陳 靜 ，黃德練，王雪輝，徐 磊，張 健，李亞芳，寧加佳，王亮根，劉雙雙，林昭進(jìn)，杜飛雁

1. 上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

魚(yú)卵是魚(yú)類的早期發(fā)育階段，掌握其豐度和分布對(duì)了解魚(yú)類早期資源變動(dòng)具有重要意義[1]。魚(yú)卵的形態(tài)分類和鑒定是早期漁業(yè)資源種類調(diào)查和評(píng)估的重要依據(jù)[2-4]。南海作為我國(guó)三大陸緣海之一，具有獨(dú)特的半封閉海域條件，是世界上海洋生物種質(zhì)資源最豐富的區(qū)域之一，已記錄魚(yú)類3 400多種，然而有形態(tài)信息和分類研究的魚(yú)卵種類卻極其缺乏[5-6]。魚(yú)卵的發(fā)育時(shí)間短、形態(tài)變化大、相近種類特征相似，在魚(yú)類的產(chǎn)卵期與產(chǎn)卵場(chǎng)相互交疊的情況下難以準(zhǔn)確對(duì)其進(jìn)行分類研究[5]，限制了對(duì)近海魚(yú)類早期資源的準(zhǔn)確評(píng)估和深入研究。隨著GenBank (www.ncbi.nlm.gov) 和BOLD systems(v4.boldsystems.org) 等數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，DNA條形碼技術(shù)在魚(yú)卵的分類鑒定中應(yīng)用廣泛，為解決魚(yú)卵形態(tài)學(xué)鑒定的研究瓶頸提供了新思路和手段。DNA條形碼技術(shù)在進(jìn)行魚(yú)卵仔魚(yú)鑒定時(shí)，不受限于種類形態(tài)、狀態(tài)及發(fā)育時(shí)期，僅依靠少量的組織就能獲取該種類的基因序列，經(jīng)擴(kuò)增、測(cè)序及序列比對(duì)即可獲得較為準(zhǔn)確的種類鑒定結(jié)果，使魚(yú)卵形態(tài)特征和分類研究更加準(zhǔn)確、快捷[2,7-8]。

珠江口地處亞熱帶咸淡水交匯海域，常年受珠江沖淡水、沿岸流及上升流的綜合影響，是我國(guó)最富生產(chǎn)力的河口之一[9-11]，孕育了豐富的漁業(yè)資源，也是近海魚(yú)類重要的產(chǎn)卵場(chǎng)[10,12]。江門位于珠江口的西南部，是南海海域的典型河口區(qū)域之一，其沿岸的黃茅海河口、廣海灣及其鄰近海域 (中華白海豚保護(hù)區(qū))，受珠江口和南海海域的綜合作用，孕育了豐富的漁業(yè)資源[13-14]，成為鲾科、科、舌鰨科和鯡科等多種小型魚(yú)類的產(chǎn)卵場(chǎng)和育幼場(chǎng)。本文以珠江口江門海域現(xiàn)場(chǎng)采獲的魚(yú)卵種類為樣本，在DNA條形碼準(zhǔn)確鑒定種類的基礎(chǔ)上，描述魚(yú)卵的主要形態(tài)特征并探討其形態(tài)分類，以期為今后珠江口漁業(yè)資源的保護(hù)和管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

魚(yú)卵樣品于2021年4月在廣東珠江口江門海域的7個(gè)采樣點(diǎn)采集獲得。每個(gè)站位以大型浮游生物網(wǎng) (網(wǎng)口內(nèi)徑0.8 m、網(wǎng)長(zhǎng)2.8 m，網(wǎng)口面積0.5 m2)在水體表層進(jìn)行水平拖網(wǎng)采樣，每個(gè)站位拖網(wǎng)1次，每次10 min，采樣完成后收集網(wǎng)底管內(nèi)樣品充氧保存以保持活體狀態(tài)。所有站位樣品在采集后充分混合，取1/7作為抽樣樣本。體視顯微鏡(Nikon SMZ800N) 下隨機(jī)挑出3 245 顆魚(yú)卵，參考魚(yú)卵形態(tài)分類指南[1]，進(jìn)行初步的形態(tài)分類。按比例共計(jì)選取了136 顆魚(yú)卵[15]，體視顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行拍照和形態(tài)記錄。魚(yú)卵樣品記錄形態(tài)后逐一放入1.5 mL無(wú)菌離心管中，以體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇固定，?20 ℃保存以進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

