張 婷，賴 清，陳 波，王 鼎，吳永強(qiáng)，周 媛，司原成，莫曦雅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

毫針針刺是針灸防治疾病的常用手段，是醫(yī)者借助毫針在人體腧穴(或其它特定部位)施以一定的手法操作，從而達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血、扶正祛邪目的的一種中醫(yī)臨床外治方法。腧穴是由已知結(jié)構(gòu)立體構(gòu)筑所組成的綜合體[1]，是針刺作用的初始應(yīng)答環(huán)節(jié)，也是針刺信號的信息轉(zhuǎn)換平臺，在針刺效應(yīng)的轉(zhuǎn)換和啟動中具有重要作用。實驗針灸學(xué)研究確認(rèn)毫針對機(jī)體的有效刺激本質(zhì)是機(jī)械刺激[2]。生物醫(yī)學(xué)工程細(xì)胞生物力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)力學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞膜和胞內(nèi)某些蛋白分子的形變能將機(jī)械信號轉(zhuǎn)換成生物化學(xué)信號，啟動下游細(xì)胞信號通路的級聯(lián)反應(yīng)[3-4]。課題組近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架微絲、微管能夠在針刺過程中應(yīng)力發(fā)生變化向細(xì)胞內(nèi)傳遞機(jī)械力學(xué)信息[5-6]，但是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)受破壞后是否影響正常針刺的效應(yīng)，目前尚不清楚。因此，本研究選取生物熱學(xué)特性、電學(xué)特性和能量代謝特性三方面，重點(diǎn)探討細(xì)胞骨架中微絲和微管結(jié)構(gòu)完整與否對正常針刺的反應(yīng)是否有其他影響，為進(jìn)一步闡釋細(xì)胞骨架在針刺機(jī)理中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

6～8周齡SPF級SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0014。動物飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室，室溫(22±1)℃，相對濕度(50±5)%，光照12 h明暗交替(明期8：00-20：00)，大鼠自由攝食進(jìn)水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、干擾微絲組和干擾微管組3組，每大組16只，各組再按窩別、體質(zhì)量、活躍度因素配對后隨機(jī)分為非針刺組與針刺組2個小組，每小組8只。所有實驗操作均嚴(yán)格遵守中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要儀器與試劑

電子天平(WT型，杭州萬特衡器公司)；紅外體溫計(CK-T1503，深圳長坤科技公司)；直流低電阻測試儀(YP2512，深圳永鵬儀器公司)；凍存管(607001，美國NEST)；液氮罐(YDS-20，青島海爾特種電器公司)；酶標(biāo)分析儀(Infinite F50，瑞士Tecan)；一次性無菌針灸針(0.30 mm×25 mm，吳江云龍醫(yī)療器械公司)。

秋水仙堿(MB1063-S，大連美侖生物技術(shù)公司)；細(xì)胞松弛素B(D8370-500ml，美國Apexbio)；二甲基亞砜(1121E0323，北京索萊寶科技公司)；水合氯醛(1113A20，北京雷根生物技術(shù)公司)；大鼠三磷酸/二磷酸腺苷ELISA試劑盒(ZK-R4622/ZK-R3711，深圳子科生物科技公司)。

1.3 干預(yù)方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后進(jìn)行干預(yù)。各組大鼠稱重后，于右側(cè)“足三里”穴周備皮，穴位定位參考《實驗針灸學(xué)》附錄四[7]，定位為：膝關(guān)節(jié)下外側(cè)，腓骨小頭下5 mm。各組大鼠稱重備皮后分別用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，麻醉劑量(mL)=大鼠質(zhì)量(g)×0.3 mL/100 g。

正常針刺組麻醉后消毒右側(cè)“足三里”穴，毫針直刺5 mm，按(60±2)r/min的頻率均勻捻針，捻轉(zhuǎn)幅度為180°～360°，捻針5 min，留針10 min，然后再捻針5 min，以此類推，共捻針3次，于第3次捻針完畢后出針，每天1次，共操作3天。正常非針刺組麻醉后與正常針刺組做相同的抓取、固定，不施加其他處理。干擾微絲針刺組麻醉后于右側(cè)“足三里”穴注射細(xì)胞松弛素B 300 μg，30 min后參照正常針刺組進(jìn)行毫針針刺，每天注射和針刺各1次，共操作3天。干擾微絲非針刺組麻醉后于右側(cè)“足三里”穴注射細(xì)胞松弛素B 300 μg，每天1次，共操作3天。干擾微管針刺組麻醉后于右側(cè)“足三里”穴注射秋水仙堿250 μg，30 min后參照正常針刺組進(jìn)行毫針針刺，每天注射和針刺各1次，共操作3天。干擾微管非針刺組麻醉后于右側(cè)“足三里”穴注射秋水仙堿250 μg，每天1次，共操作3天。

