馬騰飛，溫 彬, ，劉 鑫，繆 琳，高建忠, ，陳再忠,

1. 上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306

2. 上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306

七彩神仙魚 (Symphysodon aequifasciatus) 隸屬于鱸形目、慈鯛科、盤麗魚屬，原產(chǎn)于南美洲的亞馬遜河流域，是觀賞魚中的名貴品種[1-3]。該物種具有獨特的親代撫育行為，即仔魚在孵化后的一個月內(nèi)以親本體表分泌的黏液為食[4-5]。盡管受到子代長達1個月的咬食刺激，但親魚體表并未被感染和病害，暗示親代體表可能具有較強的免疫防御。Chong等[6]研究發(fā)現(xiàn)，為了適應(yīng)子代免疫需要，C型凝集素 (C-Type lectins, CTLs) 在育幼親本體表黏液中特異表達，可能在親子抗菌防御方面發(fā)揮重要作用。

CTLs作為一種重要的模式識別受體，對魚類抵御病原微生物入侵有著重要的作用。CTLs通常含有一個或多個碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域 (Carbonhydrate-recognition domain, CRD) 或稱C型凝集素結(jié)構(gòu)域 (C-Type lectin domain, CTLD)[7-8]。CTLs研究在脊椎動物中較為廣泛深入，目前已有1 000多個CTLs被鑒定出[9]。魚類CTLs研究主要集中于其對病原相關(guān)分子模式的識別與結(jié)合、引發(fā)致病微生物的凝集、增強巨噬細胞對致病菌的吞噬能力以及激活補體系統(tǒng)等方面[10-11]。CD302 (Cluster of differentiation 302)，又稱DCL-1 (DEC-205-associated C-type lectin-1)，被劃分在CTLs家族XV組 (Bimlec)，屬于I型跨膜蛋白[12-13]；CD302作為一種凝集素受體，參與免疫細胞的功能調(diào)節(jié)。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)，香魚 (Plecoglossus altivelis) 肝、頭腎和脾中PaCD302在鰻弧菌 (Vibrio anguillarum) 感染下表達顯著上調(diào)，且可能通過調(diào)節(jié)單核細胞或巨噬細胞來參與對細菌感染的免疫反應(yīng)。甘露糖結(jié)合凝集素 (Mannan-binding lectins, MBL) 廣泛存在于動物中，是第一個被發(fā)現(xiàn)具有防御功能的CTLs[15]；它可以特異性識別細菌、真菌和病毒等病原體，還可以與微生物表面的糖類結(jié)合，起到免疫調(diào)節(jié)以及抵御外界病原微生物入侵的作用[16-17]。筆者前期對七彩神仙魚育幼期皮膚轉(zhuǎn)錄組的分析發(fā)現(xiàn)，CD302在親代撫育期間持續(xù)高表達，而MBL基因在育幼結(jié)束后表達顯著上調(diào)，暗示著二者可能參與了親子的先天免疫反應(yīng)，且扮演不同角色。

氣單胞菌屬 (Aeromonas) 是一種在觀賞魚類中引起疾病的常見細菌[18-19]，也是造成七彩神仙魚發(fā)病的主要病原之一[20]。El-Ghany等[21]在患病的七彩神仙魚中分離出嗜水氣單胞菌 (A. hydrophila)。本研究從七彩神仙魚皮膚中克隆獲得2個新的CTLs家族成員，命名為SaCD302和SaMBL，并通過熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, qRTPCR) 分析它們在不同組織中的表達，以及在嗜水氣單胞菌刺激下相關(guān)組織中的表達變化，以期了解CD302和MBL在七彩神仙魚免疫系統(tǒng)中可能的作用，豐富魚類CTLs功能研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

健康的七彩神仙魚 (體長10～13 cm，體質(zhì)量80～100 g) 取自上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地，于(28±0.5) ℃，pH 7.8±0.5，持續(xù)充氧條件下暫養(yǎng)，使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。嗜水氣單胞菌菌株來自上海海洋大學(xué)病原庫。

TRIzol (Invitrogen，美國)、PrimeScript? RT Master Mix (TaKaRa，日本)購自上海生工生物公司。2×T5 Fast qPCR Mix (TsingKe，中國)、金牌Mix green (TsingKe，中國) 購自北京擎科生物公司。所有引物運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

選取3條雄性七彩神仙魚進行解剖，取腦、鰓、心臟、頭腎、脾臟、皮膚、肝臟、腸道、肌肉和性腺共10種組織，每個組織3個重復(fù)。使用TRIzol試劑提取各組織中的RNA。經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1% MOPs瓊脂糖凝膠電泳與微量核酸蛋白測定儀進行定性和定量檢測。根據(jù)PrimeScript? RT Master Mix 說明書，以1 μg總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，?20 ℃ 保存。