魚(yú)卵樣品DNA提取使用海洋動(dòng)物組織基因組提取試劑盒 (天根)。使用引物FishBCL (5'-TCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3') 和FishBCH(5′-ACTTCYGGGTGRCCRAARAATCA-3')[16]對(duì)線粒體細(xì)胞色素C第I亞基 (COI) 目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。30 μL PCR反應(yīng)體系組成為TaqDNA聚合酶(TaKaRa) 0.3 μL，dNTP 3 μL，10× Taqbuffer 3 μL，正反向引物各0.9 μL，DNA模板3 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技公司進(jìn)行純化和序列雙向測(cè)定。

1.3 序列分析和種類確認(rèn)

利用DNAstar 7.1軟件包 (DNASTAR, Inc.) 對(duì)測(cè)序獲得的原始序列進(jìn)行檢查、拼接及校對(duì)，確定序列準(zhǔn)確性，并將獲得的序列與GenBank及BOLD systems數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比。依據(jù)遺傳相似度>99%認(rèn)定為種水平、92%～99%為屬水平，以此為基準(zhǔn)對(duì)魚(yú)卵進(jìn)行種類判定[17]。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載與樣品序列同源性達(dá)到種水平的COI基因序列。使用MEGA 7.1軟件對(duì)所有的COI基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，以斑節(jié)對(duì)蝦 (Penaeus monodon)作為外系群。采用基于K2P (Kimura two parameter model) 遺傳距離的鄰接法 (Neighbor-Joining, NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[18]以最終確認(rèn)魚(yú)卵所屬的種類或類群，Bootstrap置信值設(shè)置為重復(fù)抽樣1 000次。校驗(yàn)后的序列上傳至GenBank。

2 結(jié)果

2.1 種類組成

本研究共獲得86個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果，序列長(zhǎng)度為628～684 bp。通過(guò)與基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其COI序列與兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中參考序列比對(duì)均能達(dá)到99%～100%的種水平，且在種鑒定水平范圍內(nèi)出現(xiàn)相同的1～3個(gè)種類。初步判定13個(gè)魚(yú)卵種類分屬于3目10科10屬；其中4種魚(yú)卵能鑒定至種，分別為緣邊銀鱸 (Gerres limbatus)、多鱗(Sillago sihama)、眶棘雙邊魚(yú) (Ambassis gymnocephalus) 及斑頭舌鰨 (Cynoglossus puncticepsc)；8種鑒定至屬，分別為沙丁魚(yú)屬、小公魚(yú)屬、棘鯛屬、副葉鲹屬、叫姑魚(yú)屬、屬、舌鰨屬-1和舌鰨屬-2；1種鑒定至科，為鲾科 (表1)。構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，所有物種均能成功進(jìn)行種屬的聚類 (圖1)。

表1 研究海域魚(yú)卵DNA序列對(duì)比及物種鑒定結(jié)果Table 1 Results of DNA sequence comparison and species identification of fish eggs in survey area

分子鑒定的種類組成結(jié)果中，以鱸形目最多，其次為鰈形目，鯡形目再次之。個(gè)體數(shù)量以小公魚(yú)屬最多，占總個(gè)體數(shù)的38.4%；鲾科次之 (15.1%)；眶棘雙邊魚(yú)再次之 (8.1%)。結(jié)合圖像信息，發(fā)現(xiàn)相同種類魚(yú)卵所處的發(fā)育階段一致。其中沙丁魚(yú)屬魚(yú)卵處于剛完成受精不久的受精卵時(shí)期，胚體尚未形成；舌鰨屬和叫姑魚(yú)屬魚(yú)卵處于卵裂期和囊胚期；其余魚(yú)卵種類均處于胚體和器官形成時(shí)期。

