羅 俊，王娜娜，莊意瓊，應(yīng)國(guó)紅，王曉煒

（深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東 深圳 518057）

洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性桿菌。作為條件致病菌，能引起多種醫(yī)院感染，包括敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、傷口感染和膿腫等，且該菌在患者和患者之間具有較強(qiáng)的傳播能力，由于其多重耐藥特性，治療相當(dāng)困難，一旦在醫(yī)院內(nèi)出現(xiàn)暴發(fā)流行很難控制[1-2]。目前該菌已經(jīng)被FDA明確為不可接受微生物（objectionable microorganism）[3]，根據(jù)FDA網(wǎng)站數(shù)據(jù)顯示，從2019年1月至2021年8月因微生物污染被召回的26批化妝品中，有8批被洋蔥伯克霍爾德菌污染，占比高達(dá)31%[4]。筆者將實(shí)驗(yàn)室近三年來(lái)微生物檢測(cè)不合格化妝品中污染菌分離鑒定后發(fā)現(xiàn)，洋蔥伯克霍爾德菌的檢出率遠(yuǎn)高于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[5]中要求的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，可見(jiàn)目前國(guó)內(nèi)化妝品被洋蔥伯克霍爾德菌污染的風(fēng)險(xiǎn)較高。

在各領(lǐng)域現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)體系中，洋蔥伯克霍爾德菌定性檢驗(yàn)方法有3種：SN/T 4684—2016《進(jìn)出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗(yàn)方法》[6]、SN/T 4485—2016《進(jìn)出口口腔清潔類(lèi)產(chǎn)品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗(yàn)方法》[7]及USP＜60＞Microbiological examination of nonsterile products-test for Burkholderia cepacia complex[8]。而筆者在化妝品中分離到的一株洋蔥伯克霍爾德菌，在上述3種檢驗(yàn)方法中的選擇性培養(yǎng)基中均無(wú)法生長(zhǎng)，如果污染了該分離菌的樣品采用這3種方法檢驗(yàn)，則無(wú)法檢出，因此提升化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗(yàn)方法的適用性很有必要。本文以該樣品分離菌及3株洋蔥伯克霍爾德菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為測(cè)試菌，選取3種標(biāo)準(zhǔn)中使用的液體培養(yǎng)基，開(kāi)展生長(zhǎng)特性研究；并通過(guò)測(cè)試慶大霉素對(duì)各試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度，非目標(biāo)菌抑制試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等，分析了該分離菌無(wú)法被檢出的主要原因，確定檢驗(yàn)方法中最優(yōu)的抗生素添加劑，并以此為依據(jù)對(duì)化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗(yàn)方法提幾點(diǎn)改進(jìn)建議。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MSC-Advantage A2型生物安全柜，BF400恒溫培養(yǎng)箱，GF54DA立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器。

1.2 菌株

洋蔥伯克霍爾德菌：1株為本實(shí)驗(yàn)室從樣品中分離獲得（編號(hào)A，同下文），另3株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別為ATCC 25416、ATCC BAA-245及ATCC BAA-247，來(lái)自美國(guó)典型菌種保藏中心。

非目標(biāo)菌：金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌CMCC（B）50094及銅綠假單胞菌CMCC（B）10104，均來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。

1.3 培養(yǎng)基及配套試劑

1.3.1 USP＜60＞培養(yǎng)基

pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH7.0），TSB以及洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂（BCSA++）均來(lái)自廣東環(huán)凱。

1.3.2 SN/T 4684—2016培養(yǎng)基

含慶大霉素的洋蔥伯克霍爾德菌增菌液（BCSB+），含多黏菌素B的SCDLP增菌液（SCDLP+），含多黏菌素B和慶大霉素的洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂（BCSA+）及含多黏菌素B和慶大霉素的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC+）來(lái)自青島海博。

1.3.3 SN/T 4485—2016培養(yǎng)基

SCDLP，改良letheen肉湯（MLET）來(lái)自廣東環(huán)凱，BCC培養(yǎng)基（BCA++）來(lái)自北京三藥。

1.3.4 配套試劑洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂（BCSA）配套試劑來(lái)自廣東環(huán)凱，BCC培養(yǎng)基配套試劑來(lái)自北京三藥。

1.3.5 其他培養(yǎng)基TSA、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）均來(lái)自廣東環(huán)凱；TSA對(duì)照培養(yǎng)基來(lái)自中檢院。

生態(tài)文明改革成果不僅讓城里人得惠得利，也延伸到鄉(xiāng)下，讓村里人可感可觸。污水處理設(shè)施投入使用以來(lái)，全村40多戶村民“污水四處流、坑塘水溝臭氣熏天”的環(huán)境問(wèn)題得到了解決，有效改善了生態(tài)環(huán)境，提升了群眾的生活質(zhì)量。

