張有辰， 李慧文， 金福**

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院 兒科， 海南 三亞 572022； 2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 新生兒科， 吉林 延吉 133000)

近年來(lái)，氧療在圍生期圍生兒腦損傷以及早產(chǎn)兒搶救治療中發(fā)揮重要作用，能夠顯著提高早產(chǎn)兒以及新生兒的存活率。但是，由于新生兒器官發(fā)育不完善，長(zhǎng)時(shí)間的高氧暴露會(huì)造成其他器官和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，如肺損傷、腦損傷等[1-2]。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的高氧氣暴露能夠促進(jìn)鈉尿肽受體(natriuretic peptide,NRP)-環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)信號(hào)系統(tǒng)活化誘導(dǎo)大鼠腦損傷[3]；另外，高氧亦可以通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相關(guān)氨基末端蛋白激酶(c-jun N-terminal protein kainse,JNK)蛋白和磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-jun N-terminal protein kainse,p-JNK)蛋白誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷[4]。王葉等[5]研究發(fā)現(xiàn)前列腺素E1能夠通過(guò)抑制JNK和p-JNK蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮高氧誘導(dǎo)的新生大鼠腦損傷保護(hù)作用。因此，通過(guò)抑制ERS相關(guān)JNK、p-JNK蛋白可能是防治新生兒以及早產(chǎn)兒氧療的重要途徑。最新研究表明，人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1,GRg1)能夠減少新生大鼠缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)海馬神經(jīng)元凋亡，有效地改善HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力[6]；另外，GRg1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用與抑制海馬神經(jīng)元凋亡、調(diào)節(jié)JNK及p-JNK蛋白表達(dá)有關(guān)[7]。多項(xiàng)研究表明GRg1能夠改善多種誘因引起的大鼠腦損傷，但是有關(guān)GRg1對(duì)高氧誘導(dǎo)的新生大鼠腦損傷的影響及其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建高氧誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷模型，腹腔注射GRg1探究其對(duì)新生大鼠腦損傷的影響及其對(duì)JNK、p-JNK蛋白表達(dá)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源 新生Wistar大鼠，50只，體質(zhì)量8～10 g，雌雄不限，動(dòng)物由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供[SCXK(吉)2017-001]，本研究獲得動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LLSC20200716)。

1.1.2主要藥物與試劑 人參皂苷Rg1(上海順勃，純度≥98%)，蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin staining,HE)染色液及末端脫氧核糖轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的生物素化脫氧尿嘧啶缺刻標(biāo)記(terminal deoxy nucleo tidyl transferase mediated dUTP-biotin nick-end labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物)，JNK及p-JNK兔單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology)，兔免疫組化試劑盒(北京中杉金橋)，一抗和二抗稀釋液、β-actin小鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠、山羊抗兔及極超敏發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天)。

1.1.3主要儀器 G22-W型高速離心機(jī)(湖南湘儀)，SuPerMax 3000FA型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)，M371450型組織渦旋儀(武漢維塞爾)，TC-XDS-500C型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)，Western blotting檢測(cè)裝置和GoodLook-1000型成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物造模與分組 采用高氧誘導(dǎo)法制備大鼠腦損傷模型[8]。50只新生Wistar大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、高氧組及10 mg/kg (低劑量)GRg1組、20 mg/kg (中劑量)GRg1組、40 mg/kg (高劑量)GRg1組，對(duì)照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，其余各組大鼠置于高壓氧倉(cāng)內(nèi)、常規(guī)壓力，吸入氧氣濃度100%、氧氣流量為2 L/min，采用數(shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)艙內(nèi)氧氣濃度，使氧氣濃度維持在(85±2)%，艙內(nèi)溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為60%～65%，將生石粉末放置艙內(nèi)，吸收多余的CO2和水蒸氣；GRg1各劑量組大鼠，自造模第1天開(kāi)始，予10、20及40 mg/kg GRg1腹腔注射，1次/d，連續(xù)7 d；對(duì)照組和高氧組大鼠給予等量的生理鹽水注射。