1.3 基因克隆

從前期測定七彩神仙魚皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中選取SaCD302和SaMBL的CDS區(qū)來分別設(shè)計引物(表1)。以七彩神仙魚皮膚組織的cDNA為模版，利用PCR及上述引物對SaCD302和SaMBL進行擴增。擴增體系25 μL：皮膚cDNA 1 μL，正反向引物各 1 μL，金牌 Mix green (TsingKe) 22 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，34個循環(huán)；72 ℃總延伸1 min；4 ℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物置于10 g·L?1瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，目的片段回收送上海生工生物公司測序。

表1 七彩神仙魚 SaCD302 和 SaMBL 基因克隆及熒光定量PCR引物Table 1 Cloning and fluorescence quantitative primers of SaCD302 and SaMBL gene in S. aequifasciatus

1.4 生物信息學(xué)分析

使用NCBI上的ORF Finder查找SaCD302和SaMBL基因的開放閱讀框，并推導(dǎo)出基因的氨基酸序列。使用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 進行序列同源性分析；采用ExPASy在線工具 (http://web.expasy.org/compute_pi/) 預(yù)測等電點及蛋白分子量，利用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；使用SWISSMODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/) 進行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用Clustal X和MEGA 5.0軟件進行多序列比對和聚類分析，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 組織表達分析

根據(jù)克隆驗證得到的SaCD302和SaMBL序列來分別設(shè)計qRT-PCR的特異性引物(表1)。采用前期驗證的內(nèi)參基因β-actin來設(shè)計引物β-actinqPCR-F和β-actin-qPCR-R[22]。以上述10個組織的cDNA為模版，利用qRT-PCR分別分析SaCD302和SaMBL在各組織中的表達情況。反應(yīng)體系 20 μL：2×T5 Fast qPCR Mix (TsingKe) 10 μL，cDNA 模板 1.6 μL，正反向引物各 0.8 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min (預(yù)變性，1個循環(huán))；95° C 10 s，56 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s (擴增段，共40 個循環(huán))；95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s (熔解段，1個循環(huán))。每個樣品重復(fù)檢測3次，包括目的基因 (SaCD302和SaMBL) 和內(nèi)參基因 (βactin)。采用 2?ΔΔCt計算 SaCD302 和 SaMBL 在各組織的相對表達量。

1.6 嗜水氣單胞菌免疫刺激后的表達變化

實驗組隨機選取36尾健康的七彩神仙魚，養(yǎng)殖于6個水族箱，使用1×107CFU·mL?1嗜水氣單胞菌菌液對其進行腹腔注射 (200 μL·尾?1)，對照組于另外36尾魚中注射等量的PBS緩沖液。兩組分別在注射后第0、第6、第12、第24、第48和第72小時取樣，每個時間點實驗組與對照組均隨機選取6尾存活的七彩神仙魚，提取皮膚、頭腎、肝臟和腸道4個組織的總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測嗜水氣單胞菌刺激SaCD302和SaMBL的應(yīng)答模式，反應(yīng)條件和體系同上。使用2???Ct(??Ct =?Ct實驗??Ct對照)法計算所得數(shù)據(jù)，分析SaCD302和SaMBL的相對表達量，并使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及生物信息學(xué)分析

SaCD302和SaMBL的cDNA序列ORF區(qū)序列長度分別為741和795 bp，分別編碼246和264個氨基酸 (圖1-a、1-b)。蛋白序列預(yù)測蛋白分子量(MW) 分別為27 614.17和27 912.51 D，理論等電點 (PI) 分別為4.89和5.97。SaCD302結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，在N端29個氨基酸 (Amino acid, aa) 殘基為信號肽序列 (aa 1—29)，隨后是長度為138個氨基酸的CTL結(jié)構(gòu)域 (aa 32—169)，C末端有跨膜區(qū)共23個氨基酸 (aa 184—206，圖2-a)。SaMBL結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，其含有2個低復(fù)雜度區(qū)域 (aa 32—92和aa 104—121) 和1個典型的CTL結(jié)構(gòu)域(aa 137—263，圖 2-b)。

圖1 SaCD302 (a) 和SaMBL (b)基因的核酸序列及氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of SaCD302 (a) and SaMBL (b)

圖2 SaCD302 (a) 和SaMBL (b) 結(jié)構(gòu)域示意圖Fig. 2 Domain of SaCD302 (a) and SaMBL (b)