1.4 試劑

（1）生理鹽水：按GB 7918.1—1987依法配制。

（2）慶大霉素溶液（1 mg/mL）：購(gòu)自青島海博。

2 方法

2.1 不同濃度菌懸液的制備

取4株洋蔥伯克霍爾德菌劃線至TSA平板，置32.5℃培養(yǎng)24 h，配制成2.0左右麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳以?，備用；再用無(wú)菌生理鹽水稀釋至含量為每1 mL含101、102、103、104cfu的菌懸液，備用。

取5株非目標(biāo)菌劃線至TSA平板，置32.5℃培養(yǎng)24 h，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋至含量為每1 mL含104cfu的菌懸液，備用。

2.2 液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特性研究

取2.1項(xiàng)下4株洋蔥伯克霍爾德菌的101、102、103菌懸液1 mL接種至各液體培養(yǎng)基中，每種濃度每種培養(yǎng)基制備1管，置32.5℃培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果，必要時(shí)，劃線至TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)，以確認(rèn)是否有菌生長(zhǎng)。

2.3 慶大霉素對(duì)各試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度（MIC）[9]測(cè)定

取1.4（2）慶大霉素溶液1 mL，用無(wú)菌TSB作為稀釋液，稀釋50倍至20μg/mL，再按二倍稀釋法[10]，分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL，制成裝量為10 mL的培養(yǎng)管，每個(gè)質(zhì)量濃度各平行制備3管，每管接種2.1項(xiàng)下4株洋蔥伯克霍爾德菌的菌懸原液各100 μL，取無(wú)慶大霉素的TSB管接種相應(yīng)試驗(yàn)菌作為陽(yáng)性對(duì)照管，置32.5℃培養(yǎng)48～72 h，用肉眼觀察其渾濁度，并記錄渾濁管數(shù)。

2.4 非目標(biāo)菌抑制試驗(yàn)

按2.3項(xiàng)下制備的含0.625μg/mL慶大霉素的TSB管，分別接種2.1項(xiàng)下金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)氏菌及銅綠假單胞菌菌懸液各100 μL，取無(wú)慶大霉素的TSB管接種相應(yīng)試驗(yàn)菌做為陽(yáng)性對(duì)照管，置32.5℃培養(yǎng)48～72 h，用肉眼觀察其渾濁度，并記錄渾濁管數(shù)。

2.5 藥敏試驗(yàn)

用無(wú)菌棉簽將4株洋蔥伯克霍爾德菌的TSA培養(yǎng)物挑取至相應(yīng)的鑒定肉湯中，配制成0.5～0.6麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，每株試?yàn)菌各取1支藥敏肉湯，分別滴加1滴藥敏指示劑，再取已制備好的各試驗(yàn)菌菌懸液25 μL分別轉(zhuǎn)移至藥敏肉湯中，混勻，將鑒定肉湯和藥敏肉湯分別倒入鑒定/藥敏板中，依法上機(jī)測(cè)試。

3 結(jié)果與分析

對(duì)比3種標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)體系，詳見(jiàn)表1，3種標(biāo)準(zhǔn)均采用了傳統(tǒng)的增菌后劃線分離的方法，但使用的培養(yǎng)基各有不同。

表1 3種洋蔥伯克霍爾德菌檢驗(yàn)方法的培養(yǎng)基列表

3.1 液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性研究

為了考察菌株A在各標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)體系中的生長(zhǎng)情況，本研究選取了TSB、SCDLP+、BCSB+和MLET等4種液體培養(yǎng)基，以菌株A及3株洋蔥伯克霍爾德菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為試驗(yàn)菌，開(kāi)展生長(zhǎng)特性研究。液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性研究結(jié)果表明，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌株在各液體培養(yǎng)基中均生長(zhǎng)良好，并無(wú)顯著性差別，詳見(jiàn)表2；但各濃度的菌株A在BCSB+中均無(wú)法生長(zhǎng)，且在培養(yǎng)基SCDLP+、TSB和MLET中，也出現(xiàn)不同程度的生長(zhǎng)緩慢情況，為進(jìn)一步探究菌株A在BCSB+中不生長(zhǎng)的原因，對(duì)各培養(yǎng)基的成分表進(jìn)行分析，詳見(jiàn)表3。

表2 液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性研究結(jié)果

各濃度的菌株A在BCSB+均不能生長(zhǎng)，說(shuō)明該培養(yǎng)基缺少該菌株生長(zhǎng)必需的某種營(yíng)養(yǎng)成分，或該培養(yǎng)基中有抑制菌株A生長(zhǎng)的成分。葡萄糖、蔗糖、乳糖及牛肉膏等為培養(yǎng)物提供碳源，酪蛋白胰酶消化物、蛋白胨/大豆蛋白胨、大豆粉木瓜蛋白酶消化物和酵母提取物等為培養(yǎng)物提供氮源，氯化鈉維持滲透壓，酚紅為pH指示劑，結(jié)晶紫可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及部分真菌生長(zhǎng)，慶大霉素可抑制革蘭氏陰性菌及部分革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)[11]。仔細(xì)分析表3不難發(fā)現(xiàn)，各培養(yǎng)基中的碳源、氮源及滲透壓調(diào)節(jié)劑基本一致，pH并無(wú)顯著性差別，可見(jiàn)BCSB+中并不缺少該菌株生長(zhǎng)必需的某種營(yíng)養(yǎng)成分，且菌株A為革蘭氏陰性菌。由此推斷，慶大霉素可能抑制了該菌的生長(zhǎng)。