2.2 形態(tài)特征

沙丁魚(yú)屬卵為圓球狀 (圖2-a)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于1.563～1.615 mm，均值為 (1.588±0.024) mm；卵周隙介于0.337～0.458 mm，均值為(0.385±0.051) mm，約為卵徑的47%～53%。卵黃近圓形，直徑介于0.836～0.870 mm，均值為(0.850±0.012) mm，分兩層，外層半透明，顏色較淺，內(nèi)層呈乳白色兼有不規(guī)則的龜裂。單油球，呈淺黃色，位于卵黃囊中央，直徑介于0.131～0.141 mm，均值為 (0.135±0.004)mm；油球表面光滑，未見(jiàn)明顯色素胞分布。

小公魚(yú)屬卵為橢圓狀 (圖2-b)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造，具有彈性；卵周隙較小；卵黃囊也呈橢圓形，有不規(guī)則龜裂；長(zhǎng)徑介于1.177～1.189 mm，均值為 (1.182±0.005) mm，短徑介于0.684～0.692 mm，均值為 (0.689±0.003) mm；此時(shí)胚體形成，孵化出膜圍繞卵黃囊3/5，胚體后端1/3形成尾部，已孵化出膜；橙色油球一個(gè)，靠近胚體尾部1/3處，直徑介于0.095～0.101 mm，均值為 (0.098±0.002) mm，油球表面光滑，未見(jiàn)明顯色素胞分布。

棘鯛屬卵為圓球狀 (圖2-c)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于0.772～0.780 mm，均值為 (0.776±0.003) mm，動(dòng)、植物極卵周隙變寬；此時(shí)胚體形成，孵化出膜圍繞卵黃囊3/5，視囊內(nèi)晶體形成，聽(tīng)囊出現(xiàn)；胚體自頭到尾沿身體兩側(cè)布滿褐色色素胞，胚體末端形成尾芽，緊附卵黃囊，向內(nèi)彎曲伸長(zhǎng)；單油球，靠近胚體尾部1/3處，直徑介于0.158～0.168 mm，均值為 (0.163±0.004) mm，油球表面零星出現(xiàn)點(diǎn)狀黑色素胞。

圖2 珠江口江門海域 13種魚(yú)卵不同發(fā)育階段的圖像注：a. 小沙丁魚(yú)屬；b. 小公魚(yú)屬；c. 棘鯛屬；d. 副葉鲹屬；e. 眶棘雙邊魚(yú)；f. 緣邊銀鱸；g. 叫姑魚(yú)屬；h. 鲾科；i. 屬； j. 多鱗；k. 舌鰨屬-1；l. 斑頭舌鰨；m. 舌鰨屬-2；比例尺均為 0.1 mm。Fig. 2 Photographs of different embryonic development stages of fish eggs of 13 species from Jiangmen coastal area of Pearl River EstuaryNote: a. Sardinella sp.; b. Stolephorus sp.; c. Acanthopagru sp.; d. Alepes sp.; e. A. gymnocephalus; f. G. limbatus; g. Johnius sp.; h. Leiognathidae;i. Sillago sp.; j. S. sihama; k. Cynoglossus sp.-1; l. C. puncticeps; m. Cynoglossus sp.-2. Scale bar is 0.1 mm.

副葉鲹屬卵為圓球狀 (圖2-d)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑為0.644～0.659 mm，均值為 (0.650±0.005) mm；未見(jiàn)明顯卵周隙；此時(shí)觀察到胚體已具雛形，一端逐漸膨大拱起，形成胚體前端，另一端沿著卵膜延伸逐漸形成胚體尾端，胚體兩端靠近卵膜一側(cè)零星分布有黑色素胞；單油球，直徑介于0.136～0.148 mm，均值為 (0.142±0.004) mm，油球表面零星分布有黑色素胞。

