豆智華，楊迎春，楊 潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830046）

駝乳富含多種維生素及礦物質(zhì)，其蛋白質(zhì)、脂類、氨基酸、微生物等物質(zhì)的組成含量與其他乳類有顯著差異。與牛乳、羊乳等常見的反芻動(dòng)物乳相比，駝乳具有低糖、低膽固醇、高礦物質(zhì)（鉀、鈉、銅、鐵、鎂和鋅）、高維生素和高濃度胰島素的特性[1-3]。同時(shí)由于駝乳中含有豐富的α-乳白蛋白，不含β-乳球蛋白或含量很少，具有與母乳相似的蛋白組成，一般不會(huì)引發(fā)牛乳蛋白過敏癥[4]。隨著對(duì)駝乳營養(yǎng)價(jià)值及生物學(xué)功能研究，大眾對(duì)駝乳營養(yǎng)價(jià)值和保健功能的認(rèn)知度越來越高，駝乳及其乳制品受到越來越多消費(fèi)者的青睞，以前一直被忽視的一些低豐度蛋白質(zhì)已經(jīng)成為乳蛋白研究中的重要組成部分。

乳脂作為乳的重要組成部分，約占總?cè)槌煞值?%～5%，主要是以圓球/橢圓球形狀的脂肪球形式存在于乳中。乳脂肪球一般以球狀小液滴的方式存在于乳中，直徑約為0.2～15 μm，表面覆蓋著一層10～20 nm的薄膜，稱為乳脂肪球膜（milk fat globule membranes，MFGM）[5-6]。MFGM上的25%～70%的膜蛋白，稱為乳脂球膜蛋白（milk fat globule membrane proteins，MFGMP）[7]。MFGMP是膜結(jié)合的蛋白，主要是吸附在乳脂肪球的表面，包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、酶、中性脂質(zhì)和極性脂類（如磷脂和鞘糖脂）等[8]。MFGMP作為MFGM的主要組成成分，以不對(duì)稱的形式分布在乳脂肪球中，占MFGM總量的25%～60%，僅占乳中蛋白質(zhì)總量的1%～2%[9]。MFGMP雖然只占總?cè)榈鞍椎囊恍〔糠?，但卻具有豐富的生物學(xué)功能，其營養(yǎng)價(jià)值和組成分布取決于不同物種的乳[10-11]。目前人乳、山羊乳、牛初乳與常乳、驢初乳與常乳等之間MFGMP的組成的差異已經(jīng)被廣泛研究[12-17]，但雙峰駝乳的乳脂肪球膜蛋白組成、以及與牛乳的乳脂肪球模蛋白之間組成的差異尚未被探討。本實(shí)驗(yàn)以雙峰駝乳和牛乳為研究對(duì)象，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）對(duì)2種乳的MFGMP蛋白進(jìn)行組成分析，基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)雙峰駝乳的MFGMP進(jìn)行鑒定，并通過基因本體（Gene Ontology，GO）功能注釋、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路分析等生物信息學(xué)方法對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行功能及作用的生物學(xué)途徑的探討，為駝乳和其乳制品在乳品行業(yè)的進(jìn)一步應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳：選擇烏魯木齊紅雁池的哈族村自然放牧的10 峰雙峰駱駝；現(xiàn)場(chǎng)采集駝乳混勻后用低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃中保存?zhèn)溆?。牛乳：采自農(nóng)十二師五一農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)的奶牛，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

