孟 昆, 胡旭昊, 石柳柳

(1. 湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院, 湖北十堰 442000; 2. 湖北醫(yī)藥學院基礎(chǔ)醫(yī)學院, 湖北十堰 442000)

細胞凋亡是真核生物中存在的一種程序化死亡方式，在維持細胞生長分化，介導先天免疫反應等過程發(fā)揮了重要作用(Schwarzeretal., 2020)。細胞凋亡由蛋白酶caspase介導，caspase是一類保守的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，具有半胱氨酸活性位點，可以在底物蛋白的天冬氨酸位置發(fā)生切割(Shi, 2004)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除了細胞凋亡，caspase還介導了其他重要的生物學過程，如細胞焦亡(Jiangetal., 2020)、先天免疫(Orning and Lien, 2021)等。在正常細胞中，caspase是以無活性的酶原形式(procaspase)存在的，procaspase通常包括一個N端的原結(jié)構(gòu)域，1個大亞基(p20)和1個小亞基(p10)。有活性的蛋白酶是由兩個大亞基和兩個小亞基組成的異源四聚體，包含兩個活性位點。無活性的procaspase變成有活性的 caspase需要發(fā)生兩次切割：大亞基與小亞基之間的切割以及原結(jié)構(gòu)域與大亞基之間的切割(Boatright and Salvesen, 2003)，因此caspase的激活伴隨著其蛋白的切割。根據(jù)caspase在通路中發(fā)揮作用的時間順序，可以分為起始caspase和效應caspase兩大類。起始caspase通常擁有較長的N端原結(jié)構(gòu)域，通常包含一些募集結(jié)構(gòu)域，例如死亡效應結(jié)構(gòu)域(death effector domain, DED)或半胱天冬酶的激活和caspase募集域(caspase recruitment domain, CARD)，而效應caspase通常有一個短的原結(jié)構(gòu)域(Kesavardhanaetal., 2020)。

果蠅Drosophila是研究發(fā)育生物學、生物化學重要的模式生物之一(Subhan and Siddique, 2021)。果蠅中存在7個caspases: Dronc, Dredd, Strica (serine- and threonine-rich caspase), Dcp-1, Decay, Drice和Damm，其中，Dronc, Dredd和Strica這3個蛋白含有一個長的原結(jié)構(gòu)域，是起始caspase (Cooperetal., 2009)。比較特殊的是，Strica擁有一個富含絲氨酸和蘇氨酸原結(jié)構(gòu)域，在哺乳動物中沒有同源蛋白，是昆蟲中特有的一類caspase(Doumanisetal., 2001)。前期的研究報道表明Strica與細胞凋亡相關(guān)：過表達Strica引發(fā)果蠅SL2細胞凋亡(Doumanisetal., 2001)；果蠅眼睛異源表達Strica導致果蠅呈現(xiàn)毛糙眼(rough eye)；RNAi實驗表明Strica參與Hid蛋白誘導的細胞凋亡，DIAP1結(jié)合Strica并抑制其凋亡(Leulieretal., 2006)。另外，strica在胚胎和幼蟲期表達量較低，而在蛹和成蟲中表達量比較高，在果蠅卵子、神經(jīng)元發(fā)育等凋亡過程中與Dronc蛋白存在冗余功能(Baumetal., 2007; Leeetal., 2011; Kaleetal., 2015)。但由于缺乏該蛋白的商業(yè)化抗體，Strica蛋白的結(jié)構(gòu)、酶原激活方式以及生化功能等方面仍有待研究。鑒于此，本研究表達純化Strica蛋白，制備抗Strica的多克隆抗體，并且研究了該蛋白在凋亡刺激物放線菌酮處理后的激活狀態(tài)，為進一步深入研究Strica的功能提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試果蠅細胞

果蠅Schneider 2(S2)細胞購買于美國培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，在含有10%胎牛血清(Gibco)的Schneider’sDrosophilaMedium (BI)中，于28℃飽和濕度的無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 Strica原核表達載體構(gòu)建