眶棘雙邊魚(yú)卵為圓球狀 (圖2-e)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于0.716～0.724 mm，均值為 (0.720±0.003) mm；未見(jiàn)明顯的卵周隙；卵黃顆粒細(xì)且均勻，略顯現(xiàn)乳白色；此時(shí)胚體出現(xiàn)雛形緊密圍繞著油球，胚體外側(cè)規(guī)則排列有2～3列點(diǎn)狀黑色素胞，胚體一端正在形成頭部，視囊隱約可見(jiàn)；單油球，直徑介于0.157～0.169 mm，均值為 (0.161±0.005) mm，油球表面可觀察到5～6個(gè)點(diǎn)狀黑色素。

緣邊銀鱸是短棘銀鱸(G. lucidus)的同物異名(圖2-f)。卵為圓球狀，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于0.716～0.732 mm，均值為 (0.725±0.006) mm；此時(shí)胚體已形成，環(huán)繞卵黃囊2/3，魚(yú)卵原口已關(guān)閉；胚體前端形成頭部，頭部膨大形成具有分化的腦部；腦部視囊形成；未見(jiàn)明顯晶體形成；視囊后方出現(xiàn)聽(tīng)囊；耳石未形成；胚體尾部尾芽雛形初現(xiàn)；胚體頭部、軀干部及尾部均零星分布褐色色素胞，在胚體背部分布較密集且呈線形規(guī)則分布；單油球，直徑介于0.155～0.164 mm，均值為 (0.160±0.003) mm，表面零星分布有色素胞。

叫姑魚(yú)屬卵為圓球狀 (圖2-g)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于0.755～0.770 mm，均值為 (0.761±0.007) mm；卵周隙較窄；此時(shí)為剛受精不久的魚(yú)卵，原生質(zhì)向動(dòng)物極集中，形成狹窄的卵周隙，形成白色帽狀胚盤；單油球，呈乳白色；位于卵黃囊中央，直徑為0.189～0.198 mm，均值為 (0.192±0.003) mm，油球表面光滑，未見(jiàn)明顯色素胞分布。

鲾科卵為圓球狀 (圖2-h)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于0.650～0.673 mm，均值為 (0.663±0.010) mm；卵周隙較窄；卵黃囊透明，表面無(wú)明顯龜裂；胚胎環(huán)繞卵黃囊3/5時(shí)期，視囊內(nèi)晶體形成，聽(tīng)囊出現(xiàn)；胚體出現(xiàn)星狀黃色素胞沿中央兩側(cè)成行列式規(guī)則分布至尾端；胚體末端形成尾芽，已離開(kāi)卵黃并向內(nèi)彎曲伸長(zhǎng)；單油球，靠近胚體尾部1/3處，直徑介于0.156～0.160 mm，均值為 (0.155±0.002) mm，表面分布星狀黃色色素胞且?jiàn)A雜有黑色點(diǎn)狀色素胞。

舌鰨屬-1為受精不久的魚(yú)卵 (圖2-k)。卵為圓球狀，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于0.843～0.865 mm，均值為 (0.849±0.010) mm；未見(jiàn)明顯的卵周隙；油球10個(gè)左右，大小各異，直徑介于0.042～0.096 mm，聚集緊密，油球表面光滑，未見(jiàn)明顯色素胞分布；與油球相對(duì)的動(dòng)物極出現(xiàn)多層分裂球疊加排列形成細(xì)胞團(tuán)，兩側(cè)微隆起呈小丘狀，整個(gè)細(xì)胞團(tuán)界限模糊。

斑頭舌鰨為受精不久的魚(yú)卵 (圖2-l)，受精孔清晰可見(jiàn)。卵為圓球狀，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于0.784～0.806 mm，均值為 (0.793±0.008) mm；未見(jiàn)明顯的卵周隙；卵黃顆粒細(xì)勻；團(tuán)狀原生質(zhì)集中于油球相對(duì)側(cè)動(dòng)物極，形成帽狀胚，胚盤處的分裂球持續(xù)分裂聚集成囊胚狀，油球16個(gè)左右，大小各異，直徑范圍為0.045～0.073 mm，聚集緊密，表面光滑，未見(jiàn)明顯色素胞分布。