ImmobilineTMDryStrip pH3-10 NL、IPG Buffer美國GE公司；四甲基乙二胺、三(羥甲基)氨基甲烷、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、硫脲、溴酚藍(lán)、尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、低熔點(diǎn)瓊脂糖、無水乙醇、冰醋酸、蛋白質(zhì)染色試劑 生工生物工程（上海）股份有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸 美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸 美國Thermo Scientific公司；Mass Standards Kit for Proteomics Analyzer 美國ABI公司；非預(yù)染蛋白Marker 美國Fermentas公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini Protein II型垂直電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；DYY-10型三恒電泳儀 北京六一儀器廠；ALPHA 1-2 LD型真空冷凍干燥機(jī) 德國賀利氏公司；Alphalmager 2200型凝膠處理及分析系統(tǒng) 美國阿爾法公司；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Heal Force NW系列低溫離心機(jī) 美國Sigma公司；UV-1600型分光光度儀 美譜達(dá)儀器公司；BYJ0型純水裝置 美國摩爾公司；SE-600型電泳儀、ImageScannerIII型光密度掃描儀、LX300冷卻水循環(huán)系統(tǒng) 美國GE公司；4800 Plus型MALDI TOF/TOFTM Analyzer、Opti-TOF 123 mm×81 mm美國ABI公司；Q Exactive LC/MS二級(jí)質(zhì)譜儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 MFGMP的提取

MFGMP提取方法1：取新鮮雙峰駝乳乳樣1 000 mL，在4 ℃、5 000 r/min離心15 min，上層為含MFGM的乳脂肪。將離心得到的乳脂肪置于50 mL離心管中，加入40 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），攪拌均勻后8 000 r/min離心15 min，除去上清液，重復(fù)清洗乳脂肪2次（目的將脂肪中殘留的酪蛋白膠束清洗干凈）后收集即為乳脂肪球。用超純水溶解乳脂肪球，37 ℃搖床孵育10 min（清洗殘留的PBS）后，在4 ℃、8 000 r/min離心15 min后將取上層乳脂肪，4 ℃過夜使其結(jié)晶化；棄去上清液，用超純水溶解沉淀，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。次日，往結(jié)晶化的乳脂肪球膜中加入超純水用磁珠攪拌器均質(zhì)20 min后45 ℃水浴30 min以促進(jìn)乳脂肪熔化，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，所得沉淀即為MFGMP。

MFGMP提取方法2：取新鮮雙峰駝乳乳樣1 000 mL，在4 ℃、5 000 r/min離心15 min，上層為含MFGM的乳脂肪。將離心得到的乳脂肪置于50 mL離心管中，加入40 mL PBS，攪拌均勻后在4 ℃、8 000 r/min離心15 min，除去上清液，重復(fù)清洗乳脂肪3次（目的將脂肪中殘留的酪蛋白膠束清洗干凈）后收集即為乳脂肪球。用超純水溶解乳脂肪球，37 ℃搖床孵育10 min（清洗殘留的PBS）后，8 000 r/min離心15 min后將取上層乳脂肪，4 ℃過夜使其結(jié)晶化；棄去上清液，用超純水溶解沉淀，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩４稳?，再往MFGM組分中加入超純水用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)超聲（超聲2 s，間隔8 s，共20 min），使MFGM均質(zhì)。將均質(zhì)后MFGM置于45 ℃搖床中孵育30 min促進(jìn)乳脂肪熔化后在4 ℃、10 000 r/min離心15 min后，所得沉淀即為MFGMP。

在實(shí)驗(yàn)室用同樣的方法來提取牛乳的MFGMP。將方法1和方法2中所得到的MFGMP用分別超純水溶解，并用2D蛋白定量試劑盒檢測(cè)MFGMP的濃度。所得MFGMP樣品于-80 ℃中預(yù)凍后用冷凍干燥機(jī)凍干保存，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SDS-PAGE

電泳前樣品的制備：準(zhǔn)確稱取3 mg的MFGMP凍干粉，分別用500 μL超純水溶解混勻。將溶解的樣品（40 μL）與SDS-PAGE樣品緩沖液（10 μL）混合，沸水浴10 min后，12 000 r/min離心5 min。

配制8%、10%、12%、13%、15%的分離膠及5%的濃縮膠，每孔上樣10 μL。采用恒流電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料前沿遷移至凝膠底部約0.5 cm時(shí)，停止電泳，凝膠染色后脫色至無背景色、顯現(xiàn)清晰的條帶。采用Alphalmager 2200系統(tǒng)掃描凝膠，凝膠蛋白條帶相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)含量的信息利用Gel-PRO ANALYZER軟件進(jìn)行凝膠定量分析，P＜0.05，差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行電泳圖譜差異性分析。所有的樣品均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。蛋白條帶的相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)含量用表示。

