魏多前，單璞，張轉(zhuǎn)，郝少杰，王志標(biāo)，李樹香，徐靜

國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司第三研究室，北京 101111

佐劑能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，在疫苗尤其是亞單位疫苗的研發(fā)中至關(guān)重要。目前佐劑的研發(fā)處于快速發(fā)展階段，其類型多樣，按作用方式可分為免疫刺激分子、遞送系統(tǒng)及復(fù)合佐劑等［1］。但佐劑在增強(qiáng)免疫原性的同時可能存在潛在的反應(yīng)原性問題。安全性是佐劑開發(fā)中首要考慮的問題，因此關(guān)注其反應(yīng)原性十分必要。

反應(yīng)原性被定義為疫苗接種后的急性炎癥反應(yīng)，通常發(fā)生在疫苗接種后的幾天內(nèi)，可引起局部反應(yīng)原性（如紅斑、腫脹或疼痛），但當(dāng)促炎因子（如IL-1β）、趨化因子以及前列腺素E2（prostaglandin E-2，PGE2）以足夠的水平進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)時，可能引發(fā)全身反應(yīng)原性（如發(fā)燒、肌痛、頭痛和流感樣癥狀）［2-3］。不同佐劑的作用方式以及免疫刺激能力不同，誘導(dǎo)的反應(yīng)原性可能不同，因此，在體內(nèi)或體外監(jiān)測炎癥因子水平可用于評估佐劑可能引起的潛在安全性問題。

IL-8（CXCL-8）主要參與中性粒細(xì)胞的募集活化，在急性肝衰竭和嚴(yán)重急性肝損傷患者中顯著升高［4］。干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-induced protein-10，IP-10）主要參與免疫細(xì)胞至炎癥部位的募集，在HIV 感染時血清IP-10 水平異常升高［5］。IL-1β 被稱為體內(nèi)致熱源，是一種促炎性細(xì)胞因子，參與多種自身免疫性炎癥反應(yīng)［6］。單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP-1）是參與調(diào)控單核細(xì)胞趨化和T淋巴細(xì)胞分化的趨化因子，在炎癥性疾病、動脈粥樣硬化和癌癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。

THP-1 細(xì)胞來源于人急性白血病患者單核細(xì)胞，是人外周血單核細(xì)胞系，為懸浮細(xì)胞，在體外易培養(yǎng)，可被佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，分泌炎癥因子，如IL-1β、IL-8等，目前廣泛應(yīng)用于免疫和炎癥的相關(guān)研究［8-10］。本研究以THP-1 細(xì)胞為模型，建立一種體外檢測方法，用于評價不同佐劑誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8、IP-10、IL-1β 及MCP-1 的水平。以期建立一種能夠快速評價佐劑誘導(dǎo)炎癥因子水平的體外方法，結(jié)合體內(nèi)免疫增強(qiáng)作用考察其相關(guān)性，探究免疫增強(qiáng)作用與反應(yīng)原性二者之間的關(guān)系，為疫苗佐劑開發(fā)早期階段候選物的篩選及配方優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 THP-1細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技公司。

1.2 主要試劑及儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；胎牛血清及雙抗（青霉素／鏈霉素）購自美國Hyclone公司；PMA購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Toll 樣受體（toll-like receptors，TLR）2激動劑類佐劑Pam2CSK4和TLR4激動劑類佐劑LPSB5購自美國InvivoGen 公司；細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院；乳劑類佐劑MF59和AS03為本研究室自制（配方同Novartis MF59和GSK AS03）；Human IL-8、Human IP-10、Human IL-1β 和Human MCP-1 ELISA 試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司；酶標(biāo)儀和細(xì)胞培養(yǎng)箱均購自美國Thermo公司。

