孫雁楠， 朱莉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550000； 2.貴陽市婦幼保健院 兒童消化科， 貴州 貴陽 550000)

鈉-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)缺陷病是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種遺傳性膽汁酸代謝疾病，是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族10成員(solute carrier family 10 member 1，SLC10A1)雙等位基因突變導(dǎo)致NTCP功能障礙[1]。研究顯示NTCP缺陷與新生兒高膽紅素血癥及嬰兒早期膽汁淤積癥有關(guān)[2-4]。NTCP位于肝細(xì)胞基底外側(cè)膜上，可將血漿結(jié)合型膽汁酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，當(dāng)NTCP功能異常時(shí)肝臟攝取膽汁酸障礙，血液中膽汁酸堆積，引起高膽汁酸血癥為主要表現(xiàn)的血清學(xué)指標(biāo)異常，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)可促成該病[5-6]。NTCP缺陷病在兒童和成人中均可發(fā)病，共同特征均為血漿中持續(xù)升高的膽汁酸[2-3，7]，該病于2015年首次報(bào)道[7]，國(guó)內(nèi)外報(bào)道案例散發(fā)[1-4，6-13]，對(duì)本病的遺傳學(xué)特征、臨床表現(xiàn)、治療及遠(yuǎn)期預(yù)后尚無統(tǒng)一定論,需要更多研究和報(bào)告進(jìn)一步充實(shí)，因此本研究對(duì)經(jīng)基因檢測(cè)確診的11例NTCP缺陷患兒肝功能及基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019—2021年經(jīng)高通量基因測(cè)序確診的NTCP缺陷病患兒作為研究對(duì)象，要求年齡≤14歲，膽汁酸升高為主，伴有或不伴有其他肝功能指標(biāo)異常，遺傳代謝性基因檢測(cè)完善及院外未進(jìn)行治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病例資料不完善；(2)解剖結(jié)果為異常、感染、藥物、靜脈營(yíng)養(yǎng)等所致肝功能異常。共納入NTCP缺陷病患兒11例，男性6例(54.5%)、女性5例(45.5%)，同時(shí)選取患兒父親11人、母親11人作為參照，行高通量基因測(cè)序。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2022-39)及患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1一般臨床資料 收集NTCP缺陷病患兒的年齡、性別、主訴、出生史、胎產(chǎn)次、喂養(yǎng)史、家族史及新生兒期黃疸情況等一般臨床資料。

1.2.2肝功能 抽取患兒入院治療前清晨空腹靜脈血5 mL，采用西門子全自動(dòng)化分析儀[西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]及相應(yīng)試劑盒檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT；參考值0～40 U/L)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST；參考值0～40 U/L)、總膽紅素(total bile acid，TBIL；參考值0～17 μmol/L)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL；參考值0～5.1 μmol/L)、間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL；參考值0～13.7 μmol/L)、膽汁酸(total bile acid，TBA；參考值0～10 μmol/L)。出院后定期于門診隨診復(fù)查上述指標(biāo)。

1.2.3高通量測(cè)序 取患兒及父母外周血3 mL，置于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管中送至北京麥基諾基醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)公司進(jìn)行遺傳代謝性肝病573個(gè)基因panelV2檢測(cè)，目標(biāo)基因片段通過第2代高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序；突變基因依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)(american college of medical genetics and genomics，ACMG)發(fā)布的變異解讀指南進(jìn)行致病性分析。

1.2.4危害性預(yù)測(cè) 發(fā)現(xiàn)明確或可疑與臨床表型相關(guān)的基因突變時(shí)，對(duì)患兒突變基因與其父母基因進(jìn)行Sanger驗(yàn)證，并運(yùn)用Rare Exome Variant Ensemble Learner(REVEL)、Sortig Intolerant from Tolerant(SIFT)、PolyPhen-2、Mutationtation Taster、Genomic Evolutionary Rate Profiling(GERP+)5種生物信息學(xué)蛋白功能綜合性預(yù)測(cè)軟件對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行危害預(yù)測(cè)。

1.2.5隨訪 出院后于消化科門診隨訪1年，每次復(fù)診當(dāng)日空腹抽取靜脈血5 mL進(jìn)行ALT、AST、TBA、TBIL、DBTL及IBIL等肝功能指標(biāo)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

