張永勝，韓金花，田鑄，張丹，張珍，師希雄*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué))，甘肅 蘭州，730070)

我國西北地區(qū)的羊肉具有高蛋白、低脂肪、氨基酸和礦物質(zhì)含量高等特點[1]。羊肉串因獨特的色香味和高營養(yǎng)價值受到消費者的喜愛[2]。然而，羊肉串在烤制過程中容易產(chǎn)生多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)和雜環(huán)胺等有毒有害物質(zhì)。PAHs是由兩個或兩個以上芳香環(huán)構(gòu)成的烴類物質(zhì)，作為重要的環(huán)境和食品污染物，其具有強致畸、致癌和致突變作用，能夠引起生物體多個器官的癌變[3]。歐盟委員會國際癌癥研究機構(gòu)、歐洲食品安全局、美國有毒物質(zhì)與疾病登記機構(gòu)和我國國標將16種PAHs列為優(yōu)先控制致癌物[4-6]。

目前，食品中檢測PAHs的方法有HPLC和GC-MS法。GC-MS檢測時，樣品需要氣化處理，氣化時高溫會引起目標物分解的可能，而HPLC可在室溫下進行，避免了高溫引起目標物分解的可能，且有較高的靈敏性、重現(xiàn)性以及準確度[6-8]。目前，白雪[6]建立一種HPLC法同時測定烤羊肉中5種硝基多環(huán)芳烴的方法，能夠快速準確地測定5種強“三致”硝基多環(huán)芳烴的含量；姜三群[2]建立了HPLC-熒光檢測器檢測碳烤羊肉串中苯并芘的含量；王春蕾等[11]運用HPLC-紫外/熒光檢測方法，能夠準確檢測熏肉制品中15種PAHs；而我國GB 5009.265—2016《食品中多環(huán)芳烴的測定》中規(guī)定了用液相色譜法測定食品中15種PAHs，并沒有涉及對苊烯的檢測[5]。

綜上，關(guān)于烤羊肉串中16種PAHs的檢測方法國內(nèi)外研究報道較少，該試驗用HPLC-熒光檢測器串聯(lián)二級陣列管檢測器，通過系統(tǒng)優(yōu)化前處理條件，建立16種PAHs的檢測方法，以便為羊肉串中PAHs控制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity Ⅱ HPLC(配有二極管陣列檢測器和熒光檢測器)，Agilent SB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、EV C18(50 mm×2.1 mm，4 μm)、symmetry R C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，美國Agilent公司；FSH-2A型可調(diào)高速勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；N-20多功能氮吹儀，長春樂鏷科技有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器(500 W，40 kHz)，昆山市超聲儀器有限公司；HX202T型電子天平，慈溪市天東衡器廠；TGL-16MC型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀集團；FCR1000-UF-E超純水機，上海和泰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

PAHs儲備液的配制：用乙腈分別將16種PAHs標準品溶解于50 mL棕色容量瓶，配成不同濃度的標準儲備溶液。

單標溶液的配制：移取適量的PAHs儲備液，配制成16種50 ng/mL的等質(zhì)量濃度單標溶液；

PAHs混標溶液的配制：移取適量PAHs儲備液，配制成4 000 ng/mL的等質(zhì)量濃度PAHs中間液，準確移取16種PAHs儲備液各0.1 mL，配制成100 ng/mL的混標溶液，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50 ng/mL的混標溶液。所有標準溶液置于-18 ℃環(huán)境中儲藏。

1.3.2 樣品前處理條件優(yōu)化

1.3.2.1 超聲波輔助萃取時間的選擇

稱取市售碳烤羊肉串3 g(精確到0.001 g)，勻漿樣品置于50 mL離心管中，再加入1 mL 30 μg/mL PAHs混標溶液，提取溶劑為20 mL 乙腈和 10 mL乙腈飽和正己烷，設(shè)置固相萃取柱為Florisil，洗脫劑為二氯甲烷，洗脫劑體積為11 mL，考察超聲波輔助時間(10、20、30、40、50 min)對PAHs回收率的影響，篩選出最佳時間。