1.3 方法的建立 用含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗（青霉素／鏈霉素）的RPMI1640 培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)THP-1細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%左右時，重懸細(xì)胞，190 ×g離心5 min，棄上清，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至工作細(xì)胞密度，加入24孔板中，1 mL／孔，再加入PMA共刺激。以細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品+PMA為陽性對照組，只加PMA為陰性對照組。刺激完成后，860 ×g離心30 min，取上清，用ELISA試劑盒檢測各種炎癥因子。

1.4 條件優(yōu)化

1.4.1 PMA 刺激濃度及培養(yǎng)時間的優(yōu)化 PMA 濃度分別設(shè)為25、5、1、0.1 ng／mL，設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品+ PMA 以及單PMA 刺激組，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。分別于4、16、24 h 取上清，檢測IL-8、IP-10、IL-1β 及MCP-1的含量。

1.4.2 細(xì)胞密度的優(yōu)化 細(xì)胞密度分別選擇1×105、5×105、1×106個／mL，設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品+PMA以及單PMA刺激組，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。取上清，檢測IL-8、IP-10、IL-1β及MCP-1的含量。

1.5 不同濃度細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品刺激THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥因子水平的檢測 細(xì)胞密度長至80%左右時，重懸細(xì)胞，190×g離心5 min，棄上清，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至工作細(xì)胞密度，加入96孔板中，180 μL／孔，再加入PMA及不同濃度細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（0、0.125、0.5、1、5、10、20、50 EU／mL）共刺激，20 μL／孔，每組設(shè)2 個復(fù)孔。刺激完成后，860×g離心30 min，取上清，檢測IL-8、IP-10、IL-1β及MCP-1的含量。

1.6 不同佐劑刺激THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥因子水平的檢測 細(xì)胞密度長至80%左右時，重懸細(xì)胞，190×g離心5 min，棄上清，用RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋至工作細(xì)胞密度，加入96 孔板中，180 μL／孔，再加入PMA及不同佐劑（TLR 類佐劑設(shè)0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、100 μg／mL 9 個濃度，乳劑類佐劑設(shè)0、0.25、0.5倍稀釋及原倍4個濃度）共刺激，佐劑20 μL／孔，每組設(shè)2 個復(fù)孔。以細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（設(shè)10 和50 EU／mL 2 個濃度）+ PMA 為陽性對照組。刺激完成后，860×g離心30 min，取上清，檢測IL-8、IP-10、IL-1β及MCP-1的含量。

1.7 結(jié)果處理 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果

2.1 最佳檢測條件

2.1.1 PMA 濃度及培養(yǎng)時間的確定 不同炎癥因子的PMA 最佳刺激濃度和培養(yǎng)時間不同。PMA 濃度為25 ng／mL 時培養(yǎng)4、16、24 h 以及PMA 濃度為5、1 ng／mL時培養(yǎng)16、24 h，均誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-8，但陰性對照A450較高（＞0.5）；PMA濃度為0.1 ng／mL培養(yǎng)16 h時陰性對照A450較低，且陽性對照有高水平應(yīng)答。見圖1A。因此確定誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8 的最佳PMA濃度為0.1 ng／mL，培養(yǎng)時間為16 h。

培養(yǎng)時間為4 h時，4個PMA濃度誘導(dǎo)產(chǎn)生的IP-10水平均較低；培養(yǎng)時間為24 h，PMA濃度為25、5 ng／mL時，陰性對照本底A450較高（＞0.5），PMA濃度為1 ng／mL培養(yǎng)16 或24 h 時，陰性對照本底較低，且陽性對照應(yīng)答相對較高。見圖1B。因此確定誘導(dǎo)產(chǎn)生IP-10的最佳PMA濃度為1 ng／mL，培養(yǎng)時間為16 h。

PMA 濃度為25、5 ng／mL 時培養(yǎng)24 h，均誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-1β，但陰性對照A450較高（＞0.2）；PMA 濃度為5 ng／mL 時培養(yǎng)4 h，陰性對照本底較低，且陽性對照應(yīng)答相對較高。見圖1C。因此確定誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β 的最佳PMA 濃度為5 ng／mL，培養(yǎng)時間為4 h。