舌鰨屬-2卵為圓球狀 (圖2-m)，分離浮性；卵膜薄、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造；卵徑介于0.733～0.739 mm，均值為 (0.734±0.003) mm；卵黃顆粒細(xì)勻，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)；此時(shí)胚體已完全形成，魚(yú)卵原口已關(guān)閉，胚體纖長(zhǎng)環(huán)繞卵黃囊1/2時(shí)期；神經(jīng)管發(fā)育完善，沿胚體中軸向前延伸至吻端；胚體前端膨大形成分化的頭部，緊緊依附在卵黃囊上，吻端鈍圓；出現(xiàn)黑色素沉淀；視囊后方形成長(zhǎng)橢圓形聽(tīng)囊，左右各1個(gè)；耳石未形成；視囊形成；油球16個(gè)左右，大小各異，直徑介于0.045～0.075 mm，彼此分離分布在胚體中后部，表面光滑，未見(jiàn)明顯色素胞分布。

2.3 形態(tài)分類

本文采用形態(tài)學(xué)方法和DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合的研究方法，對(duì)江門海域采獲的13種魚(yú)卵進(jìn)行了種屬水平的種類鑒定。采獲的13種魚(yú)卵均為浮性卵，卵膜單層、光滑透明，無(wú)特殊構(gòu)造。形態(tài)特征的差異主要體現(xiàn)在卵膜形狀，卵徑大小，油球數(shù)量、分布及其色素分布，卵周隙寬窄，胚體上色素胞的顏色、數(shù)量及分布等?？煞謩e依據(jù)以上特征大致將魚(yú)卵種類進(jìn)行形態(tài)分類。首先是卵徑形狀：小公魚(yú)屬魚(yú)卵呈橢圓形，長(zhǎng)徑明顯大于短徑，其他種類為圓球形。其次是卵徑大小：沙丁魚(yú)屬魚(yú)卵卵徑最大，為1.563～1.615 mm，明顯大于其他魚(yú)卵卵徑 (0.644～0.873 mm)；副葉鲹屬卵徑最小，為0.644～0.659 mm。種屬間相近種類的卵徑變化相對(duì)較小，難以進(jìn)一步區(qū)分，但魚(yú)卵油球數(shù)量、分布及其色素分布具有一定差異。舌鰨屬魚(yú)卵油球數(shù)量較多且大小不一，表面無(wú)明顯色素分布，呈聚集或分散分布。其中舌鰨屬-1油球10個(gè)左右，聚集緊密，直徑介于0.042～0.096 mm；斑頭舌鰨油球16個(gè)左右，聚集緊密，直徑介于0.045～0.073 mm，聚集緊密；舌鰨屬-2油球16個(gè)左右，直徑介于0.045～0.075 mm，散布在胚體尾部；除舌鰨屬外其他種類魚(yú)卵均為單油球。此外，油球表面色素分布也可以進(jìn)一步輔助形態(tài)區(qū)分，如沙丁魚(yú)屬、小公魚(yú)屬及叫姑魚(yú)屬油球均無(wú)明顯色素分布，屬油球表面黃色色素胞較為密集，其他種類油球均有不同程度的黑色或黃色色素胞分布。再者是卵周隙寬窄：沙丁魚(yú)屬、眶棘雙邊魚(yú)魚(yú)卵的卵周隙均較寬，其他種類魚(yú)卵卵周隙均較窄。對(duì)于已有胚體形成的魚(yú)卵，胚體上色素胞顏色、數(shù)量及分布也是種類鑒定的重要依據(jù)。棘鯛屬胚體體干兩側(cè)及背部明顯分布有黃色素胞；副葉鲹屬胚體兩端規(guī)則分布有行列式黑色素胞。