1.3.3 2-DE

1.3.3.1 第一向等電點(diǎn)聚焦

采用預(yù)制IPG干膠條（pH 3～10 NL，13 cm），蛋白上樣量為60 μg。將蛋白樣品與水化液相互混勻，加入IPG水化盤，將IPG膠條完全放入樣品溶液后，20 ℃左右過夜水化（至少20 h）后進(jìn)行等電聚焦電泳，設(shè)置膠條等電點(diǎn)聚焦（IPGphor）儀器的運(yùn)行依據(jù)。等電點(diǎn)聚焦參數(shù)見表1。

表1 等電聚焦電泳參數(shù)Table 1 Operating parameters of isoelectric focusing electrophoresis

1.3.3.2 第二向SDS-PAGE分析

等電點(diǎn)聚焦結(jié)束后，將膠條分別放在10 mL的平衡液I（含100 mg DTT）和10 mL的平衡液II中（含250 mg碘乙酰胺）分別平衡15 min。平衡結(jié)束后，用電極緩沖液潤洗1～2 s，進(jìn)行SDS-PAGE。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至膠底部0.5 cm處停止電泳，然后進(jìn)行凝膠染色，每個(gè)蛋白樣品至少重復(fù)3次，用Image MasterTM2D Platinum進(jìn)行2-DE圖譜的分析。

1.3.4 LC-MS/MS測(cè)定

樣品處理：取凍干后100 μg的MFGMP的樣品加入到30.93 μL尿素（8 mol/L含0.1% SDS）、41 μL超純水（含0.1% SDS）、9 μL三乙基碳酸氫銨（500 mmol/L）中，還原后加入胰酶，37 ℃振蕩酶切過夜。樣品分級(jí)：用強(qiáng)陽離子交換色譜進(jìn)行樣品分級(jí)（A液：5 mmol/L KH2PO4pH 2.55、20%乙腈、H3PO4，B液：5 mmol/L KH2PO4pH 2.75、20%乙腈、600 mmol/L KCl、H3PO4），樣品用A液稀釋5 倍，調(diào)pH值到2.5，離心取后上清上樣，洗脫。收集上樣流出液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜條件：液相梯度洗脫（A液：99.9%水、0.1%甲酸，B液：99.9%乙腈、0.1%甲酸）。檢測(cè)質(zhì)譜全掃描范圍m/z350～1 800。全掃描中選擇離子強(qiáng)度TOP20的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定。母離子使用HCD方法碎裂后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙峰駝乳MFGMP提取方法的選擇

選取2種方法提取雙峰駝乳中MFGMP，結(jié)果如圖1所示，2種方法（泳道1、2、3和泳道6、7、8、9）所提取的MFGMP在SDS-PAGE圖譜中的蛋白條帶分布有所差異。提取MFGMP方法中PBS的作用是清洗殘留在MFGM上的酪蛋白膠束，泳道5為PBS清洗后離心得到的沉淀，它在電泳圖譜中的高豐度蛋白條帶集中在30～35 kDa之間，這與酪蛋白的分子質(zhì)量吻合，因此可進(jìn)一步判斷PBS清洗后的沉淀主要為酪蛋白。方法1所分離的雙峰駝乳MFGMP與PBS清洗后沉淀中的高豐度酪蛋白，說明在提取過程中PBS后未將MFGM上吸附的酪蛋白清洗干凈。泳道6～9為優(yōu)化后的方法2所分離的雙峰駝乳MFGMP電泳圖，幾乎沒有酪蛋白及其他雜蛋白影響。值得注意的是，方法2所分離的雙峰駝乳MFGMP的電泳圖與文獻(xiàn)報(bào)道的綿羊MFGMP的SDS-PAGE圖譜的蛋白條帶分布大致相同，雖然部分蛋白組分還是有所差異，這可能是由于乳的來源不同造成的。由SDS-PAGE結(jié)果除了可以看出不同方法在提取雙峰駝乳MFGMP的差異，還可以得出在提取過程中用超純水洗后離心沉淀與過夜結(jié)晶溶解脂肪后離心沉淀的蛋白質(zhì)條帶分布基本相同，推斷方法2用超純水清洗過程中不僅可以排除雜蛋白的干擾外，而且不至于損失過多MFGMP，得到的MFGMP純度較高，因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中都采用方法2提取雙峰駝乳的MFGMP。