培養(yǎng)時間為4、16 h時，誘導(dǎo)產(chǎn)生較低水平的MCP-1；培養(yǎng)時間為24 h，PMA濃度為25、5 ng／mL時，陰性對照本底A450較高（＞0.2）；PMA 濃度為1 ng／mL 時培養(yǎng)16或24 h，陰性對照本底較低，陽性對照應(yīng)答相對較高。見圖1D。因此確定誘導(dǎo)產(chǎn)生MCP-1 的最佳PMA濃度為1 ng／mL，培養(yǎng)時間為24 h。

圖1 不同PMA 濃度及時間誘導(dǎo)IL-8（A）、IP-10（B）、IL-1β（C）、MCP-1（D）的A450值Fig.1 A450 values of IL-8（A），IP-10（B），IL-1β（C）and MCP-1（D）induced with various concentrations of PMA for various incubation times

2.1.2 細(xì)胞密度的確定 不同炎癥因子的分泌水平與細(xì)胞密度成正相關(guān)，隨著細(xì)胞密度的增加而升高。細(xì)胞密度為1×106個／mL 時，能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-8、IP-10、IL-1β 及MCP-1，且陰性對照本底較低。見圖2。因此確定1×106個／mL為最佳細(xì)胞密度。

圖2 不同細(xì)胞密度誘導(dǎo)IL-8（A）、IP-10（B）、IL-1β（C）、MCP-1（D）的A450值Fig.2 A450 values of IL-8（A），IP-10（B），IL-1β（C）and MCP-1（D）induced with various cell densities

2.2 不同濃度細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品刺激THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥因子水平 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度大于1 EU／mL時，IL-8 和IP-10 的分泌水平開始上升，且隨濃度升高而增強(qiáng)，其中IP-10 的分泌水平最強(qiáng)，10 EU／mL時分泌量約300 pg／mL；細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度大于5 EU／mL 時，MCP-1 和IL-1β 的分泌水平開始上升，隨濃度升高而增強(qiáng)，且MCP-1 和IL-1β 的分泌水平低于IL-8。見圖3。

圖3 不同濃度細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)IL-8（A）、IP-10（B）、IL-1β（C）、MCP-1（D）水平Fig.3 Levels of IL-8（A），IP-10（B），IL-1β（C）and MCP-1（D）induced by various concentrations of bacterial endotoxin standard

2.3 不同佐劑刺激THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥因子水平

2.3.1 TLR 激動劑類佐劑 Pam2CSK4 和LPS-B5 在較低濃度（0.001 μg／mL）即可誘導(dǎo)產(chǎn)生各類因子。Pam2CSK4 大于0.001 μg／mL 即可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-8、IP-10、IL-1β 及MCP-1，其中0.001 μg／mL Pam2CSK4誘導(dǎo)的IL-8和IP-10水平略高（或相當(dāng)）于50 EU／mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平，0.1 μg／mL誘導(dǎo)的IL-1β水平略高于50 EU／mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平，0.005 μg／mL誘導(dǎo)的MCP-1水平高于50 EU／mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平。LPS-B5 在0.001 μg／mL時誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1水平與10 EU／mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平相當(dāng)，誘導(dǎo)的IP-10 和IL-1β 水平低于10EU／mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平，在0.001～100μg／mL時誘導(dǎo)的各因子水平基本在10 ～50 EU／mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平之間?？傮w上，在0.001 ～100 μg／mL范圍內(nèi)LPS-B5 誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子水平低于Pam2-CSK4。見圖4。

圖4 TLR激動劑類佐劑誘導(dǎo)IL-8（A）、IP-10（B）、IL-1β（C）、MCP-1（D）的水平Fig.4 Levels of IL-8（A），IP-10（B），IL-1β（C）and MCP-1（D）induced by TLR agonist type adjuvants