3 討論

3.1 形態(tài)分類結(jié)合DNA條形碼在魚(yú)卵分類中的應(yīng)用

形態(tài)學(xué)鑒定作為早期魚(yú)類種類鑒定常規(guī)且普遍的研究方法，其鑒定過(guò)程復(fù)雜煩瑣，受限于分類專家的主觀判斷和儀器設(shè)備的制約[19]。Ko等[17]借助DNA條形碼技術(shù)對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)室仔魚(yú)形態(tài)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行檢查，摒棄未知種類，形態(tài)學(xué)方法鑒定至屬水平的準(zhǔn)確率為75.4%，而種水平僅為43.7%，認(rèn)為形態(tài)學(xué)方法僅能將魚(yú)類早期階段鑒定到科屬水平。DNA條形碼技術(shù)可較準(zhǔn)確地將早期魚(yú)類鑒定到種水平，形態(tài)分類與DNA條形碼結(jié)合顯著提高了種類鑒定的準(zhǔn)確性，已普遍應(yīng)用于早期魚(yú)類研究中。陳永久等[20]和周美玉等[21]研究發(fā)現(xiàn)DNA條形碼技術(shù)與形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合對(duì)于準(zhǔn)確鑒定魚(yú)卵、仔稚魚(yú)非常有效，特別是對(duì)魚(yú)卵的鑒定。Hou等[22]和Becker等[23]利用分子生物學(xué)方法對(duì)相關(guān)海域的魚(yú)卵進(jìn)行種類鑒定，發(fā)現(xiàn)DNA條形碼能將形態(tài)學(xué)分類結(jié)果鑒定至更低階元，證實(shí)了DNA條形碼技術(shù)在魚(yú)卵物種識(shí)別中的可行性。然而單一的DNA條形碼分析方法具有局限性，在種類鑒定和物種歸屬等問(wèn)題上仍有爭(zhēng)議。Labrador等[24]和Sukumaran等[25]使用兩個(gè)mtDNA標(biāo)記高變控制區(qū)和COI基因序列對(duì)沙丁魚(yú)屬魚(yú)類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)沙丁魚(yú)屬魚(yú)類為單倍體群體，遺傳分化水平較高，COI基因序列無(wú)法識(shí)別該屬中的隱種和種群結(jié)構(gòu)，需要借助高度特化的核DNA標(biāo)記進(jìn)一步分析。本文僅借助COI基因序列可能無(wú)法對(duì)沙丁魚(yú)屬進(jìn)行種水平的準(zhǔn)確劃分，為謹(jǐn)慎起見(jiàn)，僅保留鑒定至屬的分類結(jié)果。近年來(lái)，陸續(xù)發(fā)表的一些基因片段如12S rRNA、16S rRNA和Cytb等均可用于魚(yú)類種類鑒定研究[26-27]。因此，在形態(tài)分類結(jié)合DNA條形碼的基礎(chǔ)上，要實(shí)現(xiàn)對(duì)魚(yú)卵準(zhǔn)確的物種鑒定，還需要結(jié)合更多的序列片段分析，以提高種類鑒定及早期魚(yú)類形態(tài)判別的準(zhǔn)確性。此外，準(zhǔn)確性高、完整性強(qiáng)及基因片段豐富的成魚(yú)數(shù)據(jù)庫(kù)是序列分析鑒定種類的前提。南海DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建立[28]，使珠江口及近岸海域魚(yú)卵種類鑒定的準(zhǔn)確性得到了提高。Hou等[29]使用DNA條形碼和形態(tài)學(xué)共鑒定出珠江口春季和秋季的魚(yú)卵仔稚魚(yú)75個(gè)分類群，初步構(gòu)建了珠江口魚(yú)卵仔稚魚(yú)的形態(tài)數(shù)據(jù)庫(kù)。本文同樣依托公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，探討江門海域春季魚(yú)卵的形態(tài)特征及分類。