圖1 不同提取方法雙峰駝乳MFGMP的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE profile of MFGMP from bactrian camel milk extracted by different extraction methods

2.2 雙峰駝乳和牛乳中MFGMP的SDS-PAGE差異

同一批次提取的牛乳及雙峰駝乳MFGMP的SDSPAGE差異見圖2，同一批次提取的雙峰駝乳MFGMP（泳道2、3、4）中高豐度蛋白質(zhì)電泳圖譜表現(xiàn)為一致性，蛋白條帶分布基本相同；而不同批次提取的雙峰駝乳MFGMP（泳道5、6與2、3、4）中高豐度蛋白的圖譜較為一致，但是部分低豐度的蛋白存在差異，這可能與提取MFGMP的乳脂肪原料、乳脂肪球過夜結(jié)晶后的均質(zhì)化和溶解脂肪的溫度、時(shí)間有關(guān)。結(jié)果表明：牛乳和雙峰駝乳MFGMP的電泳圖譜具有一定的差異，在60～70 kDa分子質(zhì)量范圍，牛乳與雙峰駝乳MFGMP的高豐度蛋白（依據(jù)分子質(zhì)量推測(cè)為嗜乳脂蛋白（butyrophilin，BTN）分子質(zhì)量有明顯區(qū)別。與雙峰駝乳相比，牛乳MFGMP中200 kDa以上和40 kDa以下的蛋白條含量較低或缺失，30 kDa左右（推測(cè)為GTP-結(jié)合蛋白）蛋白條帶幾乎不存在。本實(shí)驗(yàn)中雙峰駝乳、牛乳MFGMP與文獻(xiàn)中的牛乳、山羊乳MFGMP中的高豐度蛋白條帶分布基本一致[13,16]，MFGMP中的高豐度蛋白分別為黏液素1（mucins 1，MUC1）、黃嘌呤氧化還原酶/脫氫酶（xanthine oxidoreductase，XO/XDH）、黏液素15（mucins 15，PAS III）、CD36（或PAS IV）、BTN、乳凝集素（乳脂肪球-EGF因子8（milk fat globule-EGF factor VIII，MFG-E8）或PAS6/7）、GTP結(jié)合蛋白（GTP-binding protein）及脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acidbinding protein，F(xiàn)ABP）等。乳的來源不同，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量略有不同，因此來源于駝乳、牛乳、山羊乳的MFGMP中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量都略有差異。

圖2 牛乳和雙峰駝乳中MFGMP的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE profile of MFGMP from bovine milk and bactrian camel milk

選取用不同濃度的分離膠分離提取的牛乳和雙峰駝乳MFGMP，并利用Gel-PRO ANALYZER軟件同時(shí)分析不同濃度分離膠的電泳圖譜，計(jì)算各蛋白質(zhì)組分的相對(duì)含量，并通過蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker的遷移率確定蛋白條帶的相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果見圖3和表2。根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的MFGMP相關(guān)信息推測(cè)MFGMP組分F1為MUC1，F(xiàn)3為XO/XDH，F(xiàn)5為PAS III，F(xiàn)6/F7為CD36，F(xiàn)9為BTN，F(xiàn)11/F12為乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7），F(xiàn)14為GTP-binding protein，F(xiàn)19為FABP。

圖3 牛乳和雙峰駝乳中MFGMP的不同濃度分離膠的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE profile of different concentrations of MFGMP isolates from bovine and Bactrian camel milk

表2 雙峰駝乳和牛乳中MFGMP的組分信息Table 2 Information on the components of MFGMP in bovine milk and bactrian camel milk