利用DNAstar和PROSITE在線軟件分析果蠅Strica的蛋白質(zhì)序列(NCBI登錄號: NP_001260718)，設計引物擴增選取的親水性較好、表面可及性和免疫原性強的區(qū)域(220-330 aa，預測為Strica蛋白原結(jié)構(gòu)域位置)。引物于武漢生工生物公司合成(表1)。以前期構(gòu)建的含有Strica ORF全長的pAc5-V5-Strica過表達載體(本實驗室保存)為模板，利用上述引物進行PCR擴增，反應體系: 10×KOD Buffer 5 μL, dNTPs (2 mmol/L) 5 μL, MgSO4(25 mmol/L) 3 μL, KOD酶1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 模板100 ng, ddH2O 34 μL。反應程序: 98℃預變性5 min; 98℃變性30 s, 58℃退火30 s, 68℃延伸30 s, 30個循環(huán)；68℃繼續(xù)延伸10 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物，回收目的片段。將目的片段與pET30a(本實驗室保存)通過NdeⅠ和XhoⅠ(NEB公司, 美國)雙酶切后連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliTop10感受態(tài)細胞(本實驗室保存)，構(gòu)建表達載體；挑取單菌落搖菌，提質(zhì)粒后送武漢生工生物測序。DNA回收試劑盒以及質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根公司。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 Strica原核表達與純化

將1.2節(jié)構(gòu)建的pET30a-Strica轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞(由本實驗室保存)，挑取單克隆搖菌，當OD600達到0.4時，加入0.4 mmol/L IPTG，于22℃下誘導表達15 h，在OD600達到0.8～1.0停止誘導。菌液經(jīng)過超聲破碎離心后，通過SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況以及在上清和沉淀中的分布。將離心得到的蛋白上清與Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)孵育，并利用20, 80, 250和500 mmol/L的咪唑溶液進行洗脫，通過SDS-PAGE檢測目的蛋白在不同濃度咪唑洗脫液中的分布。并利用3 kD的超濾管(Millipore)進行超濾濃縮。蛋白濃度用考馬斯藍染色法測定，以不同濃度的牛血清白蛋白為衡量標準。

1.4 Strica抗體的制備與效價檢測

實驗動物 6周齡的新西蘭大白兔的購買與飼養(yǎng)均來自于湖北醫(yī)藥學院動物中心。取200 μg 1.3節(jié)重組Strica蛋白樣品，用PBS稀釋到500 μL，加入等體積弗氏佐劑(初次免疫用弗氏完全佐劑，加強免疫用弗氏不完全佐劑)；用混勻儀器將溶液和佐劑混勻，形成油包水。將混勻好的免疫原進行背部皮下注射免疫，打8～10個點。每兩周同樣劑量加強免疫，共加強兩次。耳靜脈取血，通過間接ELISA測定抗體效價。達到預期的效價后，頸動脈取血，全血室溫靜置30～120 min后，5 000 r/min離心10 min，得到血清。血清經(jīng)過Protein G純化得到抗體。取1.5 mL未免疫新西蘭大白兔耳靜脈血制備的血清作為陰性血清。利用間接ELISA法測定抗體的效價：用終濃度為2 μg/mL的抗原于4℃包被過夜。一抗為制作的多克隆抗體，多抗從200倍開始2倍梯度稀釋，陰性對照為免疫前血清200倍稀釋，空白對照為PBS。二抗為10 000倍稀釋的羊抗兔IgG，測定450 nm處的吸光值。效價為大于最大OD/2的最小OD讀數(shù)所對應的稀釋度。用純化的帶His標簽的Strica免疫原蛋白通過Western blot實驗檢測該抗體的靈敏度，具體操作如下：向果蠅Strica重組蛋白樣品加入SDS loading，進行SDS-PAGE電泳，24 V恒壓轉(zhuǎn)PVDF膜45 min。5% 脫脂牛奶室溫封閉30 min，1×TBST洗膜3次，每次5 min。Anti-His抗體(27E8，#9991S)來自CST公司，稀釋比例為1∶1 000(v/v)；anti-Strica抗體分別按照1∶500, 1∶1 000, 1∶2 000, 1∶5 000以及1∶10 000(v/v)進行稀釋；陰性血清稀釋比例為1∶1 000(v/v)。室溫孵育2 h，1×TBST洗3次后，辣根過氧化物酶HRP標記羊抗鼠或羊抗兔的二抗購買于Thermo Fisher公司，稀釋比例為1∶5 000。室溫孵育30 min，1×TBST洗3次后進行顯影。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