3.2 江門海域春季魚(yú)卵種類的形態(tài)及其初步分類探討

魚(yú)卵發(fā)育早期的種類鑒定主要以觀察其內(nèi)部形態(tài)為主，本文采獲的魚(yú)卵樣品最明顯的分類特征在于魚(yú)卵形狀、卵徑、油球、卵周隙等。我國(guó)海域廣泛分布有鯡科和鳀科魚(yú)類，種類數(shù)量均超過(guò)20種，其中記錄在冊(cè)的鯡科、小公魚(yú)屬魚(yú)類多達(dá)9種[30]。小公魚(yú)屬和鳀屬同屬于江門海域常見(jiàn)種類[18,31]，魚(yú)卵形狀均為橢圓形，其早期魚(yú)卵形態(tài)及胚胎發(fā)育變化極為相似，有無(wú)油球是兩者最明顯的鑒定特征[32]。對(duì)魚(yú)卵樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)，卵徑范圍為0.658～1.615 mm，油球徑范圍為0.042～0.193 mm，13種魚(yú)卵的發(fā)育時(shí)期存在差異，致使測(cè)量值有一定程度的重疊，不能作為魚(yú)卵分類的準(zhǔn)確依據(jù)。沙丁魚(yú)屬魚(yú)卵最明顯的分類特點(diǎn)是卵徑較大、卵黃囊較小、卵周隙寬，本文獲取的沙丁魚(yú)屬魚(yú)卵卵徑、卵黃囊及卵周隙大小均與趙孝威等[33]研究的青鱗沙丁魚(yú) (Sardinella zunas) 早期發(fā)育階段的形態(tài)相契合，但油球尺寸與其差異較大，現(xiàn)有的形態(tài)學(xué)資料無(wú)法鑒定到種。舌鰨屬魚(yú)卵的結(jié)構(gòu)特征具有一定的相似性[34]，舌鰨屬魚(yú)卵的顯著特征為多油球，根據(jù)萬(wàn)瑞景等[35]得出的魚(yú)卵形態(tài)特征，可初步判定3種魚(yú)卵皆為舌鰨屬魚(yú)卵。叫姑魚(yú)屬隸屬石首魚(yú)科，在《中國(guó)近海魚(yú)卵與仔魚(yú)》[36]中詳細(xì)記錄了叫姑魚(yú)屬受精卵和胚體環(huán)繞卵黃1/2時(shí)期魚(yú)卵內(nèi)部的形態(tài)變化特征，本文研究的叫姑魚(yú)屬卵徑和油球徑均在其記錄的合理范圍內(nèi)?？圃缙谏钍返男螒B(tài)學(xué)基礎(chǔ)資料相較于其他魚(yú)類魚(yú)卵是最為完整的，萬(wàn)瑞景和張仁齋[5]通過(guò)人工授精和孵化詳細(xì)記錄了多鱗魚(yú)卵11個(gè)發(fā)育時(shí)期的形態(tài)變化特征。相近種類魚(yú)卵的結(jié)構(gòu)特征具有一定的相似性[34]，單純依靠形態(tài)學(xué)分類難以將相近種類鑒定到種。鲾科魚(yú)類個(gè)體較小、數(shù)量較大，在珠江口海域一直處于優(yōu)勢(shì)地位[37]，然而其早期生長(zhǎng)階段的形態(tài)變化卻未被完全掌握，沖山宗雄[38]以圖簡(jiǎn)單示出頸斑項(xiàng)鲾 (Nuchequula nuchalis)魚(yú)卵的形態(tài)，本文所獲取鲾科魚(yú)卵的形態(tài)特征可對(duì)現(xiàn)有資料進(jìn)行有效補(bǔ)充。早期形態(tài)特征研究多關(guān)注具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種類，如日本鰻鱺 (Anguilla japonica)[39]和馬口魚(yú) (Opsariichthys bidens)[40]等，許多個(gè)體小、經(jīng)濟(jì)價(jià)值低但數(shù)量較大且具有重要生態(tài)作用的種類未被重視[15]，因而珠江口江門海域常見(jiàn)小型魚(yú)類早期發(fā)育階段的形態(tài)鑒定資料較少。本文通過(guò)對(duì)種類鑒定結(jié)果與鮮活樣品的形態(tài)記錄進(jìn)行分析，對(duì)江門海域13種魚(yú)卵的形態(tài)特征進(jìn)行了描述，可為今后江門海域魚(yú)卵形態(tài)的研究提供基礎(chǔ)資料。