2.3 雙峰駝乳和牛乳中MFGMP的2-DE圖譜差異

相同條件下，利用2-DE技術(shù)對(duì)從牛乳和雙峰駝乳中提取的MFGMP進(jìn)行分離分析，為提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究對(duì)每個(gè)樣品至少重復(fù)3次。牛乳MFGMP中可檢測(cè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)為1 304、1 235、1 358，雙峰駝乳MFGMP中可檢測(cè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為925、870、1 003（表3），表明所得2-DE圖譜具有較好的重復(fù)性，可以滿足分離分析的要求。由于MFGMP分別來自于駝、牛兩個(gè)不同的物種，MFGMP組分相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)差異較大，所以無法匹配共同斑點(diǎn)而進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)差異性分析。如圖4所示，雙峰駝乳和牛乳的MFGMP的2-DE圖譜中存在3個(gè)相似的蛋白斑點(diǎn)區(qū)域（如圖4A和圖4D中紅色標(biāo)記區(qū)域），同時(shí)，雙峰駝乳和牛乳的MFGMP的2-DE圖譜中存在兩個(gè)顯著差異的蛋白斑點(diǎn)區(qū)域（如圖4A和圖4D中藍(lán)色標(biāo)記區(qū)域）。參照文獻(xiàn)中牛乳MFGMP[18]和綿羊乳MFGMP[19]的2-DE圖譜，根據(jù)文獻(xiàn)中所報(bào)道的蛋白斑點(diǎn)信息，推測(cè)圖與4A、D中紅色標(biāo)記區(qū)域中相同的蛋白斑點(diǎn)，從低等電點(diǎn)到高等電點(diǎn)分別是BTN、MFG-E8、脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP或PLIN2）。

圖4 牛乳和雙峰駝乳中MFGMP的2-DE凝膠圖譜Fig. 4 2-DE gel profiles of MFGMP from bovine milk and bactrian camel milk

表3 牛乳和雙峰駝乳MFGMP的2-DE凝膠斑點(diǎn)數(shù)Table 3 Number of 2-DE spots for MFGMP from bovine milk and bactrian camel milk

2.4 雙峰駝乳MFGMP的質(zhì)譜鑒定

為了進(jìn)一步確認(rèn)雙峰駝乳的MFGMP具體蛋白組分，從NCBI下載蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫用于質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)庫為txid419612-Camelus-ferus-refseq-23637s.fast，23637entries，用Proteome Discoverer軟件進(jìn)行搜庫分析。與數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)，二級(jí)質(zhì)譜成功鑒定出雙峰駝乳的MFGMP中有2 086個(gè)蛋白組分；其中120個(gè)蛋白組分得分大于100；有14個(gè)蛋白組分相對(duì)豐度大于1%（表4），其中有4個(gè)為酪蛋白組分，可能是在MFGMP分離過程中酪蛋白未清洗完全。質(zhì)譜結(jié)果表明，雙峰駝乳中高豐度MFGMP組分依次為：BTN、XO/XDH、乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）、脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP或PLIN2）等。

表4 雙峰駝乳MFGMP的二級(jí)質(zhì)譜鑒定結(jié)果（部分高豐度蛋白）Table 4 Secondary mass spectrometric identification of some highabundance MFGMP from bactrian camel milk

2.5 雙峰駝乳MFGMP的GO注釋和KEGG通路代謝路徑分析

為進(jìn)一步了解雙峰駝乳的MFGMP的功能，將MFGMP用DAVID在線分析進(jìn)行蛋白質(zhì)的GO注釋和KEGG代謝路徑分析。如圖5A～C所示，分別對(duì)其生物學(xué)過程、細(xì)胞成分以及分子功能進(jìn)行分析和歸類。雙峰駝乳的MFGMP的主要參與很多生物途徑，其中有16.59%的蛋白參與翻譯和翻譯的起始，10.25%蛋白參與氧化還原過程，8.3%的蛋白參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，7.81%蛋白參與蛋白質(zhì)折疊，其余的蛋白參與了細(xì)胞間黏附、ER相關(guān)的泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控、ER到高爾基體囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)加工響應(yīng)線粒體去極化的線粒體自噬等。雙峰駝乳的MFGMP，13.36%為膜、11.54%為胞質(zhì)溶膠、9.54%為線粒體、6.11%為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物、蛋白酶體輔助復(fù)合物、高爾基體；雙峰駝乳的MFGMP的分子功能主要是結(jié)合活性和分子催化，其中結(jié)合活性包括poly(A) RNA結(jié)合、mRNA結(jié)合、翻譯起始因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合、糖蛋白結(jié)合、受體結(jié)合、肝素結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等多個(gè)分子功能。

