廖曉意， 陳昫， 唐舒婷， 樊冬梅， 蘭紹陽(yáng)， 胡玲

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科創(chuàng)中心，廣東廣州 510405）

眾所周知，胃癌（gastric cancer，GC）是一種發(fā)病率高、預(yù)后較差的惡性腫瘤。胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前普遍認(rèn)為，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是最重要的危險(xiǎn)因素。Hp感染導(dǎo)致胃黏膜慢性持續(xù)性炎癥，引發(fā)胃黏膜從良性到惡性的慢性淺表性胃炎（chronic superficial gastritis，CSG）→慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）→腸上皮化生（intestinal metaplasia，IM）→異型增生（dysplasia，Dys）→胃癌病變。Hp相關(guān)胃?。℉elicobacter pylori-related gastric diseases，HPGD）是對(duì)上述因Hp感染所引起的胃黏膜病變的簡(jiǎn)稱。

本課題前期從“邪正交爭(zhēng)”角度對(duì)HPGD脾氣虛證和脾胃濕熱證的胃黏膜保護(hù)因子[熱休克蛋白70（HSP70）、黏蛋白1（MUC1）等]和攻擊因子[白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素8（IL-8）等]進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在不同證型中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢(shì)[1]。其中，脾胃濕熱證的Hp感染程度和感染率明顯高于其他證型，同時(shí)伴隨胃黏膜炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-8等mRNA和蛋白水平的高表達(dá)[2]。采用高通量二代測(cè)序法對(duì)HPGD患者進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)與慢性胃炎組相比，胃癌患者的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain-related protein 3，NLRP3）和IL-1β表達(dá)均顯著上調(diào)，提示NLRP3/IL-1β可能是HPGD胃黏膜病變過(guò)程中的關(guān)鍵炎癥因子[3]。因此，本研究擬通過(guò)觀察HPGD中脾胃濕熱證及脾氣虛證胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步明確HPGD不同證型中炎癥因子的差異性表達(dá)，證實(shí)不同證候是HPGD的內(nèi)在病理因素。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集2019年11月至2020年11月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科內(nèi)窺鏡室及胃腸外科就診的95例HPGD患者為病例組，包括慢性淺表性胃炎43例，慢性萎縮性胃炎40例，胃癌12例；其中男53例，女42例。以上患者根據(jù)臨床表現(xiàn)分為脾胃濕熱證62例，年齡（53.79±12.84）歲；脾虛證33例，年齡（51.88±13.36）歲。同期于該院體檢中心隨機(jī)招募10例健康體檢者為正常對(duì)照組，其中1例因樣本質(zhì)量不達(dá)標(biāo)予以剔除，最終納入研究9例，包括男4例，女5例；年齡（51.00±11.25）歲。各組患者的一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：NO.K【2020】128），胃黏膜標(biāo)本及臨床信息的采集均獲得患者的知情同意。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)慢性淺表性胃炎和慢性萎縮性胃炎的診斷以《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見（2017年，上海）》[4]作為標(biāo)準(zhǔn)，胃癌的診斷以2013年中華人民共和國(guó)衛(wèi)計(jì)委頒布的《胃癌規(guī)范化診療指南（試行）》[5]作為標(biāo)準(zhǔn)；脾胃濕熱證和脾氣虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)以2002年《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[6]作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 病例組納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎或胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合上述脾胃濕熱證或脾氣虛證的辨證標(biāo)準(zhǔn)；③自愿參加本研究，能配合胃黏膜標(biāo)本及臨床信息采集的患者。

1.3.2 正常對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn) ①內(nèi)鏡下提示慢性淺表性胃炎，無(wú)活動(dòng)性炎癥，Hp檢測(cè)陰性；②無(wú)呼吸、循環(huán)、泌尿、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其他消化系統(tǒng)疾病；③無(wú)胃病的相關(guān)臨床癥狀，舌淡紅，苔薄白，脈象平和；④自愿參加本研究，能配合胃黏膜標(biāo)本及臨床信息采集的受試者。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn)①合并有嚴(yán)重的心、腦、肺、肝、神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者；②近1個(gè)月使用過(guò)質(zhì)子泵抑制劑或行Hp根除療法的患者；③近期有消化道出血病史的患者；④孕婦、哺乳期的婦女。