為了在細胞水平上檢測Strica蛋白，將果蠅S2細胞鋪于24孔板中，細胞密度約為70%，利用Lipofectamine 2000將前期構(gòu)建的過表達載體pAc5-V5-Strica或空載體質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，原核表達的Strica蛋白作為陽性對照。利用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染strica的特異性siRNA，siRNA轉(zhuǎn)染果蠅S2細胞的細胞密度約為30%。 果蠅strica的特異性siRNA序列：5′-GCTC TCTTCGCAAAGATAAAG-3′，非特異性siRNA序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCA CGT-3′。SiRNA由武漢生工生物公司合成。利用Strica抗體通過Western blot檢測(方法同1.4節(jié))S2細胞中內(nèi)源以及過表達的Strica蛋白。Anti-α-tubulin抗體(T5168)購自Sigma-Aldrich，稀釋比例為1∶5 000。

1.6 RT-qPCR檢測strica表達量

通過Trizol 裂解法提取1.5節(jié)S2細胞總RNA，利用南京諾唯贊公司HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，以actin作為內(nèi)參基因，進行qPCR檢測。qPCR體系: 2×SYBR Mix 10 μL, cDNA 100 ng, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, RNase-free-ddH2O補至20 μL。PCR程序: 95℃ 5 min; 95℃ 15 s, 60℃ 40 s, 40個循環(huán); 同時在60～95℃進行溶解度分析。通過2-ΔΔCt計算出strica的相對表達量。實驗進行3次生物學重復，每個反應設置3次技術(shù)重復。

1.7 免疫熒光實驗進行Strica亞細胞定位

S2細胞在多聚賴氨酸處理的細胞爬片上生長，使用4%的多聚甲醛固定10 min。0.2%Triton X-100滲透15 min。2%牛血清白蛋白孵育30 min，阻斷非特異性結(jié)合。anti-Strica抗體(1∶1 000, v/v)孵育樣品，PBS洗3次。FITC標記的熒光二抗(ThermoFisher)孵育0.5 h，PBS洗4次。DAPI染色1 min，PBS洗3次后封片。共焦顯微鏡(Olympus)上獲得共焦熒光圖像。

1.8 放線菌酮誘導Strica的切割激活檢測

為了研究Strica是否參與果蠅細胞的細胞凋亡通路，向S2細胞中加入放線菌酮(cycloheximide, CHX)，對照組加入0.1%的DMSO。CHX購于Selleck公司(S7418)，使用濃度為10 μg/mL，處理18 h后裂解細胞，caspase抑制劑z-VAD-FMK(20 μmol/L)于CHX處理前2 h時加入。將5 μL CHX處理過的S2細胞裂解物與20 μmol/L的caspase熒光底物Ac-DEVD-AFC在檸檬酸鈉緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，1 mol/L檸檬酸鈉，10 mmol/L DTT和0.05% CHAPS)中混合，并在37℃下共孵育30 min后通過監(jiān)測熒光AFC的釋放測量caspase活性，每5 min測量一次，共持續(xù)1 h (Mengetal., 2016)。使用Graphpad Prism 9.0軟件收集和分析數(shù)據(jù)。利用Strica抗體通過Western blot檢測CHX處理后S2細胞裂解液中Strica蛋白的切割狀態(tài)。方法同1.5節(jié)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，兩組樣品比較采用t檢驗，統(tǒng)計學上以P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極其顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 果蠅Strica重組蛋白的表達與純化

IPTG誘導表達后出現(xiàn)一條分子量大小約12 kD的蛋白條帶(圖1: A)。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，250 mmol/L咪唑洗脫下來的蛋白較多，用梯度濃度的BSA進行蛋白定量，發(fā)現(xiàn)目的蛋白濃度處于0.5～1.0 mg/mL(圖1: B)。

圖1 果蠅Strica重組蛋白的誘導表達(A)及其純化(B)Fig. 1 Induced expression (A) and purification (B) of the recombinant Drosophila Strica1: 無IPTG誘導的細菌裂解液Bacteria lysate without IPTG induction; 2: IPTG誘導的細菌裂解液Bacteria lysate after IPTG induction; 3： IPTG誘導的上清Supernatant after IPTG induction; 4: IPTG誘導的沉淀Precipitation after IPTG induction; 5: 流穿液Flow through fluid; 6-9: 分別為20, 80, 250和500 mmol/L咪唑洗脫液Eluent with 20, 80, 250 and 500 mmol/L imidazole, respectively; 10-12: 分別為0.2, 0.5和1.0 mg/mL BSA 0.2, 0.5 and 1.0 mg/mL BSA, respectively; M: 蛋白質(zhì)分子量標準Protein molecular weight marker.

