方 媛, 潘晨陽, 李夢佳, 袁李亞男,王 盛, 程琳喬, 饒玉春

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

水稻(Oryzasativa.L)，禾本科稻屬，一年生單子葉植物，主要分布于亞洲和非洲的熱帶及亞熱帶地區(qū)，是中國及其他許多國家的主要糧食作物.據(jù)報道，世界上有半數(shù)以上的人口以水稻為主食，除去自然因素外，水稻病蟲害是影響水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一.水稻細菌性褐條病(rice bacterial brown stripe)，又被稱為水稻細菌性心腐病，是我國南方雙季稻區(qū)的常見病害，在浙江、江蘇、福建、貴州、湖南等省份均有分布[1].主要引起秧苗葉片和葉鞘上的褐色條斑，并伴有早穗、高穗、畸形穗、不實率增加等癥狀，嚴(yán)重時會使水稻心枯而死.在常見的水田中，感染RBSS的病株率為20%～25%，病害發(fā)生嚴(yán)重，幼苗死亡率可達60%以上[2].該病害最早于1956年在日本九州由Goto[3]發(fā)現(xiàn)，隨后幾十年一直是植物病理學(xué)家的研究熱點.我國最早報道水稻細菌性褐條病是在1975年，江西省修水縣發(fā)生百年特大洪水，雷國明[4]在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，大面積水淹區(qū)的早稻田發(fā)生細菌性褐條病.2008年，廣西合浦縣發(fā)生連日暴雨，局部地區(qū)晚稻發(fā)生嚴(yán)重細菌性褐條病，植株發(fā)病率高達56%，產(chǎn)量損失慘重[5].

目前，國內(nèi)外對水稻細菌性褐條病的研究主要集中在植物生理生化檢測及光學(xué)顯微鏡觀察水平上，在病原鑒定及致病機理上有少數(shù)報道，但對其分子生物學(xué)水平上的研究還尚不深入.

1 病原菌

水稻細菌性褐條病自1956年被發(fā)現(xiàn)以來，其病原菌的命名經(jīng)歷了多次演變，最初的報道將其認(rèn)定為丁香假單胞菌致病變種(Pseudomonassyringaepv.panici)，后經(jīng)過細菌學(xué)分類鑒定，將其確定為燕麥假單胞菌(Pseudomonasavenae).隨著研究者對細菌分類的不斷深入和完善，假單胞菌屬(Pseudomonas)中的非熒光菌獨立出來形成多個屬，其中avenae被歸入嗜酸菌屬(Acidovorax)并被命名為燕麥?zhǔn)人峋帑渷喎N(Acidovoraxavenaesub.avenae)，該亞種包含可引起麥類細菌性褐條病和引起水稻細菌性褐條病的2種病原，因此,將其中引起水稻褐條病的病原物確立為Acidovoraxoryzae，即水稻嗜酸菌[6].

燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N為革蘭氏陰性細菌，菌體單胞桿狀，大小為(0.9～2.5) μm×(0.5～1.0) μm，無芽孢、莢膜，極生鞭毛1～2根.在瓊脂培養(yǎng)基上菌落圓形、白色半透明隆起、邊緣整齊、表面光滑、無熒光[7].燕麥?zhǔn)乘峋帑渷喎N寄主多樣，還可侵染甘蔗、蝴蝶蘭等多種經(jīng)濟作物.

2 發(fā)病癥狀

水稻細菌性褐條病的發(fā)生與氣溫高低、稻苗受淹程度、生育期及品種抗性等因素有關(guān).侵害對象可包括幼苗、葉鞘、心葉、穗部、成株葉片等，且在水稻苗期至穗期均可能被侵害，具體見圖1.

