周明， 路艷林， 彭進， 萬昌武， 戴佳琳， 王杰*， 夏冰*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

近年來，冠心病(coronary heart disease，CHD)的發(fā)病年齡趨向于年輕化，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為其基礎(chǔ)病理變化的同時，越來越多的炎癥因子在斑塊內(nèi)被檢測到[1-3]。最近卡那單抗抗炎血栓結(jié)局研究(canakinumab antiinflammatory thrombosis outcome study, CANTOS)試驗表明白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體可以降低AS引起的心臟事件和死亡[4]，此后，藥物抗炎治療作為一種經(jīng)典的治療途徑逐漸被應(yīng)用于AS的治療。多項研究顯示，吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)可以通過多種方式在不同的組織器官中減輕炎癥反應(yīng)[5-9]，國內(nèi)外研究針對PDTC對AS的研究多見于利用PDTC作為抑制劑探究其對核轉(zhuǎn)錄因κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)的作用效果，但極少有直接關(guān)于闡述PDTC干預(yù)后血清學(xué)炎癥因子的表達與AS斑塊面積大小的文獻報道，本研究通過建立小鼠AS模型、腹腔注射60 mg/kg PDTC進行干預(yù)[10]，檢測小鼠主動脈AS斑塊面積及血清中基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1， SDF-1)、IL-1β及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達水平，探討PDTC對小鼠血清SDF-1、IL-1β、TNF-α等蛋白表達及AS的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 24只6周齡雄性載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-/-，ApoE-/-)小鼠[由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0006]，體質(zhì)量18～24 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2主要試劑和儀器 小鼠TNF-α、IL-1β、SDF-1 ELISA試劑盒(中國艾方生物科技有限公司)，PDTC(美國MERCK公司)；麥克奧迪數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)(中國麥克奧迪公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，高速離心機(美國Thermo Fisher公司)，酶標(biāo)儀(美國雷杜生命科學(xué)股份有限公司)，988洗板機(北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(武漢恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1造模、分組及取材 24只ApoE-/-小鼠按照隨機數(shù)字表法均分為對照(control group，CON)組、高脂喂養(yǎng)組(high-fat diet group，HFD組及PDTC組，CON組ApoE-/-小鼠全程給予普通飼料喂養(yǎng)，HFD組及PDTC組ApoE-/-小鼠全程給予高脂飼料(配方為3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油及81.3%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)；PDTC組ApoE-/-小鼠在高脂飼料喂養(yǎng)至第5周時腹腔注射60 mg/kg PDTC，HFD組ApoE-/-小鼠注射等量生理鹽水，2次/周；3組ApoE-/-小鼠喂養(yǎng)16周，麻醉處死，非抗凝采血管取血，高速離心機3 500 r/min離心10 min，取上清液-80 ℃留存；取各組ApoE-/-小鼠主動脈，4%多聚甲醛固定。

1.2.2蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色及小鼠主動脈根部血管AS面積大小的測量 取“1.2.1”項下各組ApoE-/-小鼠主動脈，常規(guī)石蠟包埋，血管橫斷面制作4 μm切片；石蠟切片經(jīng)二甲苯、下行梯度酒精脫蠟至水，放入Harris蘇木素染液，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗，0.1%氨水返藍，再放入伊紅染液染色；切片依次放入上行梯度酒精脫水、二甲苯透明，稍晾干后中性樹膠封片、鏡檢、圖像采集分析；運用麥克奧迪數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)觀察ApoE-/-小鼠血管組織HE切片，并進行血管內(nèi)AS面積大小的測量。

1.2.3ELISA檢測血清SDF-1、IL-1β及TNF-α表達 取“1.2.1”項下各組ApoE-/-小鼠血清，采用SDF-1、IL-1β及TNF-α試劑盒進行檢測；在酶標(biāo)包被板上設(shè)置標(biāo)準品孔各加不同濃度的標(biāo)準品50 μL、空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔；在待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，加待測樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)；每孔加酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外；封板膜封板，置37 ℃溫育60 min；20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；重復(fù)洗板5次，拍干，加顯色劑A 50 μL，再加顯色劑B 50 μL，37 ℃避光顯色15 min；加終止液50 μL/孔；以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(optical density，OD )。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AS斑塊

HE切片顯示，CON組ApoE-/-小鼠主動脈血管內(nèi)膜光滑完整、彈性纖維排列整齊、管腔未見AS病灶，HFD組ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜明顯增生、管腔局部見巨大AS斑塊向管腔內(nèi)膨隆、病灶內(nèi)見空泡樣泡沫細胞堆積、纖維增生且排列紊亂，PDTC組小鼠主動脈血管內(nèi)形成的AS斑塊面積明顯小于HFD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1和表1)。

圖1 各組ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜組織學(xué)(HE)Fig.1 Aortic intimal histology of ApoE-/- mice in each group (HE)