3.3 不足及展望

本文依據(jù)從采獲樣品中獲取的魚(yú)卵形態(tài)特征，結(jié)合歷史資料，嘗試依據(jù)魚(yú)卵形狀和大小、卵周隙寬窄、油球數(shù)量和色素分布等特征進(jìn)行總結(jié)，可大致將研究海域春季魚(yú)卵種類進(jìn)行初步分類，但研究仍存在許多不足。首先，魚(yú)卵不同發(fā)育階段的形態(tài)變化較大，本文僅可獲取魚(yú)卵單一發(fā)育階段的形態(tài)信息，未掌握其他發(fā)育階段的形態(tài)特征。種屬間相近種類魚(yú)卵內(nèi)部形態(tài)特征相似，難以根據(jù)單一階段形態(tài)進(jìn)行區(qū)分，還需結(jié)合人工培養(yǎng)等獲取魚(yú)卵更多發(fā)育階段可靠的形態(tài)學(xué)信息。珠江口江門海域作為魚(yú)類重要的產(chǎn)卵場(chǎng)，本文通過(guò)單次采樣獲得的種類相對(duì)有限，構(gòu)建完整的形態(tài)分類檢索還需依托更多的采樣調(diào)查。其次，本文采集的是鮮活魚(yú)卵樣品，種類豐富、個(gè)體數(shù)量多，短期內(nèi)獲得了多個(gè)種類的形態(tài)特征信息，但是魚(yú)卵樣品處理及形態(tài)記錄需要一定時(shí)間，所處水體環(huán)境的驟然改變，導(dǎo)致某些種類魚(yú)卵的保存狀態(tài)變差。部分樣品基因組降解導(dǎo)致種類鑒定失敗；部分樣品受到水霉菌等的污染而死亡，導(dǎo)致魚(yú)卵內(nèi)部模糊不清，也在某種程度上改變了樣品的外在形態(tài)，影響了魚(yú)卵種類鑒定和形態(tài)特征獲取的效果。為盡可能獲取更多發(fā)育階段魚(yú)卵的形態(tài)特征，野外采獲后的魚(yú)卵需保持水體潔凈，并在減少人為干擾的情況下盡快觀察和記錄其形態(tài)。公共數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的豐富性、準(zhǔn)確性和完整性可極大地影響DNA條形碼的鑒定結(jié)果[17,29]，此外，沙丁魚(yú)屬等種類屬于單倍型群體，單一的COI片段不能滿足其鑒定至種的要求，因而加快建立并完善相關(guān)海域多種類、多片段的成魚(yú)基因數(shù)據(jù)庫(kù)是應(yīng)用DNA條形碼準(zhǔn)確鑒定魚(yú)卵的必要前提條件。同時(shí)在進(jìn)行魚(yú)卵資源調(diào)查時(shí)，結(jié)合同期采集的成魚(yú)樣品進(jìn)行種類分析或可提高魚(yú)卵鑒定及其形態(tài)特征獲取的準(zhǔn)確性[8,41]。

4 結(jié)論

本文根據(jù)2021年春季珠江口江門海域的浮游生物調(diào)查，闡述了江門海域13種常見(jiàn)魚(yú)卵的形態(tài)學(xué)特征。研究發(fā)現(xiàn)大部分魚(yú)卵可通過(guò)卵膜形狀，卵徑大小，油球數(shù)量、分布及其色素分布，卵周隙寬窄，胚體上色素胞顏色、數(shù)量及分布等形態(tài)特征進(jìn)行分類。然而相近種類難以通過(guò)單一發(fā)育階段的形態(tài)特征進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，文中借助DNA條形碼技術(shù)對(duì)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩者的鑒定結(jié)果在科水平上較為一致，且DNA條形碼技術(shù)能成功對(duì)江門海域魚(yú)卵進(jìn)行更低階元的劃分。受限于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中魚(yú)類數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性，借助DNA條形碼進(jìn)行種類分析時(shí)，為謹(jǐn)慎起見(jiàn)，相關(guān)魚(yú)卵種類未能鑒定至種。本文首次針對(duì)珠江口江門海域春季魚(yú)卵種類進(jìn)行形態(tài)特征研究，未涉及其他季節(jié)，魚(yú)卵種類相較于同期捕獲的成魚(yú)種類較少，今后為更全面地掌握珠江口江門海域魚(yú)卵的形態(tài)特征和檢索資料，還需要進(jìn)行重復(fù)采樣和深入研究。