1.3.2.2 固相萃取柱的選擇

樣品預(yù)處理同上，設(shè)置超聲萃取時間為30 min，洗脫劑為二氯甲烷，洗脫劑體積為11 mL，考察固相萃取柱(Florisil、PAH-MIP、C18、PCX)對PAHs回收率的影響，篩選出最佳固相萃取柱。

1.3.2.3 洗脫劑種類的選擇

樣品預(yù)處理同上，設(shè)置超聲波萃取時間為30 min，固相萃取柱為PAH-MIP，洗脫劑為11 mL，考察洗脫劑[正己烷-二氯甲烷(30∶70，體積比，下同)、環(huán)己烷、二氯甲烷、正己烷-二氯甲烷(50∶50)、乙酸乙酯]對PAHs回收率的影響，篩選出最佳洗脫劑。

1.3.2.4 洗脫劑體積的選擇

樣品預(yù)處理同上，設(shè)置超聲波萃取時間為30 min，固相萃取柱為PAH-MIP，洗脫劑為正己烷-二氯甲烷(30∶70)，考察洗脫劑體積(5、7、9、11、13 mL)對PAHs回收率的影響，篩選出最佳洗脫劑體積。

1.3.3 樣品前處理

根據(jù)王沖[8]的方法稍作修改。提?。悍Q取羊肉串肉樣3 g(精確至0.001 g)，置于50 mL棕色離心管a中，加入10 mL乙腈飽和正己烷(乙腈飽和的正己烷溶液的配制：量取400 mL正己烷，加入100 mL乙腈，搖勻后靜置，上層為乙腈飽和正己烷)和20 mL乙腈溶液勻漿，在40 ℃水浴下超聲波輔助萃取30 min，在4 500 r/min冷凍(4 ℃)離心30 min，用移液槍將乙腈層移取到50 mL棕色離心管b中，將20 mL乙腈加入棕色離心管a中復(fù)提一次，吸取乙腈提取液合并到棕色離心管b中，用100 mL梨形燒瓶將棕色離心管b中的提取液在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入6 mL正己烷復(fù)溶，渦旋振蕩溶解。

凈化：先用5 mL二氯甲烷活化PAH-MIP，再用10 mL正己烷平衡PAH-MIP，將6 mL正己烷提取樣液轉(zhuǎn)移到PAH-MIP中，用6 mL正己烷洗滌離心管b，并將洗滌液注入萃取柱中，用9 mL正己烷-二氯甲烷(30∶70)洗脫萃取柱，在10 mL試管c中收集所有洗脫液，氮吹(30 ℃)至有機溶劑全部揮發(fā)，加入1 mL乙腈渦旋振蕩，用0.22 μm油系濾膜過濾，制得上機待測液。

1.3.4 儀器分析條件

色譜柱：Agilent SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈和水；進樣量5 μL，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，根據(jù)出峰種類和峰的分離度優(yōu)化梯度洗脫程序。檢測器：熒光檢測器和二級陣列管檢測器串聯(lián)。

1.3.5 方法的線性范圍、檢出限和定量限測定

在最優(yōu)的測定方法下，對1.3.1配制的5種混標溶液(1、5、10、20、50 ng/mL)進行測定，橫坐標為各混標的質(zhì)量濃度，縱坐標為PAHs的峰面積，繪制標準曲線；檢出限用3倍信噪比(S/N=3)確定，定量限用10倍信噪比(S/N=10)確定。

1.3.6 回收率和精密度測定

稱取3 g市售羊肉串肉樣，分別添加2、5、20 ng/mL混標溶液，按照1.3.3進行樣品前處理，再進行上機分析，每個添加水平重復(fù)測定6次，計算肉樣中回收率及精密度，即相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.3.7 實際肉樣檢測方法

