胡 穎, 張文德, 王思懿, 張凱遙, 任中民, 吉 挺, 藺哲廣, 趙紅霞, 陳大福,2,*, 郭 睿,2,*

(1. 福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院), 福州 350002; 2. 福建省蜂療研究所, 福州 350002; 3. 揚州大學動物科學與技術(shù)學院, 江蘇揚州 225000; 4. 廣東省科學院動物研究所, 廣州 510260)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類小非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)，在轉(zhuǎn)錄后水平上負調(diào)控基因表達(Bartel, 2004)。 在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans中，首次發(fā)現(xiàn)的miRNA(lin-4)和稍后鑒定到的let-7均被證實參與調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲的發(fā)育進程(Leeetal., 1993; Roush and Slack, 2008)。前人對西方蜜蜂Apismellifera的miRNA進行過較多研究，主要涉及極型分化(Guoetal., 2013; Ashbyetal., 2016)和蜂王產(chǎn)卵行為等生物學過程(Chenetal., 2017)。但對西方蜜蜂幼蟲的miRNA研究較為滯后，相關(guān)功能研究更為匱乏。蜜蜂腸道是消化食物、吸收營養(yǎng)和免疫防御的關(guān)鍵部位(梁勤和陳大福, 2009)。前人關(guān)于蜜蜂腸道的研究主要集中在成年蜜蜂的腸道微生物方面(Engeletal., 2013; Ellegaardetal., 2015)。

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(簡稱“意蜂”)是西方蜜蜂的優(yōu)良亞種，也是我國養(yǎng)蜂生產(chǎn)使用的主要蜂種，具有群勢大、產(chǎn)量高及繁殖力強等優(yōu)點。前期研究中，筆者團隊全面解析了意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道發(fā)育過程的差異基因表達譜(郭睿等, 2018)，系統(tǒng)鑒定了幼蟲腸道中的miRNA(熊翠玲等, 2018)，并揭示了差異miRNA在腸道發(fā)育中的潛在調(diào)控作用(郭睿等, 2018)。miR-bantam在岡比亞按蚊Anophelesgambiae、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster等昆蟲中的研究已見諸報道(Liangetal., 2013; Biryukovaetal., 2014; Wuetal., 2017)。Nolo等(2006)曾對果蠅的miR-bantam進行過表達，發(fā)現(xiàn)Yorkie突變細胞的生長缺陷發(fā)生改變，同時因Hippo過度活化而誘導的細胞死亡受到抑制。此外，miR-bantam還能調(diào)節(jié)表皮生長因子及MAPK和Hippo信號通路進而調(diào)控果蠅生長發(fā)育(Herranzetal., 2012)。此前，人們對意大利蜜蜂和中華蜜蜂Apisceranacerana的miR-bantam進行過研究，發(fā)現(xiàn)其豐度在不同蜂種、不同日齡幼蟲的王漿中均有顯著差異(Shietal., 2012; Guoetal., 2013)，其表達量在西方蜜蜂蜂王、工蜂和雄蜂幼蟲中也具有明顯差異(Ashbyetal., 2016)，表明miR-bantam潛在參與調(diào)控西方蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育。

變態(tài)發(fā)育是昆蟲適應(yīng)生態(tài)環(huán)境和氣候變化的主要生存策略之一，超氣門蛋白(ultraspiracle protein, USP)作為蛻皮激素作用的受體，與昆蟲發(fā)育密切相關(guān)(柳鵬飛等, 2021)。家蠶Bombyxmori和斜紋夜蛾P(guān)rodenialitura中USP在幼蟲-蛹變態(tài)過程中高量表達(黃明霞等, 2014)。Chavoshi等(2010)研究表明USP在果蠅的胚胎發(fā)育及變態(tài)發(fā)育中起到重要作用。在梨小食心蟲Grapholithamolesta中，USP表達水平降低可導致變態(tài)過程中化蛹時間延長、蛹死亡率升高(Caoetal., 2015)。Wnt信號通路在生物體的進化過程中高度保守，參與調(diào)控胚胎的生長和形態(tài)發(fā)育，能量代謝平衡，組織的穩(wěn)定性及干細胞維持等諸多生物學過程，本研究中，P300可注釋到Wnt信號通路。