2.2 多重序列對比與進化分析

BLAST同源性對比結(jié)果顯示，SaCD302 與10種魚的CD302氨基酸序列具有較高的同源性(51.93%～94.72%)。與尼加拉瓜湖始麗魚 (Archocentrus centrarchus) 同源性最高 (94.72%)，其次與斑馬擬麗魚 (Maylandia zebra) CD302同源性較高(82.93%)，與斑馬魚 (Danio rerio) 的同源性最低(51.93%，圖3-a)。SaMBL與8種魚的MBL氨基酸序列的同源性介于28.64%～90.73%，與尼加拉瓜湖始麗魚同源性最高 (90.73%)，與斑馬魚的同源性最低 (28.64%，圖3-b)。使用MEGA軟件對各物種CD302和MBL氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果顯示，所有魚類的CD302聚為一簇，其他哺乳動物聚為一簇 (圖4-a)；斑馬魚的MBL與其他哺乳動物聚為一簇，其余魚類聚為一簇 (圖4-b)；SaCD302和SaMBL均與同為慈鯛科的尼加拉瓜湖始麗魚關(guān)系最近，符合自然物種的進化規(guī)律。

圖3 SaCD302 (a) 和SaMBL (b) 氨基酸的多重序列比對Fig. 3 Multiple sequence alignment of amino acid sequences of SaCD302 (a) and SaMBL (b)

圖4 基于NJ法構(gòu)建的SaCD302 (a) 和SaMBL (b) 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic analysis of SaCD302 (a) and SaMBL (b)

2.3 組織表達分析

通過qRT-PCR對SaCD302基因在不同組織中表達水平進行分析。結(jié)果顯示，SaCD302廣泛表達于七彩神仙魚各組織中，但存在一定的組織差異性。其中在頭腎中表達量最高，而后依次為肝臟、鰓、腦、脾臟等，在肌肉中表達量最低 (圖5-a)。SaMBL在皮膚中顯著表達，而在腸道、肝臟、脾臟和性腺中表達量卻非常低 (圖5-b)。

圖5 SaCD302 (a) 和SaMBL (b) 在七彩神仙魚不同組織中的表達特征注：圖中不同字母表示在不同組織中存在差異性顯著 (P<0.05)；后圖同此。Fig. 5 Relative expression of SaCD302 (a) and SaMBL (b) in different tissues of S. aequifasciatusNote: Different letters indicate significant difference in expression of different tissues (P<0.05). The same case in following figures.

2.4 病原刺激的表達變化

利用qPCR方法分析嗜水氣單胞菌刺激后不同時間七彩神仙魚各組織中SaCD302和SaMBL的表達變化特征。結(jié)果表明SaCD302 mRNA在脾臟中的表達在第6小時增加并達到頂峰，為對照組的2倍；在第12小時開始降低，第24—第72小時有輕微起伏，最終降低到正常水平 (圖6-a)。在頭腎中的表達第6小時開始增加，在第12小時達到頂峰，分別為對照組的3.6和4.1倍；在第24小時開始降低，在第48和第72 小時回升，分別為對照組的1.3、3.0和2.2倍 (圖6-b)。SaCD302 mRNA在腸道中的表達量第6小時開始增加，為對照組的1.8倍；第12小時達到峰值，顯著高于對照組，為對照組的6.4倍；第24小時出現(xiàn)降低，第48小時達到最低值，為對照組的0.03倍，第72小時回調(diào)至正常水平 (圖6-c)。在皮膚中的表達量第6小時開始增加，第12小時達到頂峰，分別為對照組的3.7和8.0倍；第24小時開始下降，在第48小時降到最低，為對照組的0.15倍；第72小時回調(diào)至正常水平 (圖6-d)。

SaMBL在感染后脾臟中的表達量均低于對照組(圖7-a)。在頭腎中的表達量在第6小時增加并達到頂峰，為對照組的1.95倍；第12小時開始下調(diào)，第72小時回升到對照組的1.78倍 (圖7-b)。SaMBL在腸道中的表達量第6小時開始增加，第12小時達到頂峰，為對照組的1.2倍 (圖7-c)。在皮膚中，第6小時表達量開始增加并達到頂峰，為對照組的9.04倍；從第12小時開始下降，第48小時回調(diào)到正常水平 (圖7-d)。

圖7 嗜水氣單胞菌感染后SaMBL在七彩神仙魚不同組織中的表達分析Fig. 7 Expression analysis of SaMBL in different tissues from S. aequifasciatus infected by A. hydrophila

3 討論

C型凝集素是一種依賴鈣離子 (Ca2+) 選擇性結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)家族，在免疫中發(fā)揮重要作用[23]。本研究克隆得到SaCD302和SaMBL。SaCD302推導(dǎo)的氨基酸序列包含一個29個aa的信號肽，可以指引蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)運輸，目前為止，大多數(shù)CTLs基因均包含信號肽[24]，但是SaMBL卻不含信號肽，表明該基因在七彩神仙魚CTLs家族中可能有一定的特殊性。另外，兩個基因均包含一個CTLs結(jié)構(gòu)域，這也是證明其為CTLs基因的重要依據(jù)。同源性對比結(jié)果表明，SaCD302和SaMBL均與同為慈鯛科的尼加拉瓜湖始麗魚同源性最高。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，SaCD302和SaMBL均與魚類聚為一簇，暗示著SaCD302和SaMBL進化的保守性。