3種不同來源的市售烤羊肉串(每種來源的羊肉串各做3個平行肉樣)，用1.3.3前處理方法進行提取和純化，用HPLC檢測。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用HPLC自帶的軟件對峰面積進行積分處理。用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(P<0.05)，用Origin 2017作圖，每組試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

反相色譜柱是HPLC分析中最常用的柱子，該試驗選取了Agilent SB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、EV C18(50 mm×2.1 mm，4 μm)、symmetry R C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，對比4種不同規(guī)格色譜柱對16種PAHs分離效果和出峰情況，結(jié)果顯示，EV C18、symmetry R C18和AQ C18色譜柱響應(yīng)值低、出峰種類少和峰形分離不徹底，Agilent SB C18柱具有良好的分離效果，可供檢測16種PAHs。

2.2 梯度洗脫條件和檢測波長的選擇

水和乙腈的不同比例直接影響PAHs的分離度和出峰時間。該試驗中，Ch和BaA、F和Ac、BbF和BkF分離度不高，經(jīng)過優(yōu)化，在5～25 min時，水相在27%～25%時，Ch和BaA及其他分離度不高的PAHs能夠較好的分離，具體洗脫程序見表1。Ace無熒光性，用二極管陣列檢測器在 230 nm 處測定Ace，其他15種PAHs熒光檢測波長見表2。在該梯度洗脫程序下，16種PAHs能夠較好分離。

表1 HPLC 流動相洗脫梯度Table 1 HPLC mobile phase elution gradient

表2 HPLC 熒光檢測梯度Table 2 HPLC fluorescence detection gradient

2.3 超聲波輔助萃取時間的選擇

超聲波時間對PAHs的提取也有著至關(guān)重要的影響，時間過短，導(dǎo)致萃取不完全，從而影響樣品檢測；時間過長，容易使低分子質(zhì)量(2～3個苯環(huán))的PAHs組分揮發(fā)而損失[12-13]。如圖1所示，超聲時間為10 min和20 min時，回收率略低于30 min，其原因可能是超聲波時間較短，肉中PAHs未完全被提取出來；超聲波時間為40 min和50 min時，回收率為56.96%～67.86%和52.26%～63.74%，顯著低于30 min時的回收率，其原因可能是超聲波時間過長，低分子質(zhì)量的PAHs揮發(fā)損失，造成回收率低；超聲波時間在30 min時，PAHs回收率最高，為63.65%～74.49%，因此選30 min作為前處理超聲波萃取時間。

圖1 不同超聲波時間對PAHs回收率的影響Fig.1 Effect of different ultrasonic time on the recovery rate of PAHs注：不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱可以達到凈化和富集的雙重功效，固相萃取柱填料種類不同，對PAHs有不同的吸附效果[14]。由圖2可知，F(xiàn)lorisil萃取柱回收率為62.5%～73.4%，顯著低于PAH-MIP；PCX萃取柱和C18萃取柱對出峰前期低分子質(zhì)量的PAHs有較高的回收率，但對Ch等高分子質(zhì)量(4～6個苯環(huán))PAHs回收率較低，其原因可能是萃取柱填充物質(zhì)對高分子質(zhì)量的PAHs吸附能力不強；PAH-MIP萃取柱回收率顯著高于其他固相萃取柱，回收率為77.9%～91.9%，能夠?qū)AHs特異性吸附，因此選擇PAH-MIP萃取柱為前處理固相萃取柱。

圖2 不同固相萃取柱對PAHs回收率的影響Fig.2 Effects of different solid phase extraction columns on the recovery of PAHs

