射dsRNA，注射后72 h時(shí)收集成活蚜蟲(chóng)40頭，使用LC50(1.667 mg/L)濃度的高效氯氰菊酯(Zuoetal., 2016b)和0.1% Triton-X 100水溶液(對(duì)照)分別處理20頭成活的蚜蟲(chóng)，處理后24 h時(shí)記錄死亡結(jié)果。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：以足不動(dòng)者視為死亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取純化后的1.4節(jié)提取的總RNA 4 μL和1 μL Oligo(dT)18(500 μg/mL)加入200 μL離心管中，參照Z(yǔ)uo等(2016a)的方法合成cDNA，合成cDNA的反應(yīng)體系還包括 4 μL 5×Reaction Buffer, 2.5 μL 25 mmol/L MgCl2,1 μL 10 mmol/L PCR Nucleotide Mix,6 μL Nuclease-Free Water, 20 U Ribonuclease Inhibitor和200U GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶。將稀釋10倍的cDNA作為模板，制作禾谷縊管蚜RpNavH1,RpNavH2,RpTipE和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定擴(kuò)增效率。每個(gè)處理都包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)以及3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以ddH2O為模板作為空白對(duì)照，進(jìn)行qRT-PCR分析，PCR反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Green Supermix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, cDNA 模板1 μL, 加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 58℃ 15 s, 72℃ 20 s, 共40 個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線判斷其特異性。所用引物的擴(kuò)增效率均接近100%，熔解曲線均為單峰，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性為0.995以上，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 異源表達(dá)與電生理實(shí)驗(yàn)

1.6.1表達(dá)載體的構(gòu)建：利用帶限制性酶切位點(diǎn)的特異性引物，分別以構(gòu)建好的測(cè)序正確pMD-Teasy/RpTipE和pMD-Teasy/RpTEH2-RpTEH4質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pGH19同時(shí)用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化涂平板，挑選單克隆置于液體培養(yǎng)基中搖晃培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后，送上海生工生物測(cè)序有限公司鑒定。

1.6.2環(huán)狀質(zhì)粒線性化：將上述質(zhì)粒分別利用NotⅠ和NheⅠ限制性?xún)?nèi)切酶線性化2 h，線性化質(zhì)粒電泳檢測(cè)并純化后，用作體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA的模板，酶切體系參照說(shuō)明書(shū)。

1.6.3cRNA 的制備及純化：純化過(guò)的線性化RpTipE和RpTEH2-RpTEH4質(zhì)粒用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cRNA，操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)錄后的RpTipE和RpTEH2-RpTEH4 cRNA用氯化鋰沉淀法進(jìn)行純化。用分光光度計(jì)測(cè)定濃度以及A260/A280，分裝保存于-80℃超低溫冰箱。

本實(shí)驗(yàn)所用禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基基因及果蠅鈉通道基因DmNav22和DmTipE的質(zhì)粒和線性化質(zhì)粒及cRNA的質(zhì)量濃度見(jiàn)表3。

表3 禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基基因及果蠅鈉通道基因DmNav22和鈉通道輔助亞基基因DmTipE的質(zhì)粒和線性化質(zhì)粒及cRNA的質(zhì)量濃度和A260/A280值Table 3 Mass concentrations and A260/A280 values of the plasmids, linearized plasmids and cRNAs of sodium channel auxiliary subunit genes of Rhopalosiphum padi, and sodium channel gene DmNav22 and sodium channel auxiliary subunit gene DmTipE of Drosophila