1.5胃黏膜標(biāo)本的采集研究對(duì)象均行電子胃鏡檢查，于胃竇距幽門口2～3 cm處的大、小彎或前、后壁鉗取4塊大小約0.2～0.3 cm的胃黏膜組織，其中1塊行病理組織學(xué)檢測(cè)，1塊行快速尿素酶試驗(yàn)；2塊放入裝有RNA保存液的凍存管中后，立即投入液氮瓶并送至-80℃低溫冰箱中保存，以備采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。胃癌標(biāo)本則剪取手術(shù)切除的癌組織、距離腫物3 cm以上的遠(yuǎn)癌組織各4塊，處理同前。

1.6Hp感染情況的檢測(cè)采用快速尿素酶試驗(yàn)及胃黏膜病理切片美藍(lán)染色法檢測(cè)患者的Hp感染情況。兩者均為陽(yáng)性，其標(biāo)本可診斷為Hp感染者；兩者均為陰性，其標(biāo)本則診斷為非Hp感染者；一陰一陽(yáng)者不納入本研究。

1.6.1 快速尿素酶試驗(yàn) 內(nèi)鏡下鉗取胃黏膜組織，立即置于幽門螺桿菌試紙上，等待3 min，觀察試紙顏色變化，不變色者為Hp陰性，變紅者為Hp陽(yáng)性。

1.6.2 胃黏膜病理切片美藍(lán)染色法檢測(cè) 美藍(lán)染色采用按照硼酸0.5 g+亞甲藍(lán)0.5 g+蒸餾水100 mL的比例配成的硼酸亞甲藍(lán)液。將胃黏膜組織塊固定于體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛內(nèi)，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，切片。切片脫蠟、脫水后，滴加硼酸亞甲藍(lán)液5～10 min，水洗，封片，電子顯微鏡下觀察、拍照。對(duì)醫(yī)師采用盲法，并設(shè)定同一條件，由兩名資深病理科醫(yī)師分別完成所有胃黏膜標(biāo)本Hp感染程度的評(píng)估。詳見圖1。

圖1 不同幽門螺桿菌（Hp）感染程度的胃黏膜表現(xiàn)（美藍(lán)染色，×400）Figure 1 Gastric mucosal manifestations of the studying subjects with different degrees of Hp infection（methylene blue stain，×400）

1.7胃黏膜中NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)標(biāo)本外送廣州華銀健康科技有限公司行qRT-PCR法檢測(cè)。按TRIzol試劑操作說(shuō)明書提取細(xì)胞RNA。使用反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在PCR儀中將RT反應(yīng)程序設(shè)為：25℃5 min，55℃60 min，70℃15 min，12℃結(jié)束，再使用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）做熒光PCR。以hGAPDH作為內(nèi)參基因，NLRP3、IL-1β轉(zhuǎn)錄水平以2-ΔΔCt表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。引物序列見表1，引物擴(kuò)增圖見圖2。

圖2 NLRP3（A）、IL-1β（B）反轉(zhuǎn)錄引物擴(kuò)增曲線圖Figure 2 The amplification curve of reverse-transcription primers of NLRP3（A）and IL-1β（B）

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，滿足正態(tài)性且方差齊者，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析；不滿足正態(tài)性或方差齊性者，組間比較選用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；變量間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HPGD不同證型患者的Hp感染率比較表2結(jié)果顯示：HPGD脾胃濕熱證和脾氣虛證患者的Hp感染率分別為82.26%（51/62）、75.76%（25/33），脾胃濕熱證患者的Hp感染率有高于脾氣虛證患者的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 幽門螺桿菌（Hp）相關(guān)胃?。℉PGD）不同證型患者Hp感染率比較Table 2 Comparison of Hp infection rate in patients with Hp-related gastric disease（HPGD）of different syndrome types [例（%）]

2.2HPGD不同證型患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平比較表3結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，HPGD脾胃濕熱證和脾氣虛證患者胃黏膜的NLRP3、IL-1βmRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。脾胃濕熱證患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平均有高于脾氣虛證患者的趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 幽門螺桿菌相關(guān)胃?。℉PGD）不同證型患者NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with Hp-related gastric disease（HPGD）of different syndrome types and in normal control group（±s，2-ΔΔCt）

表3 幽門螺桿菌相關(guān)胃?。℉PGD）不同證型患者NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with Hp-related gastric disease（HPGD）of different syndrome types and in normal control group（±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，與正常對(duì)照組比較

?