筆者所在團隊前期已通過small RNA-seq(sRNA-seq)對意大利蜜蜂4-6日齡工蜂幼蟲腸道進行測序，共鑒定到515個保守miRNA和45個新miRNA(熊翠玲等, 2018)，解析了miRNA的差異表達譜(郭睿等, 2018)，驗證了ame-miR-bantam的表達和序列真實性，并檢測了ame-miR-bantam在蛹期發(fā)育過程的表達譜(祝智威等, 2022)。目前，意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道組織中ame-miR-bantam與USP和P300之間是否存在靶向關(guān)系，以及ame-miR-bantam如何調(diào)控USP和P300表達尚不清楚。本研究通過飼喂法對前期鑒定到的ame-miR-bantam進行過表達及敲減，預測和分析其靶基因，進而檢測靶基因USP和P300的表達量動態(tài)變化，以期明確ame-miR-bantam與USP和P300間的調(diào)控關(guān)系。研究結(jié)果可為探究ame-miR-bantam通過調(diào)控USP和P300表達影響意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道發(fā)育的分子機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

意大利蜜蜂工蜂幼蟲取自福建省福州市倉山區(qū)上下店路15號福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院)教學蜂場的飼養(yǎng)蜂群。

1.2 工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam的過表達和敲減

根據(jù)祝智威等(2022)的方法，委托北京擎科生物科技有限公司設(shè)計合成ame-miR-bantam的模擬物mimic-ame-miR-bantam和抑制物inhibitor-ame-miR-bantam, 及其對應(yīng)的陰性對照mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam，序列信息見表1。參照筆者團隊前期建立的技術(shù)流程(Chenetal., 2017)進行意大利蜜蜂工蜂幼蟲的人工飼養(yǎng)與腸道樣品制備：(1)挑選群勢較強且無白堊病癥狀的意大利蜜蜂蜂群，限王產(chǎn)卵后用移蟲針將脾上2日齡工蜂幼蟲移至預置50 μL飼料(蜂王漿50%，葡萄糖6%，果糖6%，酵母粉1%，無菌水37%)的48孔細胞培養(yǎng)板中，放入溫度35±0.5℃和相對濕度(RH)90%的恒溫恒濕箱，每組準備24頭幼蟲供后續(xù)實驗；(2)分別配制含mimic-ame-miR-bantam, inhibitor-ame-miR-bantam, mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam的飼料，終濃度均為25 pmol/g，用于飼喂3日齡幼蟲，每24 h補加50 μL飼料；(3)在超凈工作臺中分別剖取4-6日齡工蜂幼蟲腸道，每3只腸道樣品置于一個RNA-Free EP管為1個生物學重復，經(jīng)液氮速凍后立即轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，每組設(shè)3個生物學重復。

表1 ame-miR-bantam的模擬物和抑制物及其對應(yīng)的陰性對照序列Table 1 Sequences of the mimic and inhibitor and their corresponding negative controls of ame-miR-bantam

1.3 ame-miR-bantam的過表達和敲減效果檢測

根據(jù)ame-miR-bantam的核酸序列設(shè)計特異性的Loop引物和上下游引物(表2)。 通過RT-qPCR檢測1.2節(jié)飼喂含mimic-ame-miR-bantam, inhibitor-ame-miR-bantam, mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam飼料后工蜂幼蟲腸道組織中ame-miR-bantam的相對表達量： (1)使用RNA提取試劑盒(諾唯贊，南京)分別提取mimic-ame-miR-bantam組、inhibitor-ame-miR-bantam組、mimic-NC-ame-miR-bantam組和inhibitor-NC-ame-miR-bantam組4-6日齡工蜂幼蟲腸道樣品的總RNA；(2)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Yeasen，上海)和Loop引物反轉(zhuǎn)錄得到ame-miR-bantam的cDNA，另使用olig(dT)與隨機引物反轉(zhuǎn)錄得到內(nèi)參U6的cDNA；(3)使用ABI QuantStudio 3熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI公司，美國)進行RT-qPCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Green Dye 10 μL, 上下游引物(2.5 pmol/μL)各1 μL, cDNA模板1 μL, DEPC水7 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 59℃ 45 s, 72℃ 20 s, 40個循環(huán)。引物信息見表2。每個生物學重復進行3次技術(shù)重復。