11例基因檢測(cè)確診的NTCP缺陷病患兒男性6例(54.5%)、女性5例(45.4%)，男女比例1.2 ∶1，就診年齡3～219 d、平均(60.37±71.20)d，確診年齡40～221 d、平均(99.82±69.63)d，混合喂養(yǎng)5例、人工喂養(yǎng)1例及母乳喂養(yǎng)5例，因黃疸就診3例、腹瀉就診1例、體檢發(fā)現(xiàn)肝功能異常就診2例、當(dāng)?shù)匦律鷥嚎谱≡喊l(fā)現(xiàn)TBA升高轉(zhuǎn)診本院5例，患兒直系親屬中有肝衰竭病史1例、母親孕期合并高TBA血癥1例、余9例家族史無特殊，新生期出現(xiàn)黃疸4例(其中有1例診斷新生兒ABO溶血)、7例無黃疸。

2.2 肝功能情況

11例NTCP缺陷病患兒中ALT升高占比72.7%(8/11)，AST升高占比72.7%(8/11)，TBA升高占100%(11/11)，TBIL升高占比54.5%(6/11)，DBIL升高占比63.6%(7/11)，IBIL升高占比36.4%(4/11)；NTCP缺陷病患兒都存在單項(xiàng)或多項(xiàng)肝功能指標(biāo)異常，但都存在TBA升高；肝功能指標(biāo)除TBA外，余各項(xiàng)指標(biāo)在隨訪過程中呈下降趨勢(shì)(病例1、5患兒失訪)，隨訪4～8周后，ALT、AST、TBIL、DBIL及IBIL恢復(fù)正常有5、4、2、1及2例，TBA在治療后一段時(shí)間內(nèi)仍呈高水平，但隨著隨訪時(shí)間延長(zhǎng)TBA總體呈下降趨勢(shì)。見表1和圖1。

表1 NTCP缺陷病患兒治療前的肝功能指標(biāo)Tab.1 Pre-treatment liver function indicators in children with NTCP deficiency

注：A～F分別為ALT、AST、TBA、TBIL、DBIL及IBIL隨訪情況；P表示病例，數(shù)字為病例順序號(hào)，其中P1、P5表示失訪。圖1 NTCP缺陷病患兒隨訪期間的肝功能變化Fig.1 Changes in liver function during follow-up of children with NTCP deficiency disease

2.3 基因分析

11例NTCP缺陷病患兒基因測(cè)序結(jié)果顯示，染色體chr14:70245193上SLC10A1基因均存在相同突變位點(diǎn)，系第800號(hào)核苷酸由胞嘧啶C變?yōu)樾叵汆奏(c.800C>T)的純合突變，上述突變導(dǎo)致第267號(hào)氨基酸由絲氨酸變?yōu)楸奖彼?p.S267F)，屬于錯(cuò)義突變；與父母基因比對(duì)，結(jié)果顯示11例NTCP缺陷病患兒基因突變均來源于父母雙方，父母均為SLC10A1基因(c.800C>T)突變攜帶者。見圖2。

注：紅色曲線表示胸腺嘧啶T，黑色曲線表示鳥嘌呤G，綠色曲線表示腺嘌呤A，藍(lán)色曲線表示胞嘧啶C；紅色箭頭表示變異位點(diǎn)定位。圖2 病例1號(hào)與父母SLC10A1基因的Sanger驗(yàn)證Fig.2 Sanger validation of SLC10A1 gene between case 1 and parents

2.4 突變位點(diǎn)危害性的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

所有NTCP缺陷病患兒SLC10A1基因(c.800C>T)經(jīng)REVEL軟件預(yù)測(cè)結(jié)果為良性，經(jīng)SIFT、P0lyPhen-2、Mutationtation Taster、GERP+預(yù)測(cè)結(jié)果均為有害。