1.6.4爪蟾的解剖以及其卵母細(xì)胞的酶解與篩選：將雌性非洲爪蟾置于配制好的2 g/L的三卡因溶液中，時(shí)間20～30 min，待爪蟾麻醉不動(dòng)后將其取出置于冰上，在其腹部下方用手術(shù)刀切一個(gè)小口，輕輕拉出卵巢瓣，用手術(shù)剪剪下3～5個(gè)卵巢瓣，將其置于盛有洗液的培養(yǎng)皿中?？p合爪蟾的肌肉層與表皮層，后將其放入含有抗生素的淺水中(頭部露出水面)待其蘇醒。18℃條件下，將卵母細(xì)胞置于含1 mg/mL IA型膠原酶的卵母細(xì)胞洗滌液中消化30 min左右。將酶解后的卵母細(xì)胞在洗滌液中多次清洗后保存于卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中。在顯微鏡下挑出動(dòng)物極與植物極界限分明，發(fā)育階段處于V-VI期且表面光滑的卵母細(xì)胞，并用鑷子剝掉濾泡膜。將處理好的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移置干凈的盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿里，并于18℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6.5cRNA的顯微注射：將DmNav22的cRNA分別與DmTipE,RpTipE,RpTEH2-RpTEH4的cRNA等物質(zhì)量混合后，以石蠟油為載體，吸入針頭，注射部位在爪蟾卵母細(xì)胞的植物性半球或接近“赤道區(qū)”，以避免對(duì)核的損傷。以單獨(dú)注射DmNav22 cRNA為對(duì)照，注射后的卵母細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)液中，在18℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，且在12～18 h后用于電流檢測(cè)。

1.6.6電壓鉗記錄：實(shí)驗(yàn)過(guò)程電流記錄方法參照相關(guān)文獻(xiàn)(Duetal., 2009)。利用雙電極電壓鉗系統(tǒng)測(cè)定昆蟲(chóng)鈉通道電流。將拉制好玻璃微電極內(nèi)灌入含瓊脂粉的3 mol/L KCl溶液，使其電極電阻小于0.5 MΩ，卵母細(xì)胞置于裝有記錄溶液的記錄槽中，將微電極接到電壓鉗儀器探頭上，使用微操動(dòng)儀分別將電流電極與電壓電極同時(shí)插入細(xì)胞中，設(shè)置鉗制電壓為-120 mV，以5 mV的步階從-120 mV去極化至-10 mV，時(shí)間為100 ms，再給予一組持續(xù)20 ms的-10 mV測(cè)試脈沖，室溫下記錄電流。

1.7 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用軟件SPSS 20.0對(duì)禾谷縊管蚜不同處理?xiàng)l件下的死亡率及各基因在不同處理?xiàng)l件下的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間的比較采用Student氏t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，差異顯著性為P<0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 干擾鈉通道基因RpNavH1和RpNavH2對(duì)其輔助亞基基因表達(dá)量的影響

本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明，RpNavH1在注射dsRNA后24 h時(shí)的干擾效率相對(duì)最高，RpNavH2在注射dsRNA后72 h時(shí)的干擾效率最高(Zuoetal., 2016a)。本研究分析注射dsRpNavH1后24 h時(shí)的禾谷縊管蚜來(lái)分析鈉通道輔助亞基基因在處理組(注射dsRpNavH1)與對(duì)照組(注射dsGFP)間的表達(dá)差異。結(jié)果表明，干擾RpNavH1能夠顯著降低RpTEH1(P=0.003),RpTEH2(P=0.021),RpTEH3(P=0.024)以及RpTipE(P=0.002)(t檢驗(yàn)) 4個(gè)鈉通道輔助亞基基因的表達(dá)量，而RpTEH4在處理組和對(duì)照組之間的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異(P=0.076)(圖1: A)。本研究分析注射dsRpNavH2和dsGFP后72 h時(shí)的禾谷縊管蚜來(lái)分析干擾RpNavH2對(duì)鈉通道輔助亞基基因表達(dá)量的影響，結(jié)果表明，RNAi干擾RpNavH2顯著降低RpTEH1(P=0.001),RpTEH2(P=0.001),RpTEH3(P=0.005),RpTEH4(P=0.003)和RpTipE(P=0.007)的表達(dá)(圖1: B)。