表2 RT-qPCR引物信息Table 2 Primer information for RT-qPCR

1.4 ame-miR-bantam的靶基因預測及分析

聯(lián)用TargetScan(Version: 7.0), Miranda(v3.3a)和RNAhybrid(v2.1.2)+svm_light(v6.01)3種軟件預測ame-miR-bantam的靶mRNA，將預測結(jié)果的交集作為可信度高的靶mRNA集合，再根據(jù)靶mRNA的Nr數(shù)據(jù)庫(ftp:∥ftp.ncbi.nih.gov/blast/db)注釋得到靶基因集合。進一步利用Blast工具將上述靶基因比對到GO(http:∥www.geneontology.org/)和KEGG(http:∥www.genome.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫以獲得相應(yīng)的注釋信息。

1.5 ame-miR-bantam靶基因的相對表達量檢測

根據(jù)1.4節(jié)預測到的靶基因的Nr和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋信息，同時參考其他昆蟲物種的相關(guān)研究報道(Koles and Budnik, 2012; Swarup and Verheyen, 2012; Browningetal., 2021)，挑選與生長發(fā)育密切相關(guān)的靶基因P300和USP進行進一步研究。利用Adobe Illustrate軟件(Adobe公司，美國)分別繪制ame-miR-bantam與靶基因P300和USPmRNA的結(jié)合關(guān)系示意圖。通過RT-qPCR檢測靶基因P300和USP在過表達和敲減ame-miR-bantam后4-6日齡工蜂幼蟲腸道中的相對表達量，以肌動蛋白基因actin(GenBank登錄號: AB023025.1)作為內(nèi)參基因，引物信息見表2。RT-qPCR同1.3節(jié)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過GraphPad Prism 8軟件繪制miRNA和靶mRNA表達趨勢圖。使用Student氏t檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，以P<0.05為差異顯著性閾值。

2 結(jié)果

2.1 意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam的敲減和過表達效果

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示(圖1)，相較于飼喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam的陰性對照組，inhibitor-ame-miR-bantam飼喂組4日齡工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam的表達量顯著下調(diào)(P<0.01)，5和6日齡工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam下調(diào)表達(P>0.05)。相較于飼喂mimic-NC-ame-miR-bantam的陰性對照組，mimic-ame-miR-bantam飼喂組4-6日齡工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam的表達量皆顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖1 過表達和敲減ame-miR-bantam后意大利蜜蜂4日齡(A, D)、5日齡(B, E)和6日齡(C, F)工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam的相對表達量Fig. 1 Relative expression levels of ame-miR-bantam in the larval gut of the 4-day-old (A, D), 5-day-old (B, E) and 6-day-old (C, F) workers of Apis mellifera ligustica after overexpression and knockdown of ame-miR-bantam給工蜂飼喂mimic-ame-miR-bantam和inhibitor-ame-miR-bantam分別進行ame-miR-bantam的過表達和敲減，以飼喂mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam的工蜂分別作為對應(yīng)的陰性對照。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上符號表示兩組間的差異顯著性(nsP>0.05; *P<0.05; **P<0.01)(Student氏t檢驗)。圖4和5同。Mimic-ame-miR-bantam and inhibitor-ame-miR-bantam were fed to workers to perform overexpression and knockdown of ame-miR-bantam, respectively, and workers fed with mimic-NC-ame-miR-bantam and inhibitor-NC-ame-miR-bantam, respectively, were used as their corresponding negative controls. Data in the figure are mean±SE. Symbols above bars indicate the significance of difference between two groups (nsP>0.05; *P<0.05; **P<0.01)(Student’s t-test). The same for Figs. 4 and 5.