2.3.2 乳劑類佐劑 MF59 和AS03 誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-8、IP-10、IL-1β、MCP-1 基本在40 pg／mL 以內(nèi)，其中誘導(dǎo)的IL-8 和IP-10 水平均低于10 EU／mL 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平，而MF59（原倍）誘導(dǎo)的IL-1β和MCP-1水平與10 EU／mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平相當(dāng)?？傮w上，MF59和AS03誘導(dǎo)產(chǎn)生較低水平的IL-8、IP-10、IL-1β、MCP-1。見圖5。

圖5 乳劑類佐劑誘導(dǎo)IL-8（A）、IP-10（B）、IL-1β（C）、MCP-1（D）水平Fig.5 Levels of IL-8（A），IP-10（B），IL-1β（C）and MCP-1（D）induced by emulsion type adjuvants

續(xù)圖5 乳劑類佐劑誘導(dǎo)IL-8（A）、IP-10（B）、IL-1β（C）、MCP-1（D）水平Fig.5 （Continued）Levels of IL-8（A），IP-10（B），IL-1β（C）and MCP-1（D）induced by emulsion type adjuvants

3 討論

炎癥是人體自然免疫防御的一部分，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對于激發(fā)免疫系統(tǒng)至關(guān)重要。疫苗接種后首先在注射部位發(fā)生局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活并募集免疫細(xì)胞。佐劑可誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，導(dǎo)致更多免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、DC 以及中性粒細(xì)胞的募集和浸潤，進(jìn)而增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答［11］。研究表明，肌肉注射含佐劑系統(tǒng)的疫苗，注射后3 h 即可在注射部位檢測到細(xì)胞因子和趨化因子，大部分細(xì)胞因子和趨化因子在24 h 內(nèi)減少，并在72 h后恢復(fù)至基線水平［12］。

佐劑組合可表現(xiàn)出協(xié)同或拮抗作用，因此復(fù)合佐劑可能是增強(qiáng)免疫原性的有效方法。其中TLR 激動劑作為潛在復(fù)合佐劑組分是近年來關(guān)注的熱點。研究表明，人TLR 在多種組織中差異表達(dá)，巨噬細(xì)胞中未檢測到TLR9表達(dá)，原代單核細(xì)胞和MonoMac6 均不表達(dá)TLR7 和TLR9［13］。提示THP-1 細(xì)胞可能不適用于評價靶向這些受體的佐劑。

研究表明，已批準(zhǔn)的在臨床中顯示安全性良好的佐劑在人MonoMac6 細(xì)胞中不誘導(dǎo)或僅誘導(dǎo)極低水平的炎癥因子，而TLR 激動劑在一定的劑量范圍內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子［13］。這與本研究結(jié)果一致：MF59 和AS03 誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-8、IP-10、IL-1β、MCP-1基本低于10 EU／mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品誘導(dǎo)水平，而Pam-2CSK4（TLR2）和LPS-B5（TLR4）在0.001 μg／mL 即可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的炎癥因子。

LEROUX等［14］比較了不同佐劑與模式抗原HBsAg結(jié)合后的免疫原性和反應(yīng)原性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)原性水平與佐劑系統(tǒng)刺激先天反應(yīng)并促進(jìn)更高的HBs 特異性反應(yīng)有關(guān)，提示一定水平的炎癥反應(yīng)可觸發(fā)有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。但目前仍不清楚哪種炎癥水平是必需的，另外，如何量化炎癥水平以及利用體外生物標(biāo)記物來預(yù)測體內(nèi)反應(yīng)原性或免疫原性仍是一個需要探究的問題。

本研究利用THP-1 細(xì)胞易培養(yǎng)，可被誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，分泌炎癥因子的特點，建立了一種體外檢測方法，能夠快速評價不同佐劑體外誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8、IP-10、IL-1β、MCP-1 的水平。通過炎癥因子的水平反映佐劑本身引起的反應(yīng)原性，用于各種疫苗佐劑的早期篩選，可結(jié)合動物體內(nèi)免疫結(jié)果綜合評價其免疫增強(qiáng)作用及反應(yīng)原性。