圖1 水稻褐條病發(fā)病癥狀

褐條病主要在秧苗1～4葉期發(fā)生，幼苗受侵染后從第1片真葉萌發(fā)開始顯示癥狀.先在葉枕上出現(xiàn)褐色小斑，后擴展形成紫褐色長條斑，有時與葉片等長，邊緣清楚，發(fā)展到后期病苗枯萎或病葉脫落，導(dǎo)致植株停止生長甚至枯死.根據(jù)病原菌侵染部位的不同，褐條病的發(fā)病癥狀可分為3種：1)病原菌感染已伸長節(jié)部的較老葉片時為普通型，初期葉片與葉鞘交界處產(chǎn)生水漬狀褐色斑點，隨后沿中脈上下延伸成長條狀，最后全葉鞘呈現(xiàn)黃褐色水漬狀腐爛，嚴(yán)重時葉片失水縱卷枯黃；2)病原菌入侵節(jié)間未完全伸長的節(jié)部葉片時為伸長型，其葉片與葉脊的癥狀與普通型相似，但葉鞘基部下一節(jié)間會有明顯伸長，最終葉鞘大多腐爛枯死，病葉從葉鞘中部折斷而枯黃；3)病菌侵害剛露尖的心葉時為心腐型，病菌常從葉枕處侵入，發(fā)病初期導(dǎo)致稚嫩心葉產(chǎn)生水漬狀腐爛，后迅速上下擴展為深褐色長條，致使幼嫩葉鞘腐爛，心葉青卷，隨后變成褐色枯心[8].上述3種類型的病組織均極易折斷，用手?jǐn)D壓會溢出乳白色至淡黃色菌膿，A.oryzae菌液無味.

病株大多在抽穗前枯死，少數(shù)存活下來的病株常提早抽穗.孕穗期穗苞染病導(dǎo)致穗早枯，穗頸異常伸長，小穗梗淡褐色且彎曲畸形，谷粒呈褐色不實，部分稻穗或還未伸長就從劍葉葉枕下破葉鞘而出，或裹在葉鞘內(nèi)成“悶死胎”[7-8].

3 發(fā)病機制

水稻細菌性褐條病菌(A.avenaesub.avenae)致病過程復(fù)雜，有各種致病生化因子參與.研究者借助遺傳學(xué)手段發(fā)現(xiàn)各種胞外多糖、脂多糖、水解酶類、蛋白酶及各種毒素均參與了A.avenaesub.avenae的致病.目前研究發(fā)現(xiàn)，褐條病菌具有分泌多種效應(yīng)子的新型分泌系統(tǒng)——Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)，該系統(tǒng)通過精細的裝置將細菌分泌的蛋白運輸?shù)桨饣蛑苯舆\輸?shù)郊闹骷毎?，干擾或刺激寄主細胞的正常生命活動，從而調(diào)控寄主與病原菌之間的相互作用[9].

3.1 Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)

細菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)近幾年才被發(fā)現(xiàn)并成為研究熱點，它普遍存在于革蘭氏陰性致病菌中并與細菌的致病性有關(guān)，水稻細菌性褐條病菌也有T6SS.T6SS是由結(jié)構(gòu)蛋白、效應(yīng)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和分子伴侶蛋白構(gòu)成的蛋白復(fù)合體[10].典型的T6SS由IcmF,DotU等蛋白構(gòu)成的跨膜結(jié)構(gòu)橫跨于細菌的細胞內(nèi)膜-周質(zhì)-外膜[11].T6SS的結(jié)構(gòu)蛋白不僅包括編碼細胞內(nèi)增殖蛋白的IcmF和DotU，還包括脂蛋白ClpB AAA+ATP酶、外膜蛋白OmpA、溶血素共調(diào)節(jié)蛋白Hcp和纈氨酸-甘氨酸重復(fù)蛋白VgrG[12].目前有關(guān)T6SS影響細菌毒力的報道屢見不鮮，例如含有T6SS的副溶血性弧菌(Vibrio.parahemolyticus)與霍亂弧菌(V.cholerae)具有較強的致病毒性[9].2014年，單長林[13]在研究T6SS的效應(yīng)子VgrG蛋白時，通過同源重組敲除特定的基因獲得水稻細菌性褐條病菌的突變體，并證明了可通過調(diào)控T6SS的VgrG蛋白來控制水稻細菌性褐條病菌的致病性.Zhang等[14]也對T6SS的脂蛋白ClpB的功能進行了研究，發(fā)現(xiàn)clpB基因被敲除后能夠嚴(yán)重影響水稻細菌性褐條病菌RS-1菌株的生長、毒力和EPS合成，充分說明它在病菌的致病過程中發(fā)揮了重要作用.2017年，楊櫻子[15]進一步證實了T6SS 中pppA,clpB,hcp,dotU,icmF,impJ,imp和vgrG(1～8)共15個基因可能通過減少Hcp蛋白的分泌起到減弱毒力作用，清楚地揭示了T6SS在水稻細菌性褐條病菌致病機制中的作用.具體見圖2.