表3 3種檢驗(yàn)方法涉及的液體培養(yǎng)基配方

3.2 慶大霉素對(duì)各試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

由表4可知，3株標(biāo)準(zhǔn)菌株在含0.3125～20 μg/mL慶大霉素的TSB中均生長(zhǎng)良好，而菌株A在含1.25～20μg/mL慶大霉素的TSB中均無(wú)法生長(zhǎng)，僅在含0.312 5～0.625 μg/mL慶大霉素的TSB中可以生長(zhǎng)，可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)慶大霉素的耐受度較高，而菌株A對(duì)慶大霉素較敏感，所以慶大霉素對(duì)菌株A的MIC為0.625 μg/mL，慶大霉素對(duì)3株標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC均大于20 μg/mL。

表4 慶大霉素對(duì)各試驗(yàn)菌的MIC測(cè)定

3.3 非目標(biāo)菌抑制試驗(yàn)

慶大霉素作為抗生素添加劑添加至選擇性培養(yǎng)基中，是為了抑制非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)，從而提升目標(biāo)菌的檢出率[11]。而慶大霉素是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，主要用于治療細(xì)菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌引起的感染，革蘭陽(yáng)性菌中，金黃色葡萄球菌對(duì)本品敏感[12]。故本次試驗(yàn)選取了對(duì)慶大霉素相對(duì)敏感的4株非目標(biāo)菌，分別為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)氏菌及銅綠假單胞菌等作為試驗(yàn)菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表5）：該質(zhì)量濃度的慶大霉素能抑制一定程度的金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌，但無(wú)法抑制大腸埃希菌和沙門(mén)氏菌。如果將培養(yǎng)基配方中慶大霉素的含量降低至0.625μg/mL時(shí)，則不能達(dá)到抑制非目標(biāo)菌的效果。

表5 非目標(biāo)菌抑制試驗(yàn)

3.4 藥敏試驗(yàn)

由上文可知，洋蔥伯克霍爾德菌選擇性培養(yǎng)基中添加慶大霉素，會(huì)導(dǎo)致菌株A無(wú)法檢出，為了篩選出更多可以替代慶大霉素的抗生素添加劑，采用全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)，取4株洋蔥伯克霍爾德菌TSA純培養(yǎng)物上機(jī)測(cè)試。該設(shè)備可完成試驗(yàn)菌的鑒定以及各抗生素最低抑菌濃度的定量藥物敏感性測(cè)試，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，慶大霉素對(duì)4株洋蔥伯克霍爾菌的測(cè)試值與上文中MIC測(cè)試結(jié)果基本一致，3株標(biāo)準(zhǔn)菌株大于藥敏板上限值（8μg/mL），菌株A低于藥敏板下限值（2μg/mL）。另外，當(dāng)4株菌的某種抗生素測(cè)試值均大于其上限值時(shí)，說(shuō)明目標(biāo)菌對(duì)這種抗生素的耐受度較高，有應(yīng)用于化妝品中洋蔥伯克霍爾菌的檢測(cè)方法的可能性，符合條件的抗生素分別為頭孢唑林、氨芐青霉素及四環(huán)素等。

表6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 μg·mL-1

4 結(jié)束語(yǔ)

洋蔥伯克霍爾德菌是洋蔥伯克霍爾德菌菌群中最常見(jiàn)的菌株之一，該菌群有20余種[13]，菌株A對(duì)慶大霉素非常敏感，但3株標(biāo)準(zhǔn)菌株耐受度較高，可見(jiàn)該菌群內(nèi)各菌株生長(zhǎng)特性各異?；诖?，本研究對(duì)化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗(yàn)方法提出幾點(diǎn)改進(jìn)建議。

首先應(yīng)優(yōu)化添加抗生素的種類(lèi)及質(zhì)量濃度，頭孢唑林、氨芐青霉素及四環(huán)素等均可作為慶大霉素抗生素的替代品，但具體添加質(zhì)量濃度還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)研究；另外李詩(shī)瑤等[14]在沙門(mén)氏菌的定性檢驗(yàn)時(shí)，采用了多種選擇性平板進(jìn)行劃線分離，顯著提高檢出率。王似錦等[15]在對(duì)凝膠劑中1株洋蔥伯克霍爾德菌的生長(zhǎng)特性研究結(jié)果表明，該菌在選擇性培養(yǎng)基麥康凱瓊脂和紫紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基中也生長(zhǎng)良好?？梢?jiàn)在化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗(yàn)方法中，也可聯(lián)用多種選擇性平板作為劃線分離平板，在兼顧選擇性及目標(biāo)菌生長(zhǎng)特性的同時(shí)，提升檢出率。