圖1 顯微注射dsRNA敲降鈉通道基因RpNavH1(A)和RpNavH2(B)后禾谷縊管蚜成蚜5個(gè)鈉通道輔助亞基基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 1 Relative expression levels of five sodium channel auxiliary subunit genes in Rhopalosiphum padi adults after knockdown of sodium channel genes RpNavH1 (A) and RpNavH2 (B) by microinjection of dsRNAA: 注射后24 h (At 24 h post injection); B: 注射后72 h (At 72 h post injection). 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上符號(hào)表示兩組間的差異顯著性(*P<0.05; **P<0.01; nsP>0.05)(Student氏t檢驗(yàn))。圖2同。Data in the figure are mean±SE. Symbols above bars indicate significance of difference between two groups (*P<0.05; **P<0.01; nsP>0.05) (Student′s t-test). The same for Fig. 2.

2.2 RNAi干擾RpTipE對(duì)禾谷縊管蚜的鈉通道及其輔助亞基基因表達(dá)量以及高效氯氟氰菊酯敏感性的影響

以往的報(bào)道表明，TipE是昆蟲(chóng)鈉通道最重要的輔助亞基(Derstetal., 2006; Wangetal., 2013)。本研究首先利用RNAi技術(shù)初步研究禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基基因RpTipE的功能。為了確定的RNAi效率，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析處理組(注射dsRpTipE)和對(duì)照組(注射dsGFP)的禾谷縊管蚜RpTipE在注射后不同時(shí)間的表達(dá)情況。在注射dsRpTipE后24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，RpTipE的相對(duì)表達(dá)量降低了14%(P=0.049)；在注射dsRpTipE后48 h時(shí)，相對(duì)表達(dá)量下降到39%(P=0.008)；在注射dsRpTipE后72 h時(shí)，RpTipE的干擾效率降低了24%(P=0.014)(圖2: A)。

圖2 顯微注射dsRNA敲降RpTipE對(duì)禾谷縊管蚜成蚜的鈉通道及其鈉通道輔助亞基基因表達(dá)量以及高效氯氟氰菊酯敏感性的影響Fig. 2 Effects of knockdown of RpTipE by microinjection of dsRNA on the expression levels of genes of sodium channels and their auxiliary subunits in Rhopalosiphum padi adults and the susceptibility of these adults to beta-cypermethrinA: 注射dsRpTipE后不同時(shí)間對(duì)RpTipE的RNA干擾效率RNAi efficiency for RpTipE at different time post injection of dsRpTipE; B: 注射dsRpTipE后48 h禾谷縊管蚜成蚜體內(nèi)鈉通道及其輔助亞基基因的相對(duì)表達(dá)量Relative expression levels of genes of sodium channels and their auxiliary subunits in R. padi adults at 48 h post injection of dsRpTipE; C: 注射dsRpTipE后48 h用LC50濃度的高效氯氟氰菊酯處理禾谷縊管蚜成蚜的死亡率Mortality of R. padi adults treated with LC50concentration of beta-cypermethrin at 48 h post injection of dsRpTipE. Non-injection: 未注射的空白對(duì)照Uninjected blank control.

本研究分別取注射dsRpTipE和dsGFP后48 h時(shí)的禾谷縊管蚜分析干擾RpTipE對(duì)鈉通道基因及其同源輔助亞基基因RpTEH1-RpTEH4表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，RNAi干擾RpTipE顯著降低鈉通道基因RpNavH1(P=0.012)和RpNavH2(P=0.042)以及輔助亞基基因RpTEH1(P=0.009),RpTEH2(P=0.042),RpTEH3(P=0.018)和RpTEH4(P=0.014)的表達(dá)量(圖2: B)。

生物測(cè)定結(jié)果表明，用LC50濃度的高效氯氰菊酯處理后，注射dsRpTipE后48 h時(shí)的禾谷縊管蚜成蚜死亡率顯著低于注射dsGFP(P=0.011)和未注射的空白對(duì)照組(P=0.028)(圖2: C)。

2.3 禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基對(duì)鈉通道的門(mén)控性質(zhì)影響