圖2 T6SS中不同功能的蛋白質(zhì)分類

3.2 生物膜

無論是在人工條件還是自然條件下，水稻細菌性褐條病菌都傾向于形成細菌生物膜而不是成為浮游細菌.生物膜是細菌性褐條病菌為了更好地適應(yīng)自身所處的環(huán)境所形成的，在生物膜上存在的一些胞外基質(zhì)如脂類、磷脂、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、多糖等使其可以附著于生物或非生物的表面，并聚集成群.Ibrahim等[16]研究A.avenaesub.avenae病菌外膜在體內(nèi)外蛋白的差異表達時發(fā)現(xiàn)外膜蛋白在褐條病菌發(fā)病過程中起著重要作用.生物膜就是細菌性褐條病菌抵抗外界不良環(huán)境的天然屏障，這使得病菌在侵害生物體時對宿主的防御系統(tǒng)具有天然的抵抗力，所以生物膜在水稻細菌性褐條病菌侵染植物體并完成病害循環(huán)中起到極其重要的作用[17].

3.3 胞外酶

水稻細菌性褐條病病菌在生命活動中會產(chǎn)生各種不同的胞外酶進入胞外基質(zhì)中，包括蛋白酶、胞外磷脂酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等降解酶[8]，這些降解酶通過降解植物原有的抗侵染物理屏障及在攝取宿主營養(yǎng)中起到非常重要的作用.陳磊[18]在2008年研究水稻黃單胞菌雙精氨酸運輸(Tat)系統(tǒng)關(guān)鍵基因的克隆與功能分析時，證明了不同的病原菌會對降解酶進行不同的組合，從而改變病原菌的致病性.

3.4 胞外多糖

胞外多糖(expolysaccharides,簡稱EPS)是細菌在生長代謝過程中分泌到胞外的一種多糖類化合物，有的依附于細菌細胞壁形成莢膜，稱為莢膜多糖；有的滲入培養(yǎng)基形成黏液，稱為黏液多糖，它們都是細菌適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物.胞外多糖有助于細菌吸附于寄主上并吸收其營養(yǎng)，也有助于抵抗干旱環(huán)境，同時也是毒力因子之一.胞外多糖與寄主細胞降解物一起堵塞維管組織，引起植物壞死、萎蔫、褪綠.不產(chǎn)生胞外多糖的菌株不具有致病性，原因是寄主可以識別并清除不具有胞外多糖的細菌.胞外多糖與細菌致病性之間有著密切的聯(lián)系，作為重要的致病因子，胞外多糖的致病機制可能是：1)黏稠的胞外多糖堵塞維管束的運輸?shù)缆罚?)干擾寄主的免疫識別；3)提高菌體的抗性.許多植物病原菌的EPS已被證明是毒力因子，如青枯假單胞菌、甘藍黑腐病菌、梨火疫病菌等[19]，而邱慧[20]在2014年研究水稻細菌性褐條病菌clpB和impM基因的致病性及氧脅迫條件下全蛋白的表達分析時也發(fā)現(xiàn)，褐條病菌胞外多糖的含量增加會使其致病性增強.

4 抑菌物質(zhì)

抑菌物質(zhì)可分為殼類糖、喜樹堿(camptothecin，CPT)及β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactams)3大類，其具體作用機理詳見表1.

4.1 殼聚糖

2015年，楊春蘭[7]在進行水細菌性褐條病菌lipo和pppA基因功能及殼聚糖的抑菌機理的研究中發(fā)現(xiàn),殼聚糖對水稻細菌性褐條病具有明顯的抑制作用.有研究表明，由于殼聚糖的表面帶一定的正電荷，可以與細菌性褐條病菌表面的負電荷進行相互作用，改變細胞的通透性從而對細胞造成損傷[21].也有另外的研究表明，由于殼聚糖自身的理化性質(zhì)比如殼聚糖的親水性，能螯合金屬，可以與DNA結(jié)合抑制RNA的合成，可以對微生物的生長造成較強的抑制作用[22].

4.2 喜樹堿

喜樹堿是從喜樹中分離得到的一種單體的有效成分，也是世界上三大抗癌藥物之一.2016年，Dong等[23]在蕓薹根腫菌近紅外光譜檢測體系及喜樹堿抑菌機理的研究中發(fā)現(xiàn)，CPT對水稻細菌性褐條病菌株的細胞活性和游動性抑制作用較為顯著，而細菌的游動性與細菌的繁殖擴增毒力密切相關(guān).在CPT處理過的細菌菌株超薄切片電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，菌體表面由光滑變成粗糙，細胞大部分內(nèi)質(zhì)物被降解，并形成了氣泡，表明CPT對褐條病菌的細胞結(jié)構(gòu)具有明顯破壞作用.