2.3HPGD不同病種患者胃黏膜的NLRP3、IL-1βmRNA表達(dá)水平比較表4結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，HPGD各病例組患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。胃癌患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平有高于慢性萎縮性胃炎、慢性淺表性胃炎的趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 幽門螺桿菌相關(guān)胃?。℉PGD）不同病種患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with different types of HPGD （±s，2-ΔΔCt）

表4 幽門螺桿菌相關(guān)胃?。℉PGD）不同病種患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with different types of HPGD （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，與正常對(duì)照組比較

?

2.4胃癌患者胃黏膜不同部位的NLRP3和IL-1βmRNA表達(dá)水平比較表5結(jié)果顯示：對(duì)胃癌患者的癌組織和距離腫物3 cm以上的遠(yuǎn)癌組織胃黏膜標(biāo)本的NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)（因其中2例遠(yuǎn)癌組織樣本因采集檢測(cè)不達(dá)標(biāo)予以剔除，納入剩余10例行配對(duì)檢驗(yàn)），與遠(yuǎn)癌組織相比，癌組織胃黏膜標(biāo)本的NLRP3 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），IL-1β mRNA表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 胃癌患者不同部位組織NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in tissues from different sites of gastric cancer patients （±s，2-ΔΔCt）

表5 胃癌患者不同部位組織NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in tissues from different sites of gastric cancer patients （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，與遠(yuǎn)癌組織組比較

?

2.5HPGD不同Hp感染情況患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平比較表6結(jié)果顯示：與Hp陰性患者相比，Hp陽(yáng)性患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明Hp感染可導(dǎo)致NLRP3、IL-1β表達(dá)水平升高。

表6 幽門螺桿菌相關(guān)胃?。℉PGD）不同Hp感染情況患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in HPGD patients with different Hp infection profiles （±s，2-ΔΔCt）

表6 幽門螺桿菌相關(guān)胃?。℉PGD）不同Hp感染情況患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in HPGD patients with different Hp infection profiles （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，與Hp陰性組比較

?

3 討論

幽門螺桿菌（Hp）是一種革蘭氏陰性菌，作為常見的致病菌，全球約有50%的人受到感染[7]。1994年，Hp被國(guó)際胃癌研究機(jī)構(gòu)列為人類Ⅰ級(jí)致癌物。目前廣泛認(rèn)為根除Hp可有效預(yù)防胃癌的發(fā)生，延緩慢性淺表性胃炎（CSG）→慢性萎縮性胃炎（CAG）→腸上皮化生（IM）→異型增生（Dys）→胃癌（GC）的演變過(guò)程。在中醫(yī)學(xué)中，CSG、CAG、GC等胃病多根據(jù)其癥狀表現(xiàn)可歸屬于“胃痛”“胃痞”“嘔吐”“呃逆”“噎膈”等范疇，其病變部位在胃，與脾、肝關(guān)系密切。其中脾與胃同屬中焦，互為表里，兩者緊密相連，因此胃病也多可牽連于脾。對(duì)不同證型的胃黏膜病理觀察結(jié)果顯示，脾胃濕熱證患者的胃黏膜病理多表現(xiàn)為隆起糜爛[8]，脾氣虛證患者多表現(xiàn)為黏膜白相增多[9]，且前者炎癥程度高于后者。說(shuō)明不同證型可能是導(dǎo)致胃黏膜病理變化的內(nèi)在因素，且與炎癥因子的異常高表達(dá)密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：脾胃濕熱證HPGD患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，且與脾氣虛證患者比有偏高的表達(dá)趨勢(shì)，證實(shí)了脾胃濕熱證與NLRP3、IL-1β的內(nèi)在聯(lián)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證Hp感染率有高于脾氣虛證的趨勢(shì)，這與本課題組前期的研究結(jié)果及國(guó)內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[9-10]。中醫(yī)對(duì)脾胃濕熱的描述最早可見于《素問(wèn)·至真要大論》，提出：“諸濕腫滿，皆屬于脾?！敝嗅t(yī)認(rèn)為，濕熱證具有病性黏滯、纏綿難愈的特點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為，Hp在病因上可歸于中醫(yī)外感邪氣范疇，與濕熱邪氣致病的機(jī)制類同，且其難以根治、易反復(fù)感染的致病特征與濕熱黏滯的發(fā)病特點(diǎn)極為相似。同時(shí)，“濕熱”也是Hp生長(zhǎng)、繁殖的內(nèi)在環(huán)境?！皾駸帷钡闹行牟∥辉谄⑽?，脾為濕臟、胃為燥臟，脾胃同居中焦，主運(yùn)化水液，故“濕熱”易在脾胃滋生盤踞。由此可見，脾胃濕熱證與Hp感染互相影響，互為因果。