1.4 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.4.1 穴區(qū)溫度值 各針刺組大鼠行末次刺激后，俯臥位固定，(非針刺組將大鼠靜置，靜置時間與針刺組針刺時間相同)，用紅外體溫計溫度探頭置于穴區(qū)皮膚上3～5 cm處，每隔10 s記錄1次溫度值，記錄1 min，共記錄6次，取平均值為穴區(qū)溫度值。

1.4.2 穴區(qū)電阻值 溫度測量后，各組大鼠繼續(xù)俯臥位固定，以進(jìn)針點(diǎn)為中心，在直徑5 mm范圍內(nèi)用75%酒精進(jìn)行涂擦，無關(guān)電極蘸生理鹽水后，固定在右側(cè)后肢足掌中，并將蘸少許生理鹽水溶液的探測電極分別置于被測穴位進(jìn)針點(diǎn)和其上下左右各1.5 mm 處共5個點(diǎn)觀測電阻，取平均值為穴區(qū)電阻值。

1.4.3 穴區(qū)ATP與ADP含量 于第3天檢測完溫度、電阻后，將大鼠脫頸處死并立即取材。取材方法為：于大鼠右側(cè)后肢進(jìn)一步備皮、消毒，切開皮膚后，以大鼠針刺點(diǎn)為圓心，直徑約5 mm、垂直深度約5 mm的區(qū)域內(nèi)取穴區(qū)皮下組織塊約200 mg。組織塊取下后用生理鹽水沖洗，置入凍存管后于液氮中保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測組織塊ATP與ADP含量：組織勻漿后取上清液作為檢測標(biāo)本，按照試劑盒說明書稀釋為6個濃度梯度，稀釋后各孔加樣量都為50 μL，設(shè)空白孔及樣品孔。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外，并用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液洗滌，每孔加滿洗滌液，靜置60 s后棄去，如此重復(fù)洗板5 次。顯色，加入底物A和B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL，450 nm波長依序測量各孔的吸光度值，計算樣品含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組非針刺組與針刺組的組間數(shù)據(jù)采用配對t檢驗分析；組別間調(diào)節(jié)幅度采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠穴區(qū)溫度值比較

正常組、干擾微絲組、干擾微管組各組在針刺后，穴區(qū)局部溫度均較非針刺狀態(tài)降低(P<0.01)；干擾微絲組和干擾微管組較正常組，溫度調(diào)節(jié)幅度也均更大(P<0.01)。見表1。

表1 細(xì)胞骨架對正常生理狀態(tài)下毫針針刺調(diào)控穴區(qū)溫度的影響

2.2 各組大鼠穴區(qū)電阻值比較

正常組、干擾微絲組、干擾微管組各組在針刺后，穴區(qū)局部電阻均較非針刺狀態(tài)降低(P<0.01)；干擾微絲組較正常組，電阻調(diào)節(jié)幅度更大(P<0.01)；干擾微管組較正常組，電阻調(diào)節(jié)幅度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 細(xì)胞骨架對正常生理狀態(tài)下毫針針刺調(diào)控穴區(qū)電阻的影響

2.3 各組大鼠穴區(qū)ATP/ADP比值比較

正常組、干擾微絲組在針刺后，穴區(qū)ATP/ADP比值較非針刺狀態(tài)升高(P<0.01)；干擾微管組針刺后，穴區(qū)ATP/ADP比值較非針刺狀態(tài)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；干擾微管組較正常組，穴區(qū)ATP/ADP調(diào)節(jié)幅度偏小(P<0.01)。見表3。