4.3 β-內(nèi)酰胺類抗生素

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，具有殺菌活性強、毒性低、臨床療效好的優(yōu)點[24].2015年，葛夢禹[25]在RNA-Seq解析毒力抑制劑弱化水稻細菌性褐條病菌致病力的研究中發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類抗生素Amp可以顯著地弱化細菌性褐條病菌(菌株RS-1)的游動性，以及病菌在水稻根部的定殖能力.

5 防治措施

水稻細菌性褐條病發(fā)病嚴(yán)重、防治困難，目前生產(chǎn)上采取的防治措施主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治等.雖然這些措施起到了一定的防治作用，但卻不能從根本上減少水稻細菌性褐條病的發(fā)生.近幾年來，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，該病菌致病機制及其與水稻互作機制逐漸探明，植物病理學(xué)家提出了一些能防治該病害的方法，具體見表2.

5.1 農(nóng)業(yè)防治

防治任何一種作物病害，搞好農(nóng)田基本建設(shè)是首要任務(wù).及時改善加固水利排灌網(wǎng)管，疏浚溝渠，優(yōu)化地面排澇和灌溉系統(tǒng)配套，保障農(nóng)田出流暢通，可以避免田間積水.一旦稻田淹沒，就要立即排水曬田，防止病害發(fā)生流行，同時還要對防洪工程進行修復(fù).此外合理搭配施用有機肥，控制氮肥用量，適時適度露曬稻田，及時處理病稻草等，均能降低病害發(fā)生程度[26].

5.2 化學(xué)防治

帶菌種子是該病害傳播的主要途徑，因此在播種前就要對種子做好消毒工作.目前生產(chǎn)上常用的消毒液有強氯精、鏈霉素藥液和抗菌劑等.對于已經(jīng)發(fā)病的農(nóng)田，要依據(jù)發(fā)病情況輪換、單用或者混合使用高效對口農(nóng)藥，可供選擇的藥劑有喹啉銅、獨定安等[27].如果病情嚴(yán)重，要立即每公頃撒施石灰或草木灰15～20 kg，噴灑20%噻森銅SC、20%葉青雙可濕粉125 g兌水噴霧、95%細菌靈可濕性粉劑500倍液或50%代森銨水劑800倍液等藥劑，防效均可達90%以上，但噴霧時要盡量噴到莖稈上，并適當(dāng)追施氮肥[1].

5.3 生物防治

目前對水稻細菌性褐條病生物防治的研究主要側(cè)重2種方法.一是對病原菌致病相關(guān)基因進行定位、分析，通過減弱病原菌的毒性來達到防治褐條病的效果.劉賀[1]研究發(fā)現(xiàn)，將細菌鞭毛作為藥劑的靶標(biāo)位點，對該病害的防治或?qū)⑵鸬搅己玫男Ч?二是篩選抗病品種，并將篩選出的抗病品種培育成更適應(yīng)氣候條件的抗褐條病主栽品種，以期極大降低褐條病的發(fā)病率.

表2 水稻細菌性褐條病防治措施

6 總結(jié)與展望

水稻是我國及其他國家最主要的糧食作物之一，其重要性不言而喻.在我國水稻生產(chǎn)中，細菌性褐條病已經(jīng)造成了嚴(yán)重的不良影響.近年來，我國不少水稻產(chǎn)區(qū)相繼爆發(fā)了水稻細菌性褐條病，并且造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失.然而，目前對該病的研究大多集中在病原菌的分離與鑒定、病原菌致病基因的挖掘和致病機理的探究等方面.例如，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)、生物膜、胞外酶等與細菌性褐條病菌的致病性密切相關(guān).然而，關(guān)于細菌性褐條病的抗原篩選、抗性鑒定、水稻對該病的抗病機制研究及抗性基因的挖掘等方面還處于空白，導(dǎo)致水稻抗病遺傳育種工作的進展緩慢.

目前對水稻細菌性褐條病的防治主要采取的方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等.為了從根本上找到更加有效的病害防治方法，應(yīng)該徹底闡明該病菌的致病機理及其與水稻的互作機制，對影響致病性的基因進行定位和功能分析，并且在之后的研究中發(fā)掘到相應(yīng)的褐條病抗性位點，篩選出效應(yīng)值較大的位點，并通過常規(guī)的分離手段，縮短這些位點間的物理距離，在大田中構(gòu)建這些位點的近等基因系NIL，然后進行多個抗性QTL的聚合，最終應(yīng)用于抗褐條病育種工作，如此便可極大地防治水稻細菌性褐條病.這種方法是純有機的，既能保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的絕對安全，也有利于提高水稻品種的經(jīng)濟價值.