1.2.2標(biāo)本采集 造模結(jié)束時(shí)，乙醚蒸汽麻醉，固定，剪下頭部，剝開(kāi)顱骨，完全暴露腦組織并將其整體取出；取左腦1/2行腦組織檢測(cè)含水量，取右腦行HE染色、TUNEL染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.3腦組織含水量 取“1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠腦組織、沖洗、稱量，記錄為腦組織濕重質(zhì)量；置于80 ℃烤箱內(nèi)，烘烤，直至水分蒸干，質(zhì)量恒定、稱量，記錄為腦組織干重質(zhì)量；計(jì)算腦組織含水量[腦組織含水量(%)=(濕重質(zhì)量-干重質(zhì)量)/濕重質(zhì)量×100]。

1.2.4HE染色 取“1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進(jìn)行腦組織染色，顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5TUNEL染色 取“1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠腦組織，按照TUNEL法測(cè)定腦細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核呈棕色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。石蠟切片置于60 ℃烤箱內(nèi)脫蠟，二甲苯浸洗2次、5 min/次；梯度乙醇溶液(100%、95%、80%及70%)各清洗1次，3 min/次；采用Proteinase K工作液處理腦組織切片20 min，室溫下加細(xì)胞通透液孵育10 min；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗切片，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，反應(yīng)30 min；切片風(fēng)干后，加 Converter-POD 50 μL，加上蓋玻片，37 ℃孵育30 min；PBS清洗切片后，加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液，孵育10 min，光學(xué)顯微鏡下拍照、觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠腦組織JNK、p-JNK蛋白表達(dá) 取“1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠腦組織、脫水、透明、包埋、組織切片為3～5 μm，3%H2O2溶液孵育10 min、85 ℃抗原修復(fù)，加10%BSA溶液封閉20 min；加JNK和p-JNK兔單克隆抗體(工作液體積稀釋比例為1 ∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜；加對(duì)應(yīng)山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min；滴加DAB顯色液，于400倍視野下隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行拍照，利用Image Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，檢測(cè)光密度(optical density，OD)值并計(jì)算蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)特征

HE染色顯示(圖1)，對(duì)照組大鼠腦組織未見(jiàn)明顯的病理改變，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多，形態(tài)以及結(jié)構(gòu)完整；高氧組和低劑量GRg1組大鼠腦組織可見(jiàn)大量的壞死細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫以及空泡，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)不規(guī)則；中劑量GRg1組和高劑量GRg1組大鼠腦組織病理?yè)p傷減輕，神經(jīng)細(xì)胞空泡變性減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整。

注：紅色箭頭表示水腫和空泡變性神經(jīng)元。圖1 各組大鼠腦組織的組織學(xué)特征(HE，×400)Fig.1 Histological characteristics of rat brain tissues in each group (HE，×400)

2.2 腦組織含水量和細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比，高氧組大鼠腦組織含水量明顯增加(P<0.01)；與高氧組相比，低、中及高劑量GRg1組大鼠腦組織含水量降低(P<0.05或P<0.01)。與對(duì)照組相比，高氧組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與高氧組相比，中和高劑量GRg1組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.01)，但低劑量GRg1組大鼠的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1和圖2。

表1 各組大鼠腦組織含水量和凋亡指數(shù)Tab.1 Water content and apoptosis index of rat brain tissues in each

注：紅色箭頭表示海馬神經(jīng)元凋亡。圖2 各組大鼠腦組織的細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)Fig.2 Cellular apoptosis in rat brain tissues in each group (TUNEL，×400)

2.3 腦組織JNK和p-JNK蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，高氧組大鼠腦組織中海馬神經(jīng)元細(xì)胞JNK和p-JNK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與高氧組相比，低、中及高劑量GRg1組大鼠腦組織海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞漿JNK和p-JNK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖3和表2。