表3 細(xì)胞骨架對正常生理狀態(tài)下毫針針刺調(diào)控穴區(qū)ATP/ADP特性的影響

3 討論

細(xì)胞骨架是一種位于細(xì)胞核及細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面的纖維狀蛋白質(zhì)基質(zhì)，由微管、中間絲和微絲組成，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，在維持細(xì)胞形態(tài)、承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、參與細(xì)胞生命活動等方面起重要作用[8-9]。微管由α、β微管蛋白以二聚體形式頭尾相連聚合而成，是細(xì)胞骨架的架構(gòu)主干。微管的功能取決于其連續(xù)聚合和解聚的動力學(xué)性質(zhì)，秋水仙堿通過與微管蛋白異二聚體結(jié)合，促進(jìn)了微管的降解進(jìn)程[10-11]。微絲即肌動蛋白絲，是由肌動蛋白分子螺旋狀聚合成的絲狀肌動蛋白，集中分布于質(zhì)膜下，參與維持細(xì)胞形狀和賦予質(zhì)膜機(jī)械強(qiáng)度。細(xì)胞松弛素可阻止微絲快速生長端球狀肌動蛋白的添加，從而降低微絲聚合速率，使微絲網(wǎng)格結(jié)構(gòu)破壞[12-13]。中間絲又稱作中間纖維，由一個或多個不同的亞單位形成，使細(xì)胞具有張力和抗剪切力作用。使用去垢劑、高鹽溶液等抽提細(xì)胞后，中間纖維仍保持結(jié)構(gòu)的完整性，是最穩(wěn)定的細(xì)胞骨架成分[14]。

針刺能調(diào)節(jié)穴區(qū)溫度變化，是針刺調(diào)節(jié)被刺腧穴熱敏特性發(fā)生變化的外在表現(xiàn)[15]。有研究選取健康受試者的曲池穴行針刺刺激，發(fā)現(xiàn)針刺曲池穴即刻，曲池、溫溜、手三里穴的溫度下降，肘髎穴溫度升高，而在針刺曲池穴10 min后，曲池、肘髎穴溫度較針刺前升高，溫溜、手三里穴溫度低于針刺前水平[16]。這表明針刺對于穴區(qū)溫度有雙向調(diào)節(jié)作用，且受機(jī)體狀態(tài)、手法、針刺時間、刺激強(qiáng)度等因素影響[17-18]。本研究中所采用的針刺方法對于大鼠“足三里”穴具有明顯降溫作用，干擾微絲組和干擾微管組針刺后穴區(qū)溫度均較非針刺狀態(tài)也降低，且較正常組溫度調(diào)節(jié)幅度更大，說明微絲、微管完整與否對正常針刺的溫度調(diào)控有干擾作用。

經(jīng)穴的電學(xué)特性是指在生理病理不同機(jī)能狀態(tài)下，人體相關(guān)的經(jīng)穴組或耳穴群電阻、電容、電位甚至電感等的特異性。人體穴位存在電阻抗特性和伏安特性，穴位的電阻是不同組織的電阻之和，具有低電阻、高電位的特性[19]。一般情況下，針刺能進(jìn)一步降低穴位電阻[20]，而本研究中，干擾微絲組、干擾微管組針刺后穴區(qū)電阻值均較非針刺狀態(tài)降低，干擾微管組較正常組電阻調(diào)節(jié)幅度無統(tǒng)計學(xué)差異，而干擾微絲組較正常組電阻調(diào)節(jié)幅度更大，說明細(xì)胞骨架微絲完整與否對正常針刺的電阻調(diào)控有干擾作用。

能量代謝指能量的釋放、轉(zhuǎn)移、存儲和利用。線粒體是細(xì)胞生命活動的控制中心，通過三羧酸循環(huán)生產(chǎn)維持細(xì)胞正常功能所需的ATP[21]。1分子ATP和1分子AMP可以催化反應(yīng)生成2分子ADP[22]。ATP與ADP的比值，可以反應(yīng)能量代謝水平，當(dāng)ATP生成增多時，ATP/ADP比值升高，ATP水解增多時，則ATP/ADP比值下降。線粒體主要沿微管軌道運(yùn)動，微絲則協(xié)助微管對線粒體進(jìn)行短距離運(yùn)輸[23]，細(xì)胞骨架對線粒體的形態(tài)和功能起調(diào)節(jié)作用[24]。本研究中，正常組針刺促進(jìn)了穴區(qū)ATP/ADP比值的提高，但干擾微管組較正常組穴區(qū)ATP/ADP調(diào)節(jié)幅度減小，說明細(xì)胞骨架微管對正常針刺的能量代謝能產(chǎn)生明顯影響。

綜上，毫針針刺能降低穴區(qū)局部溫度與電阻，提高穴區(qū)局部能量代謝水平，而細(xì)胞骨架在毫針針刺調(diào)控穴區(qū)局部反應(yīng)的作用中，微絲、微管對正常針刺的降溫效應(yīng)均有影響，微絲對正常針刺的降電阻效應(yīng)有影響，微管對正常針刺的升高能量代謝水平效應(yīng)有影響，說明細(xì)胞骨架是影響針刺信息傳遞和調(diào)控針刺效應(yīng)的重要途徑。今后，需研究在不同疾病狀態(tài)下研究細(xì)胞骨架對針刺效應(yīng)的影響是否相同。