本研究采用雙電極電壓鉗技術(shù)研究了禾谷縊管蚜5個(gè)鈉通道輔助亞基的輔助功能，由于禾谷縊管蚜鈉離子通道目前不能在體外真核表達(dá)，本研究利用昆蟲(chóng)鈉通道功能研究中常用的果蠅鈉通道DmNav22研究禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基的功能，并使用果蠅鈉通道輔助亞基DmTipE進(jìn)行比較分析。將DmNav22的cRNA單獨(dú)注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞及將DmNav22的cRNA分別與DmTipE,RpTEH2,RpTEH3,RpTEH4和RpTipE的cRNA等物質(zhì)量混合注射到爪蟾卵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)注射DmNav22的cRNA到爪蟾卵母細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)到很小的Na+電流；而當(dāng)DmNav22的cRNA分別與等物質(zhì)量的DmTipE,RpTEH2,RpTEH3,RpTEH4和RpTipE的cRNA共同注射爪蟾卵母細(xì)胞后，所檢測(cè)到的Na+電流相對(duì)于單獨(dú)注射DmNav22的cRNA所檢測(cè)的Na+電流都明顯變大。

圖3 雙電壓鉗技術(shù)檢測(cè)非洲爪蟾卵母細(xì)胞單獨(dú)注射DmNav22 cRNA(A)及DmNav22 cRNA分別與鈉通道輔助亞基基因DmTipE (B), RpTEH2 (C), RpTEH3 (D), RpTEH4 (E)和RpTipE (F)的cRNA共注射時(shí)激發(fā)的Na+電流Fig. 3 Na+ currents evoked by DmNav22 cRNA (A) injected alone and DmNav22 cRNA co-injected with cRNAs of sodium channel auxiliary subunit genes DmTipE (B), RpTEH2 (C), RpTEH3 (D), RpTEH4 (E) and RpTipE (F), respectively, in Xenopus laevis oocytes detected by two-electrode voltage clamp technology

3 討論

昆蟲(chóng)鈉通道輔助亞基與哺乳動(dòng)物鈉通道β亞基在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中分為兩大支，昆蟲(chóng)TipE與β亞基的氨基酸序列同源性較低。哺乳動(dòng)物鈉通道β亞基(β1-β4)被認(rèn)為是離子通道的調(diào)節(jié)原件和細(xì)胞粘附分子，能調(diào)節(jié)鈉離子通道的表達(dá)和通道門(mén)控性質(zhì)，并且還調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附與遷移(Isom, 2002; Brackenburyetal., 2013)。昆蟲(chóng)中尚未發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物β亞基的直系同源蛋白，昆蟲(chóng)TipE及其同源亞基具有與哺乳動(dòng)物鈉通道β亞基相似的功能(Derstetal., 2006; Wangetal., 2013, 2015)，由于昆蟲(chóng)鈉通道輔助亞基與哺乳動(dòng)物鈉通道輔助亞基蛋白的相似性很低，昆蟲(chóng)鈉通道輔助亞基可能作為靶標(biāo)開(kāi)發(fā)新型對(duì)人和哺乳動(dòng)物安全的新型殺蟲(chóng)劑。