薛雪的《濕熱病篇》將濕熱的發(fā)病機(jī)理概括為“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，外內(nèi)相引，故病濕熱”，即內(nèi)傷為本，外邪是因，這與Hp感染和脾胃濕熱證的致病過(guò)程不謀而合。Hp感染是HPGD脾胃濕熱證發(fā)病的外因，而NLRP3、IL-1β等炎癥因子在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度表達(dá)則是從內(nèi)部協(xié)同Hp致病，導(dǎo)致胃黏膜持續(xù)的炎癥狀態(tài)，從而引起病理結(jié)構(gòu)改變。NLRP3炎癥體的激活可能是脾胃濕熱證的生物學(xué)實(shí)質(zhì)之一，是參與脾胃濕熱證HPGD發(fā)病的重要因素。

NLRP3炎癥體是一種包括NLRP3蛋白和適配器ASC的半胱氨酸天冬氨酸酶1（caspase-1）激活分子平臺(tái)，其中NLRP3蛋白作為一種模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptors，PRRs），可定向識(shí)別宿主細(xì)胞質(zhì)中的微生物分子[11]。Hp通過(guò)其主要毒力因子細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（cytotoxin-associated gene A，Cag A）蛋白刺激NLRP3蛋白，激活NLRP3炎癥體，從而活化caspase-1?；钚詂aspase-1可促進(jìn)IL-1β的成熟、釋放，成熟的IL-1β參與多種免疫反應(yīng)，其接收內(nèi)皮細(xì)胞的傳導(dǎo)信號(hào)，將免疫細(xì)胞募集到感染或受損部位[12]。IL-1β炎癥反應(yīng)可以抑制胃酸分泌并引起胃腺體萎縮，從而促進(jìn)定植菌的近端遷移，引起胃內(nèi)微環(huán)境改變，造成體部或多灶性胃炎，后者往往會(huì)向腸上皮化生發(fā)展，最終演變?yōu)槟c型胃癌。此外，它還可以直接誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖[13-15]。

本研究對(duì)HPGD不同病種的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：病例組較正常對(duì)照組顯著升高，其中GC較CSG、CAG有更高的表達(dá)趨勢(shì)。同時(shí)，對(duì)GC患者胃黏膜癌組織和遠(yuǎn)癌組織的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)癌組織炎癥因子表達(dá)水平顯著高于遠(yuǎn)癌組織。以上結(jié)果均說(shuō)明NLRP3、IL-1β與GC的發(fā)生密切相關(guān)，NLRP3、IL-1β或許可作為GC早期篩查和治療的靶點(diǎn)。結(jié)合課題組前期對(duì)GC和正常受試者胃黏膜的高通量二代基因測(cè)序，結(jié)果顯示IL-1β的表達(dá)在GC中顯著上調(diào)，且差異基因通過(guò)NOD樣受體信號(hào)通路進(jìn)行富集[3]，故認(rèn)為Hp可激活NLRP3炎癥體，從而提高IL-1β在HPGD患者胃黏膜中的表達(dá)，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與CSG→CAG→IM→Dys→GC的病理過(guò)程。

綜上所述，Hp感染后胃黏膜的IL-1β、NLRP3的高表達(dá)，導(dǎo)致胃黏膜的慢性持續(xù)性炎癥，可能是引起胃黏膜惡性轉(zhuǎn)變的重要因素之一。而脾胃濕熱證可能是Hp感染后的內(nèi)在病理因素之一，其與外邪Hp感染協(xié)同，共同參與Hp相關(guān)胃病由良性至惡性發(fā)展的過(guò)程。由于本研究納入樣本量仍較少，脾胃濕熱證和脾氣虛證的NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)均高于正常受試者，但兩組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后續(xù)將繼續(xù)擴(kuò)大樣本，并擴(kuò)展更多中醫(yī)不同證候，以進(jìn)一步證實(shí)中醫(yī)證候參與Hp感染后的胃黏膜不同結(jié)局的過(guò)程，為中醫(yī)藥根除Hp防治胃癌提供更多基礎(chǔ)理論依據(jù)。