采用DAVID分析對(duì)雙峰駝乳的MFGMP進(jìn)行KEGG代謝路徑分析，結(jié)果有399種蛋白有代謝路徑信息，共有37個(gè)代謝路徑，其中前20個(gè)代謝路徑見圖5D，分別核糖體、蛋白體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、內(nèi)吞作用氧化磷酸化、脂肪酸代謝、非酒精性脂肪肝、軍團(tuán)病、不飽和脂肪酸的生物合成、抗生素的生物合成、PPAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑、碳代謝等代謝途徑。

圖5 駝乳MFGMP的GO注釋和KEGG代謝路徑分析圖Fig. 5 GO annotation and KEGG metabolic pathway analysis of MFGMP from bactrian camel milk

3 討 論

本研究以牛乳和雙峰駝乳為原料經(jīng)優(yōu)化提取方法后，利用SDS-PAGE和2-DE技術(shù)對(duì)雙峰駝乳與牛乳中MFGMP進(jìn)行分離分析。研究結(jié)果表明，雙峰駝乳、牛乳中的MFGMP中BTN的相對(duì)含量最高，分別為（22.55±1.52）%、（24.05±1.94）%，其次是XO/XDH，分別為（15.12±0.71）%、（18.54±1.36）%，這與Ye Aiqian等[20]報(bào)道的牛乳MFGMP中含量最高的為BTN，其次為XO的結(jié)果一致，但是相對(duì)含量有所差異，可能是乳的來源不同造成。牛乳MFGMP中乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）糖基化程度不同使它們的分子質(zhì)量不同，乳凝集素是繼BTN之后最豐富的MFGM糖蛋白，分子質(zhì)量范圍為43～59 kDa[21]。山羊乳在50～55 kDa范圍表現(xiàn)為2個(gè)蛋白條帶，占MFGMP的7.9%，變異系數(shù)低[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙峰駝乳、牛乳MFGMP中F11/F12兩個(gè)蛋白組分與乳凝集素相對(duì)分子質(zhì)量一致，分別為47.51±0.24/43.76±0.27，48.31±0.15/43.88±0.73，乳凝集素在雙峰駝乳、牛乳MFGMP中相對(duì)含量僅次于XO/XDH，分別為11%、17%左右。當(dāng)乳冷卻和攪動(dòng)時(shí)，MUC1容易從脂肪球上脫落到脫脂乳中。本研究所分離的雙峰駝乳MFGMP樣品在大于200 kDa范圍存在2個(gè)蛋白條帶，可以說明MUC1在雙峰駝乳中表現(xiàn)為多態(tài)性，這與文獻(xiàn)報(bào)道的MUC1在山羊乳中表現(xiàn)出蛋白多態(tài)性的結(jié)果一致[22-24]。