關(guān)于昆蟲(chóng)鈉通道輔助亞基功能研究的文獻(xiàn)也較少。Warmke等(1997)研究表明，果蠅5個(gè)鈉通道輔助亞基在調(diào)控果蠅鈉通道激活與失活過(guò)程中的功能不同。TEH1在超極化方向上能改變依賴(lài)電壓的快速失活，并延緩黒腹果蠅鈉離子通道從快速失活中恢復(fù)(Derstetal., 2006)但TipE或TEH1-4調(diào)節(jié)門(mén)控修飾程度是否與它們的變體特異性相關(guān)尚不清楚(Bourdinetal., 2015)。將黑腹果蠅鈉通道基因分別與其5個(gè)輔助亞基基因在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中共表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，TipE能將黑腹果蠅鈉電流提高約20倍，TEH1能將鈉電流提高約30倍，TEH2和TEH3能將鈉電流提高5～10倍，而TEH4不能顯著提高鈉電流(Derstetal., 2006)；西方蜜蜂鈉通道輔助亞基TipE和TEH均增加了鈉通道的表達(dá)，其TipE, TEH1和TEH2沒(méi)有改變或增加鈉通道穩(wěn)態(tài)失活，而TEH3和TEH4不僅阻礙通道進(jìn)入失活狀態(tài)，也阻礙了鈉通道的激活(Gosselin-Badaroudineetal., 2015)。Bourdin等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊TipE比果蠅TipE更有效地促進(jìn)DmNav1-1引發(fā)的Na+電流，表明美洲大蠊TipE可能具有更強(qiáng)大的伴侶特性。本研究發(fā)現(xiàn)，將禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基基因RpTipE以及RpTEH2,RpTEH3和RpTEH4分別與果蠅鈉通道DmNav22在爪蟾卵母細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，均提高了果蠅DmNav22的鈉電流(圖3)，表明禾谷縊管蚜鈉通道雖然具有獨(dú)特的異源二聚體結(jié)構(gòu)，但其鈉通道輔助亞基仍和其他鈉通道昆蟲(chóng)輔助亞基一樣，能夠提高鈉通道的鈉電流，推測(cè)禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基TipE可能參與調(diào)節(jié)鈉通道的門(mén)控性質(zhì)。

靶標(biāo)基因的表達(dá)量的變化可以使多聚體靶標(biāo)的亞基組成發(fā)生變化，進(jìn)而改變了殺蟲(chóng)劑結(jié)合靶標(biāo)的能力(Zhangetal., 2015; Chenetal., 2017)。Chen等(2017)研究表明，煙堿型酰膽堿受體β1亞基的低水平表達(dá)與棉蚜Aphisgossypii的吡蟲(chóng)啉抗性相關(guān)。Zhang等(2015)研究表明，當(dāng)RNAi煙堿型乙酰膽堿受體α8亞基后，褐飛虱Nilaparvatalugens對(duì)吡蟲(chóng)啉的敏感性降低，α8亞基的下調(diào)與吡蟲(chóng)啉抗性相關(guān)。Zuo等(2016a)研究表明，干擾禾谷縊管蚜兩個(gè)鈉通道基因后，禾谷縊管蚜對(duì)高效氯氰菊酯的敏感性降低。Tian等(2018)研究也表明在具有完整鈉離子通道結(jié)構(gòu)域的甜菜夜蛾Spodopteraexigua中，鈉通道基因在抗性品系中的表達(dá)量顯著低于敏感品系。Qian等(2021)研究表明， RNAi干擾赤擬谷盜的兩個(gè)鈉通道基因TcNav1和TcNav2后，顯著降低該蟲(chóng)對(duì)溴氰菊酯的敏感性。本研究分別干擾了禾谷縊管蚜鈉通道基因RpNavH1和RpNavH2后，鈉通道輔助亞基基因的表達(dá)量都下調(diào)(圖1)；干擾RpTipE后，禾谷縊管蚜鈉通道基因RpNavH1和RpNavH2的表達(dá)量均顯著降低(圖2)。黑腹果蠅和西方蜜蜂蠅鈉離子通道5個(gè)輔助亞基在調(diào)控果蠅鈉通道門(mén)控性質(zhì)中具有不同的功能，但是昆蟲(chóng)鈉通道輔助亞基之間的相關(guān)影響目前還缺乏研究，禾谷縊管蚜鈉通道基因及其輔助亞基因之間的相互影響模式也有待進(jìn)一步研究。本研究RNAi干擾RpTipE后，禾谷縊管蚜經(jīng)高效氯氟氰菊酯處理后的死亡率降低(圖2)，這可能是因?yàn)楦蓴_RpTipE后，鈉通道基因以及其他鈉通道輔助亞基基因的表達(dá)量降低，而高效氯氟氰菊酯的作用靶標(biāo)為鈉通道，作用靶標(biāo)的減少導(dǎo)致高效氯氟氰菊酯的效果降低。