SaCD302和SaMBL在組織表達分布上存在顯著差異。SaCD302在七彩神仙魚各組織中均有表達，其中在頭腎中表達量最高，其后依次為肝臟、鰓、腦、脾臟等。研究表明CD302在魚類各組織中廣泛分布，且在大多免疫相關(guān)組織中表達豐富[25-26]，這與本研究結(jié)果一致，表明CD302在魚類先天免疫中發(fā)揮著重要作用。松江鱸 (Trachidermus fasciatus) CD302在頭腎中表達最高，這與本研究結(jié)果相似[25]。SaCD302在七彩神仙魚頭腎中高表達，原因可能是頭腎為魚類的重要免疫器官，含有淋巴細胞和吞噬細胞等多種免疫細胞[27]。在虹鱒 (Oncorhynchus mykiss) 和草魚 (Ctenopharyngodon idellus) 的研究中，MBL在肝臟和脾臟表達較高[28-29]。本研究中，SaMBL在皮膚中顯著表達，而在腸道、肝臟、脾臟和性腺中的表達量卻非常低，表明與其他魚類相比，MBL在七彩神仙魚的皮膚中可能扮演更加重要的角色。魚類皮膚上分泌的黏液幾乎覆蓋在魚體所有表面，構(gòu)成其與外界直接接觸的第一層免疫防御，保護魚體免遭外界環(huán)境中的病菌、寄生物和病毒侵襲[30-31]。SaMBL在皮膚中的高表達暗示著其可能在魚類黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。

松江鱸的TfCD302廣泛存在于各組織中，且頭腎中的表達量最高，在鰻弧菌的刺激下，松江鱸的鰓、皮膚、頭腎、肝臟中的CD302均上調(diào)表達[25]。哈維氏弧菌 (V. harveyi) 刺激花鱸 (Lateolabrax japonicus) 后，LjCD302在頭腎、腸、鰓、脾和肝中的表達量顯著上調(diào)[26]。CD302可能在魚類抵抗病原入侵的先天免疫應(yīng)答中具有重要作用。本研究在嗜水氣單胞菌的刺激下，檢測了七彩神仙魚免疫組織中SaCD302 mRNA的時序表達。SaCD302的表達水平在皮膚和腸道中總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而在頭腎和脾臟中均出現(xiàn)了在第48小時回升，第72小時下降，推測SaCD302在頭腎和脾臟中的免疫反應(yīng)更加持久。脾臟中第6小時表達量達到峰值，腸道、皮膚和頭腎在第12小時達到峰值，推測可能與嗜水氣單胞菌刺激后免疫組織發(fā)揮的時效和作用原理有關(guān)。而各組織表達量在每個階段均顯著高于對照組，表明SaCD302在嗜水氣單胞菌感染時發(fā)揮了重要的免疫防御作用。

SaMBL在嗜水氣單胞菌刺激后，腸道和脾臟的表達變化低于其他組織，可能是因為其在組織中的表達本身較低。草魚MBL在嗜水氣單胞菌感染后，在頭腎中的表達在第4小時達到最大值，然后開始逐漸降低至正常水平[29]。這與本研究結(jié)果相似，七彩神仙魚在病原感染后，頭腎在第6小時表達量達到峰值，為對照組的1.95倍，之后開始降低。而皮膚中同樣在第6小時達到峰值且顯著高于對照組，為對照組的9.04倍，表明七彩神仙魚MBL在皮膚里抗菌免疫中可能發(fā)揮更顯著的作用。總之，SaCD302和SaMBL在病原感染后的大多組織中均有表達上調(diào)，在感染24 h后均下降到對照組水平，表明嗜水氣單胞菌引起的感染可能在第24小時結(jié)束第一輪感染。但SaCD302和SaMBL不論是組織表達，或是病原刺激下的免疫應(yīng)答模式，均有不同程度的差異，這暗示在七彩神仙魚親代撫育階段，兩個基因可能都對親魚先天免疫反應(yīng)發(fā)揮作用，但作用機制不同。

本研究從七彩神仙魚皮膚中克隆得到SaCD302和SaMBL 基因，對其進行了結(jié)構(gòu)域和進化樹分析，并測定了SaCD302和SaMBL在不同組織以及嗜水氣單胞菌感染后的免疫應(yīng)答。結(jié)果表明，在病原菌的刺激下，SaCD302和SaMBL均可以迅速作出應(yīng)答，但應(yīng)答模式不同，表明兩個CTLs基因可能在七彩神仙魚抗病原入侵時發(fā)揮不同作用，具體機制還有待進一步的功能驗證。