2.2 Strica多克隆抗體效價和靈敏度

間接ELISA方法檢測血清的效價達1∶25 600(圖2: A)。通過Protein G進行抗體純化。通過BCA測試，最終Strica抗體濃度為2.3 mg/mL。Western blot靈敏度檢測結(jié)果表明，Strica蛋白可被anti-His抗體檢測到，也可以被1∶10 000稀釋度下的多克隆抗體檢測到，而不能被陰性的血清檢測到(圖2: B)。

圖2 Strica多克隆抗體的效價(A)和靈敏度(B)Fig. 2 Titer (A) and sensitivity (B) of Strica polyclonal antibody1: Anti-His抗體Anti-His antibody, 1∶1 000; 2: Anti-Strica抗體Anti-Strica antibody, 1∶500; 3: Anti-Strica抗體Anti-Strica antibody, 1∶1 000; 4:Anti-Strica抗體Anti-Strica antibody, 1∶2 000; 5: Anti-Strica抗體Anti-Strica antibody, 1∶5 000; 6: Anti-Strica抗體Anti-Strica antibody, 1∶10 000; 7: 陰性血清Negative serum, 1∶1 000 (Anti-negative: 抗Strica陰性血清Anti-Strica negative serum).

2.3 Strica多克隆抗體在果蠅S2細胞中的表達

Western blot檢測結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染了pAc5-V5-Strica質(zhì)粒的S2細胞樣品和原核表達的Strica蛋白樣品在55 kD處檢測到了特異性條帶(#1)，符合Strica蛋白的理論分子量。而轉(zhuǎn)染了空載體的樣品相應的位置處有一條較淺的條帶 (#2)，可能是內(nèi)源性的Strica。結(jié)果說明制備的Strica蛋白多克隆抗體能夠用于檢測果蠅細胞中過表達的Strica蛋白。

圖3 利用Strica多克隆抗體檢測果蠅S2細胞中過表達的Strica蛋白Fig. 3 Over-expressed Strica in Drosophila S2 cells detected by Strica polyclonal antibody1: 轉(zhuǎn)染pAc5-V5-Strica質(zhì)粒Transfected with plasmid pAc5-V5-Strica; 2: 轉(zhuǎn)染pAc5-V5空載體質(zhì)粒Transfected with blank plasmid vector pAc5-V5; 3: 帶His標簽的Strica蛋白Strica with His-tag; #1: 過表達的Strica Overexpressed Strica; #2: 細胞內(nèi)源的Strica Cellular endogenous Strica.

進而為了檢測果蠅細胞中內(nèi)源性的Strica蛋白，我們在S2細胞中轉(zhuǎn)染了strica特異性的和非特異性siRNA，用anti-Strica抗體進行Western blot檢測。RT-qPCR結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染了非特異性siRNA的樣品比較，轉(zhuǎn)染了stricasiRNA的樣品strica的表達水平極顯著下調(diào)了約80%(P<0.01)，表明該siRNA的有效性(圖4: A)；Western blot檢測結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染了非特異性siRNA的蛋白樣品相比，轉(zhuǎn)染了stricasiRNA的蛋白樣品在55 kD處的條帶變?nèi)?，該條帶符合Strica蛋白的理論分子量(圖4: B)。免疫熒光實驗表明，轉(zhuǎn)染了非特異性siRNA后，Strica在S2細胞的細胞質(zhì)中呈現(xiàn)點狀分布，轉(zhuǎn)染了stricasiRNA后亮度變?nèi)?圖4: C)。結(jié)果說明制備的Strica蛋白多克隆抗體能夠用于檢測果蠅細胞內(nèi)源的Strica蛋白。