2.2 ame-miR-bantam的靶基因

靶向預測結(jié)果顯示ame-miR-bantam共靶向506條mRNA，對應(yīng)222個靶基因，這些靶基因可注釋到細胞進程(cellular process)、應(yīng)激反應(yīng)(response to sitimulus)和生物學過程調(diào)控(regulation of biological process)等35個GO條目(圖2: A)，以及Wnt, Hippo和Notch信號通路等160條KEGG通路(圖2: B)。

圖2 意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam靶基因的GO(A)和KEGG(B)注釋Fig. 2 GO (A) and KEGG (B) annotation of target genes of ame-miR-bantam in the larval gut of Apis mellifera ligustica workers

2.3 ame-miR-bantam敲減和過表達后靶基因USP和P300的表達量變化

ame-miR-bantam的“種子區(qū)”與靶基因USP和P300的mRNA特定區(qū)域的堿基配對結(jié)合關(guān)系如圖3所示。

圖3 意大利蜜蜂工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam與靶基因P300(A)和USP(B)相應(yīng)mRNA的結(jié)合關(guān)系Fig. 3 Binding relationship between ame-miR-bantam and the corresponding mRNAs targeting P300 (A) and USP (B) in the larval gut ofApis mellifera ligustica workers

RT-qPCR結(jié)果顯示，相較于飼喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam的陰性對照組，inhibitor-ame-miR-bantam飼喂組4和5日齡工蜂幼蟲腸道中USP(GenBank登錄號: NM_001011634.2)上調(diào)表達(P>0.05)，6日齡工蜂幼蟲腸道中USP顯著上調(diào)表達(P<0.01)(圖4: A-C)；相較于飼喂mimic-NC-ame-miR-bantam的陰性對照組，mimic-ame-miR-bantam飼喂組4日齡工蜂幼蟲腸道中USP的表達量呈上調(diào)趨勢(P>0.05)，5日齡工蜂幼蟲腸道中USP的表達量下調(diào)(P>0.05)， 6日齡工蜂幼蟲腸道中USP顯著下調(diào)表達(P<0.01)(圖4: D-F)。

與飼喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam的陰性對照組相比，inhibitor-ame-miR-bantam飼喂組的4-6日齡工蜂幼蟲腸道中P300(GenBank登錄號: XM_006568834.2)的表達量均為上調(diào)(P>0.05)(圖5: A-C)；相較于飼喂mimic-NC-ame-miR-bantam的陰性對照組，mimic-ame-miR-bantam飼喂組的4日齡工蜂幼蟲腸道中P300上調(diào)表達(P>0.05)，而5和6日齡工蜂幼蟲腸道中P300顯著下調(diào)表達(P<0.05)(圖5: D-F)。

圖5 敲減和過表達ame-miR-bantam后意大利蜜蜂4日齡(A, D)、5日齡(B, E)和6日齡(C, F)工蜂幼蟲腸道中靶基因P300的相對表達量Fig. 5 Relative expression levels of the target gene P300 in the larval gut of the 4-day-old (A, D), 5-day-old (B, E) and 6-day-old (C, F) workers of Apis mellifera ligustica after knockdown and overexpression of ame-miR-bantam

3 討論

筆者團隊前期通過Stem-loop RT-PCR和Sanger測序證實了ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹期的真實存在和表達(祝智威等, 2022)。本研究利用含模擬物或抑制物的飼料飼喂意大利蜜蜂工蜂3日齡幼蟲，RT-qPCR結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，飼喂mimic-ame-miR-bantam后ame-miR-bantam在4-6日齡工蜂幼蟲腸道中皆顯著上調(diào)表達(圖1: D-F)；飼喂inhibitor-ame-miR-bantam后ame-miR-bantam在4日齡工蜂幼蟲腸道中顯著下調(diào)表達，在5和6日齡工蜂幼蟲腸道中下調(diào)表達(圖1: A-C)，說明通過飼喂模擬物和抑制物能分別有效實現(xiàn)意蜂工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam的過表達和敲減。此前，筆者所在團隊通過飼喂相應(yīng)的模擬物和抑制物對意蜂工蜂幼蟲腸道中的ame-miR-13b分別進行了有效過表達和敲減。以上結(jié)果共同為深入開展意蜂工蜂幼蟲的miRNA功能研究提供了可靠的理論依據(jù)和技術(shù)保障。