表1 各組ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜AS斑塊面積Tab.1 Aortic intimal AS plaque area of ApoE-/- mice in each group

2.2 血清SDF-1、IL-1β及TNF-α水平

ELISA試劑盒檢測各組ApoE-/-小鼠血清中SDF-1、IL-1β、TNF-α水平，結(jié)果顯示，與CON組相比，HFD組ApoE-/-小鼠血清SDF-1、IL-1β及TNF-α增高(P<0.05)；與HFD組比較，PDTC組ApoE-/-小鼠血清SDF-1、IL-1β及TNF-α水平降低(P<0.05，表2)。

表2 各組ApoE-/-小鼠血清中SDF-1、IL-1β及TNF-α的水平Tab.2 Levels of serum SDF-1, IL-1β, and TNF-α of ApoE-/- mice in each group

2.3 血清SDF-1、IL-1β、TNF-α水平與AS斑塊面積大小的相關(guān)性

將所有ApoE-/-小鼠血清SDF-1、IL-1β、TNF-α水平與AS斑塊面積大小Perason相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，血清中SDF-1、IL-1β、TNF-α水平與AS斑塊面積呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05，表3)。

表3 ApoE-/-小鼠血清SDF-1、IL-1β、TNF-α水平與AS斑塊面積大小的相關(guān)性Tab.3 Correlation analysis between serum levels of SDF-1, IL-1β, TNF-α, and atherosclerotic plaque area size in ApoE-/- mice

3 討論

隨著AS斑塊內(nèi)炎癥因子不斷被檢測出，AS逐漸被認為是一種慢性進行性炎癥疾病，是心肌梗死和中風(fēng)的根本原因，亦是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因[11]。以往研究表明，AS斑塊是最重要的臨床病理特征，以白細胞浸潤和脂質(zhì)積聚為特征[12]。本課題組前期研究表明，持續(xù)性的動脈炎癥可引起AS斑塊穩(wěn)定性變化，造成斑塊內(nèi)發(fā)生出血、破裂，進而導(dǎo)致猝死的發(fā)生[13]。因此，對炎癥反應(yīng)進行早期干預(yù)、控制將有益于降低AS引起的CHD猝死等不良事件的發(fā)生。

目前研究認為，TNF-α及IL-1β作為NF-κB下游經(jīng)典炎性因子在各種炎性疾病當(dāng)中被廣泛檢測，其表達的變化反映炎性反應(yīng)強度，而PDTC對NF-κB下游的炎癥抑制作用已經(jīng)被證實[14-17]。相比NF-κB下游炎性因子的研究，PDTC對SDF-1的作用研究相對較少，SDF-1來自于CXC趨化因子家族，又稱趨化因子12 (chemokine receptor12, CXCL12) ，由人類第10號染色體上的基因編碼以及由68個氨基酸構(gòu)成的細胞因子，具有強大的細胞趨化作用，CXCL12通過與CXCR4或CXCR7結(jié)合來調(diào)節(jié)細胞活性，這兩種受體蛋白位于細胞膜上，導(dǎo)致多種細胞內(nèi)信號通路的激活[18-19]。最近，生物信息學(xué)技術(shù)對AS芯片數(shù)據(jù)進行差異分析的篩選鑒定結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了SDF-1參與AS發(fā)展進程，SDF-1的來源可能是通過泡沫細胞、內(nèi)皮細胞的分泌[20-22]；促進AS的機制可能是依賴于動脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生SDF-1，從而募集單核巨噬細胞沉積在內(nèi)皮下，進而單核巨噬細胞吞噬脂質(zhì)等物質(zhì)形成泡沫細胞[23-24]。Gao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1通過下調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)的表達，進而減少巨噬細胞的膽固醇外流來加速AS；楊穎博等[26]研究發(fā)表明，急性冠脈綜合征血清中SDF-1水平明顯下降，且隨著病情加重，其水平亦呈下降趨勢；劉衛(wèi)清等[27]結(jié)果提示急性心?；颊咄庵苎猄DF-1濃度上升。本研究結(jié)果顯示，HFD組中ApoE-/-小鼠主動脈SDF-1、TNF-α及IL-1β水平較CON組升高、且相應(yīng)的AS斑塊面積也增大，但給予PDTC后，SDF-1、TNF-α及IL-1β水平及AS斑塊面積均有降低，同時相關(guān)性分析結(jié)果也表明，血清中SDF-1、TNF-α及IL-1β的水平與ApoE-/-小鼠AS斑塊面積存在正相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果可能是PDTC降低了ApoE-/-小鼠血清中SDF-1、TNF-α及IL-1β等炎性蛋白，降低AS斑塊面積的大小，從而減輕了AS的病變程度。

綜上所述，PDTC可以通過降低ApoE-/-小鼠血清中SDF-1、IL-1β及TNF-α的表達，從而減輕AS病變。