圖4 Strica多克隆抗體對果蠅S2細胞內(nèi)源Strica蛋白的檢測Fig. 4 Endogenous Strica protein in Drosophila S2 cells detected by Strica polyclonal antibodyA: RT-qPCR檢測strica siRNA的下調(diào)Down-regulation of strica siRNA detected by RT-qPCR; B: 通過Western blot利用anti-Strica抗體檢測strica siRNA的下調(diào)Down-regulation of strica siRNA detected by anti-Strica antibody using Western blot; C: anti-Strica抗體檢測Strica蛋白亞細胞定位Subcellular localization of Strica detected by anti-Strica antibody. 1: 非特異siRNA組Non-specific siRNA group; 2: strica siRNA組strica siRNA group; DAPI: 細胞核染料Nuclear dye; Strica: anti-Strica抗體 anti-Strica antibody; Merge: 前兩圖的合并Merge of the former two pictures. A圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上雙星號表示差異顯著(P<0.01, t檢驗)。圖5同。Data in Fig. A are mean±SE. Double asterisk above bars indicates significant difference (P<0.01, t-test). The same for Fig. 5.

2.4 放線菌酮誘導Strica的切割激活

與加入caspase抑制劑z-VAD-FMK的相比，放線菌酮處理后，S2細胞的caspase活性極顯著升高(P<0.01)，提前加入caspase的抑制劑z-VAD-FMK caspase活性被抑制(圖5: A)；Western blot結(jié)果顯示Strica蛋白在放線菌酮處理后發(fā)生了切割，切割的條帶大小對應Strica蛋白的原結(jié)構(gòu)域加大亞基位置，z-VAD-FMK加入后又被抑制(圖5: B)。結(jié)果表明，放線菌酮誘導Strica的切割激活過程中。

圖5 放線菌酮(10 μg/mL)誘導果蠅S2細胞中Strica的切割激活Fig. 5 Cycloheximide (10 μg/mL) induced the cleavage activation of Strica in Drosophila S2 cellsA: Caspase活性測試Caspase activity test; B: anti-Strica抗體檢測Strica蛋白的切割Detection of the cleavage of Strica using the anti-Strica antibody. RFU: 相對熒光單位Relative fluorescence unit; 1: DMSO+z-VAD-FMK (CK1); 2: DMSO (CK2); 3: CHX+z-VAD-FMK; 4: 放線菌酮Cycloheximide (CHX); z-VAD-FMK: Caspase抑制劑Caspase inhibitor.

3 討論

目前缺少Strica商業(yè)化抗體，只能通過細胞水平的過表達、雜交和同源重組等間接體系操作。本研究成功制備了高特異性的兔抗果蠅Strica蛋白的多克隆抗體(圖2-4)，利用該抗體檢測發(fā)現(xiàn)Strica可以響應放線菌酮誘導的細胞凋亡(圖5)。我們的前期鑒定到白紋伊蚊Aedesalbopictus中Strica的一個同源蛋白AaCASPS16參與放線菌素D和紫外線誘導的細胞凋亡(Mengetal., 2016)，這與我們的研究結(jié)果一致；前期異源表達哺乳動物細胞293T的Strica定位在細胞質(zhì)(Doumanisetal., 2001)，這與本研究的散點亞細胞定位這一結(jié)果不同，原因可能是細胞系、圖像分辨率以及抗體存在差別，我們在果蠅細胞中利用內(nèi)源性抗體，通過共聚焦顯微鏡觀察到的Strica定位更接近于生理條件。

雖然我們的結(jié)果表明Strica可響應刺激物放線菌酮的激活，但該caspase在細胞中的激活切割方式、生化功能、以及上下游的信號通路并不清楚。Strica具有一個長的富含絲氨酸和蘇氨酸的原結(jié)構(gòu)域，在激活過程中很可能受到糖基化和磷酸化等翻譯后修飾的影響。未來可以用該抗體進行免疫沉淀，通過質(zhì)譜鑒定其互作蛋白和原結(jié)構(gòu)域中的修飾位點，從而研究其激活方式以及生理功能。本研究制備的Strica多克隆抗體為進一步研究Strica的細胞凋亡、生長發(fā)育以及先天免疫功能奠定了實驗基礎(chǔ)。