研究表明miR-bantam在果蠅和小菜蛾等昆蟲的幼蟲發(fā)育等方面起到重要的調(diào)控作用(Liangetal., 2013)。Guo等(2013)研究發(fā)現(xiàn)ame-miR-bantam可參與調(diào)節(jié)西方蜜蜂的級型分化。本研究中，靶向預測結(jié)果顯示ame-miR-bantam共靶向222個基因，上述靶基因可注釋到35個GO條目，包括與生長發(fā)育有關(guān)的細胞進程、應(yīng)激反應(yīng)和生物學過程調(diào)控等；此外還能注釋到160條KEGG通路，包括與生長發(fā)育密切相關(guān)的Wnt, Hippo和Notch等信號通路等(圖2)。以上結(jié)果說明ame-miR-bantam潛在參與調(diào)控意蜂工蜂幼蟲腸道的生長發(fā)育。

昆蟲幼蟲的發(fā)育受到蛻皮激素的嚴格調(diào)控，蛻皮激素作用的靶點由蛻皮激素受體(ecdysteroid receptor, EcR)和USP組成，蛻皮激素與EcR/USP二聚體相互作用，進而結(jié)合蛻皮激素反應(yīng)因子(ecdysteroid response element, EcRE)以控制基因的轉(zhuǎn)錄(Browningetal., 2021)。本研究發(fā)現(xiàn)ame-miR-bantam與USP之間存在潛在的靶向結(jié)合關(guān)系；與陰性對照組相比，過表達ame-miR-bantam后，5日齡工蜂幼蟲腸道中USP的表達量下調(diào)，6日齡工蜂幼蟲腸道中USP的表達量顯著下調(diào)(圖4: E, F)；敲減ame-miR-bantam后，USP在4和5日齡工蜂幼蟲腸道中上調(diào)表達，在6日齡工蜂幼蟲腸道中顯著上調(diào)表達(圖4: A-C)。這表明ame-miR-bantam可負調(diào)控意蜂工蜂幼蟲腸道中USP的表達。但是否調(diào)節(jié)蛻皮激素并影響意蜂工蜂幼蟲腸道發(fā)育需要進一步研究。此前，祝智威等(2022)研究發(fā)現(xiàn)敲減ame-miR-13b后意蜂6日齡工蜂幼蟲腸道中Ecr顯著上調(diào)表達。這些結(jié)果共同表明ame-miR-bantam與ame-miR-13b可協(xié)同靶向調(diào)控USP和Ecr表達進而調(diào)節(jié)意蜂工蜂幼蟲腸道的發(fā)育過程。

Wnt信號通路在人類和果蠅等動物的組織和器官發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Katoh, 2005; Swarupand Verheyen, 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，ame-miR-bantam與Wnt信號通路上的P300基因存在潛在的靶向結(jié)合關(guān)系，與陰性對照組相比，過表達ame-miR-bantam后，P300表達量在5和6日齡工蜂幼蟲腸道中均顯著下調(diào)(圖5: E, F)；敲減ame-miR-bantam后，4-6日齡工蜂幼蟲腸道中P300的表達量均為上調(diào)(圖5: A-C)。這些結(jié)果表明ame-miR-bantam對意蜂工蜂幼蟲腸道中P300的表達具有負調(diào)控作用。推測ame-miR-bantam通過負調(diào)控P300的表達調(diào)節(jié)Wnt信號通路進而影響意蜂工蜂幼蟲腸道發(fā)育。

通過飼喂模擬物和抑制物能夠分別實現(xiàn)意大意蜜蜂工蜂幼蟲腸道中ame-miR-bantam的有效過表達和敲減；幼蟲腸道中ame-miR-bantam對USP和P300的表達可能具有負調(diào)控作用。