2.5 洗脫劑種類的選擇

PAHs屬于非極性或極性較弱的碳氫化合物，洗脫劑的種類對PAHs的回收率有顯著的影響[11]，目前PAH-MIP萃取柱多用二氯甲烷作為洗脫劑，二氯甲烷單獨洗脫時，能夠顯著阻止脂肪進入待測樣品中，但二氯甲烷對PAHs的洗脫效率較低[5,14-15]。如圖3所示，乙酸乙酯和環(huán)己烷洗脫效果顯著低于正己烷-二氯甲烷(30∶70，體積比，下同)；二氯甲烷單獨洗脫時，回收率為77.94%～91.71%，但PAHs回收率顯著低于正己烷-二氯甲烷(30∶70)；正己烷-二氯甲烷(50∶50)對低分子質(zhì)量的PAHs回收率較高，但對大部分高分子質(zhì)量的PAHs回收率較低，且整體PAHs回收率顯著低于正己烷-二氯甲烷(30∶70)；洗脫劑為正己烷-二氯甲烷(30∶70)時，PAHs回收率最高，回收率為84.97%～103.82%，能夠很好地從PAH-MIP萃取柱中將PAHs洗脫下來，因此選擇正己烷-二氯甲烷(30∶70)為PAH-MIP的洗脫劑。

圖3 不同洗脫劑種類對PAHs回收率的影響Fig.3 Effects of different eluents on the recovery of PAHs

2.6 洗脫劑體積的選擇

固相萃取過程中，洗脫劑的體積往往直接影響目標化合物的洗脫效果，洗脫劑體積少容易造成洗脫不徹底，降低PAHs的回收率，但體積過高也會導(dǎo)致稀釋效應(yīng)，濃縮時也容易貼壁浪費，導(dǎo)致回收率降低[17]。如圖4所示，當(dāng)洗脫劑正己烷-二氯甲烷(30∶70)體積為5 mL和7 mL時，PAHs回收率顯著低于9 mL時，其原因可能是洗脫體積少而造成洗脫不徹底，從而使PAHs回收率低；洗脫劑體積為11 mL時，回收率略低于9 mL，其原因可能由于稀釋效應(yīng)不明顯；當(dāng)洗脫劑體積為13 mL時，回收率顯著低于9 mL，稀釋效應(yīng)明顯。洗脫劑體積為9 mL時，PAHs回收率高于其他各體積，回收率為85.21%～105.74%，因此選9 mL正己烷-二氯甲烷(30∶70)為最優(yōu)洗脫體積。

圖4 不同洗脫劑體積對PAHs回收率的影響Fig.4 Effects of different volumes of N-hexane∶dichloromethane (30∶70) on the recovery of PAHs

2.7 線性范圍、檢出限和定量限

如表3所示，16種PAHs在1～50 ng/mL線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法檢出限為0.33～3.30 μg/kg，定量限為1.0～10.0 μg/kg，能夠滿足16種PAHs的檢測分析。

2.8 回收率和精密度

如表4所示，經(jīng)過3個加標檢測分析(2、5、20 ng/mL)，目標物回收率在81.23%～101.1%，RSD為0.95%～5.84%，試驗方法回收率高且精密度良好，能夠滿足烤羊肉串中16種PAHs的檢測要求。

表3 16種PAHs方法學(xué)參數(shù)Table 3 Methodological parameters of 16 PAHs

表4 目標物的平均回收率和RSD(n=6)Table 4 Average recovery and relative standard deviation of target compounds (n=6)

2.9 實際樣品檢測

采用上述優(yōu)化的方法，對市售3種來源的羊肉串檢測PAHs含量，結(jié)果如表5所示，16種PAHs只有Ch、BaA、BkF、BaP和IP沒有檢出，其余PAHs均有檢出。3份烤羊肉串樣品中的16種PAHs總含量最低為127.59 μg/kg，最高為200.23 μg/kg。

表5 不同來源烤羊肉串中PAHs的含量 單位：μg/kg

3 結(jié)論

該試驗通過高效液相色譜-熒光檢測器-二級陣列管檢測器建立了烤羊肉串中16種PAHs含量的檢測方法，該方法凈化效果好、靈敏度高、定量準確性高，能滿足烤羊肉串中PAHs的檢測要求，為今后烤羊肉串中PAHs的形成規(guī)律以及控制研究提供理論基礎(chǔ)。