2.5 其他變異信息

11例NTCP缺陷病患兒除檢測(cè)到與疾病表型高度相關(guān)的SLC10A1基因(c.800C>T)突變外，還檢測(cè)到與臨床相關(guān)性不明確位點(diǎn)134個(gè)，這些基因與肝豆?fàn)詈俗冃?、高密度脂蛋白缺乏病、Gilbert綜合征等多種疾病有關(guān)，其中UGT1A1基因(c.211G>A，p.G71R)在11名患兒中出現(xiàn)頻率最高(4/11)，該基因突變表型與Gilbert綜合征、Crigler-Najjar綜合征、家族性暫時(shí)性新生兒高膽紅素血癥有關(guān)，且以黃疸為主要表現(xiàn)、IBIL升高為主、通常不伴TBA的升高，但本研究中攜有UGT1A1基因(c.211G>A)突變的病例中，2例有黃疸表現(xiàn)，但血生化以DBIL升高為主，且TBA明顯升高，故與患兒的臨床表型不相符。見表2。

表2 NTCP缺陷病患兒與臨床相關(guān)性不明確的突變位點(diǎn)結(jié)果Tab.2 Results of mutation loci with unclear clinical relevance in children with NTCP defect

注：—表示未檢測(cè)出。

3 討論

NTCP是肝細(xì)胞發(fā)揮Na+依賴吸收功能的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合與非結(jié)合性TBA，在TBA的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，對(duì)前者更具有親和力[14]。研究顯示，NTCP還可作為乙肝及丁肝病毒進(jìn)入肝細(xì)胞的受體，人類SLC10A1基因突變使NTCPTBA轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，血中TBA升高導(dǎo)致NTCP缺陷病的發(fā)生[15-16]；另一方面SLC10A1基因突變可消除甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)或丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)感染肝細(xì)胞的能力[17]。本研究11例確診NTCP缺陷病患兒，確診年齡40～221 d，男孩多于女孩。關(guān)于NTCP缺陷病的臨床表現(xiàn)報(bào)道存在差異，Vaz等[7]研究顯示NTCP缺陷病例表現(xiàn)為肌張力減低；Liu等[18]研究則提示為25(0H)D缺乏；孫文君等[8]研究顯示2例患兒中1例黃疸，血清25(OH)D缺乏，1例表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育落后。本研究因黃疸首次就診者3例，肝功能指標(biāo)以TBA、ALT、AST、DBIL及TBIL升高為主，臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查與肝細(xì)胞性黃疸患者相似，入院初診為嬰兒膽汁淤積性肝??；另有部分患兒因其他系統(tǒng)疾病或體檢發(fā)現(xiàn)TBA升高，無瘙癢等高TBA中毒表現(xiàn)，臨床上易漏診。研究顯示NTCP缺陷與新生兒期高膽紅素血癥和部分嬰兒早期的膽汁淤積有關(guān)[2-4]。發(fā)生機(jī)制與 NTCP缺陷病在肝細(xì)胞基底側(cè)膜上的另一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1(organic anion transporting polypeptide 1B1，OATP1B1)/有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B3(organic anion transporting polypeptide 1B3，OATP1B3)的代償作用有關(guān)，OATP1B1/OATP1B3蛋白特異性底物范圍廣泛，能將血漿中的非結(jié)合TBA、膽紅素、內(nèi)源性激素、外源性毒性物質(zhì)攝入肝臟[19]，緩解NTCP缺陷導(dǎo)致的高TBA環(huán)境，但是NTCP缺陷病患兒明顯升高的血漿TBA又可競(jìng)爭(zhēng)性抑制OATP1B1/OATP1B3攝取膽紅素的功能，導(dǎo)致膽紅素繼發(fā)性升高[9-10]。

目前NTCP缺陷病經(jīng)報(bào)道的SLC10A1基因突變位點(diǎn)有c.(800.C>T)、c. 755G >A (p.Arg252His)、c.615-618del(p.Ser206Profs*12)、c.263T>C(p.lle88Thr)及c.595A>C(p.Ser199Arg)，近期國(guó)內(nèi)還報(bào)道了2種新的致病突變c.374dupG和c.682_683delCT，目前SLC10A1突變基因譜在不斷更新[1，4，7，11]。自2015年國(guó)外報(bào)道首例NTCP缺陷病兒童病例以來，截至目前，我國(guó)共報(bào)道了80余例NTCP缺陷病兒童[1，5，9，12-13，18，20]，約94.5%的患兒SLC10A1上存在c.800C>T純合突變[21]。本研究11例NTCP缺陷患兒均為SLC10A1 c.800C>T(p.Ser267Phe)純合突變，其父母均為c.800C>T(p.Ser267Phe)的突變基因攜帶者，表明c.800C>T(p.Ser267Phe)是SLC10A1高頻突變位點(diǎn)。目前報(bào)道的病例大部分為純合突變，少部分為雜合突變，Dong等[20]研究中13例NTCP缺陷兒童中c.800C>T(p.Ser267Phe)純合突變12例，c.812A>G(p.Asn271Ser)復(fù)合雜合突變僅1例。