研究報(bào)道，牛乳中CD36在MFGMP中占5%，分子質(zhì)量在75～88 kDa[21]。Zamora等[14]的研究表明，山羊乳MFGMP中CD36的分子質(zhì)量約為83 kDa。在本實(shí)驗(yàn)中雙峰駝乳和牛乳MFGMP中都存在88、75 kDa左右的蛋白條帶，推測(cè)這2個(gè)蛋白條帶可能為CD36，相對(duì)含量也為5%左右，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。PAS III是一種糖蛋白特征很弱的MUC15，它在SDS-PAGE凝膠上呈現(xiàn)出相對(duì)分子質(zhì)量為95～100 kDa的彌漫擴(kuò)散條帶，這種蛋白條帶的多分散特點(diǎn)可能是由于大量的可變數(shù)值的碳水化合物引起的。本實(shí)驗(yàn)的凝膠電泳圖譜分析結(jié)果顯示雙峰駝乳（100.22±0.45）和牛乳（102.51±1.47）MFGMP中均存在與PAS III相對(duì)分子質(zhì)量相應(yīng)的蛋白條帶，相對(duì)含量分別為（2.43±0.30）%、（2.51±0.28）%。Sun Ye等[13]發(fā)現(xiàn)在20～44 kDa范圍至少有10～12個(gè)條帶，17～18 kDa范圍內(nèi)有許多彌漫的蛋白條帶，其中有些蛋白條帶被鑒定為GTP-結(jié)合蛋白。雙峰駝乳MFGMP在20～44 kDa范圍內(nèi)存在一系列彌漫的蛋白條帶，可確認(rèn)為GTP-結(jié)合蛋白，但是牛乳MFGMP在這個(gè)分子質(zhì)量范圍內(nèi)蛋白組分缺失。FABP是一個(gè)分子質(zhì)量為14 kDa的多肽，在牛乳MFGMP中占2%～3%，在山羊乳中占總MFGMP的3.7%。本研究中雙峰駝乳、牛乳的MFGMP中分別存在13.96±0.02、13.65±0.42的蛋白條帶，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量推測(cè)該條帶FABP。

蘆晶等[25]使用過濾器輔助樣品前處理法測(cè)定在牛乳MFGMP檢測(cè)共出169種蛋白質(zhì)。楊梅等[12]將牛乳MFGMP酶解后，用電噴霧離子源質(zhì)譜最終鑒定出488種蛋白質(zhì)且大多數(shù)的蛋白為糖基化蛋白。景萌娜等[15]運(yùn)用納升高效液相色譜與靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜技術(shù)在牛乳的MFGMP鑒定出具有可靠定量信息的蛋白質(zhì)有593種。本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)譜成功鑒定出雙峰駝乳的MFGMP中有2 086個(gè)蛋白組分，雙峰駝乳中高豐度MFGMP組分依次為BTN、XO/XDH、乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）、脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP或PLIN2）等。與Sabha等[10]和Han Bin等[26]在單峰駝駝乳和雙峰駝乳中鑒定MFGM蛋白主要為脂肪酸合成酶、XO/XDH、BTN、乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）和脂肪分化相關(guān)蛋白（ADPH）結(jié)果一致。Li Weixuan等[17]和Cebo等[27]利用質(zhì)譜的方法鑒定出馬乳和驢乳中主要MFGMP為XO/XDH、BTN，乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）和脂肪分化相關(guān)蛋白（ADPH）。此外，利用David生物信息學(xué)資源將雙峰駝乳的MFGMP進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要是細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等組分，參與的生物途徑有翻譯和翻譯的起始、氧化還原過程、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)等，具有結(jié)合活性和分子催化等分子功能。

研究表明MFGMP與多發(fā)性硬化癥、自閉癥、冠心病等疾病之間具有相關(guān)性[28]。近幾年駝乳中蛋白以及MFGMP因其特殊的營養(yǎng)價(jià)值和功能特性越來越受到食品行業(yè)廣泛的關(guān)注[29-30]。MFGMP是由種類繁多的功能性蛋白質(zhì)所組成，很多蛋白質(zhì)能夠在極微量的條件下起到至關(guān)重要的生理作用[31]。MFGMP在組成及功能上的研究，能夠促進(jìn)深入地了解乳蛋白，并為以乳為原料的產(chǎn)品添加功能性蛋白提供參考。因此，對(duì)雙峰駝乳MFGMP在蛋白質(zhì)組成及功能上以及與牛乳MFGMP對(duì)比尋找差異蛋白進(jìn)行深入研究，不但能夠增加雙峰駝乳的利用率及利用價(jià)值，還能夠?yàn)橐噪p峰駝乳為原料的產(chǎn)品添加功能性蛋白提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)的樣本量小，尚需加大樣本量和樣品量，建立簡(jiǎn)單有效的區(qū)分雙峰駝乳與其他來源乳（牛乳等）中蛋白質(zhì)的方法，為乳制品的鑒別和質(zhì)量監(jiān)控提供理論依據(jù)。