注：紅色箭頭表示海馬神經(jīng)細(xì)胞蛋白質(zhì)著色。圖3 各組大鼠腦組織JNK和p-JNK蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400)Fig.3 Expressions of JNK and p-JNK proteins in rat brain tissues in each group (immunohistochemistry, ×400)

表2 各組大鼠腦組織JNK和p-JNK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)Tab.2 The positive expression rates of JNK and p-JNK proteins in rat brain tissues in each

3 討論

氧療是救治新生兒，尤其是早產(chǎn)兒的重要方式[9]。既往研究表明，早產(chǎn)兒高氧可能是導(dǎo)致腦性癱瘓和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙的原因之一[10]。另外，新生后1周齡的大鼠相當(dāng)于早產(chǎn)出生的新生兒[11-12]。本研究首先通過(guò)高氧誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷模型模擬新生兒高氧暴露下誘發(fā)的腦損傷，研究結(jié)果顯示高氧組新生大鼠病理切片腦組織可見(jiàn)大量的壞死細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫和空泡，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)不規(guī)則，與以往研究結(jié)果一致[11,13]，表明高氧誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷模型造模成功。

GRg1是人參皂苷中含量最高的成分之一，已研究表明GRg1對(duì)老年大鼠記憶能力有明顯的促進(jìn)作用，能夠促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的獲取[14]；GRg1能夠促進(jìn)幼鼠的身體發(fā)和腦神經(jīng)發(fā)育，改善學(xué)習(xí)和記憶功能障礙的動(dòng)物[15]；以上研究表明GRg1在腦神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重作用。但是目前有關(guān)GRg1對(duì)高氧誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷的影響尚不清楚。本研究結(jié)果顯示中、高劑量GRg1組大鼠腦組織病理?yè)p傷減輕，神經(jīng)元細(xì)胞空泡變性減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整；與高氧組相比，低劑量、中及高劑量GRg1組大鼠腦組織含水量降低，表明GRg1能夠發(fā)揮高氧誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷保護(hù)作用。王巧云等[7]發(fā)現(xiàn)GRg1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用與抑制海馬神經(jīng)元凋亡，調(diào)節(jié)JNK、p-JNK蛋白表達(dá)有關(guān)；黃天文等[16]研究表明GRg1可通過(guò)JNK通路減輕寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡；這些研究均表明GRg1可能通過(guò)JNK通絡(luò)抑制細(xì)胞凋亡，從而改善高氧誘導(dǎo)的新生大鼠腦損傷。

細(xì)胞凋亡是高氧誘導(dǎo)腦損傷的重要原因之一，ERS是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的重要途徑[17]。研究發(fā)現(xiàn)，ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與眾多心腦血管疾病密切相關(guān)[18]；ERS可通過(guò)磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinase,p-ERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子 6(activating transcription factor 6,ATF6)等信號(hào)活化，誘導(dǎo)并激活若C/EBP-同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)、JNK及Caspase，從而引起細(xì)胞凋亡[19]。JNK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞促分類原活化蛋白酶家族成員之一，又稱為應(yīng)激活化蛋白激酶，可參與Capase和線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。另外，高氧能夠通過(guò)上調(diào)JNK、p-JNK蛋白表達(dá)，促進(jìn)腦組織細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷，體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)抑制JNK信號(hào)通路活化能夠有效降低高氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[21]。以上研究表明，JNK信號(hào)在高氧誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷中扮演重要作用。因此，本研究TUNEL染色結(jié)果顯示，與高氧組相比，低劑量GRg1組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)無(wú)差異，中、高劑量GRg1組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)降低；免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與高氧組相比，低、中及高劑量GRg1組大鼠腦組織JNK、p-JNK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均降低。這些研究結(jié)果與GRg1下調(diào)p-JNK、抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕低氧復(fù)氧誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元損傷一致。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示當(dāng)GRg1劑量>20 mg/kg時(shí)可抑制JNK信號(hào)活化，降低神經(jīng)元凋亡，并最終減輕高氧誘導(dǎo)的新生大鼠腦損傷。