NTCP缺陷病目前尚缺乏確切的治療手段，臨床以對(duì)癥治療為主[3]。本研究結(jié)果顯示，NTCP缺陷病患兒肝功能指標(biāo)呈單項(xiàng)或多項(xiàng)指標(biāo)異常，TBA升高為共同特征。根據(jù)患兒具體情況，個(gè)體化的選擇治療方案：當(dāng)嚴(yán)重肝酶升高時(shí)，使用保肝藥物復(fù)方甘草酸苷、還原型谷胱甘肽、葡醛內(nèi)酯等聯(lián)合熊/鵝去氧膽酸、消膽胺等利膽藥物治療；當(dāng)膽汁淤積時(shí)使用保肝、利膽藥物，予高三酰甘油配方奶粉喂養(yǎng)，口服益生菌、補(bǔ)充脂溶性維生素并聯(lián)合使用利膽藥物治療。此外，本研究NTCP缺陷病患兒門診隨訪結(jié)果提示：肝酶、膽紅素等指標(biāo)在短期內(nèi)降至正常，TBA波動(dòng)幅度較大，但最終呈下降趨勢(shì)，總體治療效果良好。有研究指出OATP1B1/OATP1B3蛋白表達(dá)量可隨年齡增長(zhǎng)而增加，推測(cè)其對(duì)NTCP缺陷的代償作用隨年齡增長(zhǎng)而增強(qiáng)[22]。同時(shí)，生后1歲時(shí)分子翻譯后的糖基化過程對(duì)于NTCP在肝細(xì)胞膜基底側(cè)的正確定位至關(guān)重要，推測(cè)NTCP缺陷病患兒TBA可能不會(huì)無限升高，可能隨著年齡增長(zhǎng)逐漸改善[23]。

關(guān)于NTCP的表達(dá)與調(diào)控，法尼醇受體及其他核受體使肝TBA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生適應(yīng)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，下調(diào)NTCP、減少TBA攝取，并誘導(dǎo)替代性基底外側(cè)流出蛋白有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體α/β(organic solute transporter α/β，OSTα/β)、多重耐藥相關(guān)蛋白3(multidrug resistant associated 3，MRP3)等促進(jìn)TBA外排，緩解高濃度TBA對(duì)肝細(xì)胞的損害[24-25]。此外，國(guó)外研究表明，牛磺石膽酸(taurolithocholic acid，TLC)可持久抑制NTCP蛋白的表達(dá)，而環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)能通過促使容納NTCP蛋白的細(xì)胞囊泡進(jìn)入肝細(xì)胞膜迅速上調(diào)NTCP蛋白的表達(dá)[26]。

NTCP缺陷病共同特征為頑固性高TBA血癥，由于部分兒童病例表現(xiàn)為膽汁淤積使黃疸成為相對(duì)常見的NTCP缺陷病首診原因，而成人病例中大都無癥狀，少部分育齡期女性表現(xiàn)為妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥，導(dǎo)致剖宮產(chǎn)率的增加[27]。因缺乏陽性癥狀導(dǎo)致本病識(shí)別困難，可能是目前NTCP缺陷病報(bào)道較少的原因之一。

目前隨著對(duì)NTCP分子機(jī)制深入的研究，不斷有新的變異位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，豐富了SLC10A1基因變異譜，引起人們對(duì)本病的更多的重視；目前尚未出現(xiàn)有關(guān)本病導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭等終末期肝病的報(bào)道，結(jié)合其代償機(jī)制OATPlBI/OATPlB3表達(dá)量呈年齡依賴性增加的特點(diǎn)，關(guān)于NTCP缺陷病是否需要積極治療還存在疑問，對(duì)其遠(yuǎn)期預(yù)后的判斷可能需要一個(gè)較長(zhǎng)的觀察隨訪過程。