陶廷露，鄧小娟，張 云，楊武晨，張 曦，彭顯貴

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液病醫(yī)學(xué)中心，重慶 400037)

自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是不同于T、B淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞亞群，具有細(xì)胞毒活性，能產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子和趨化因子。日本學(xué)者在研究NK細(xì)胞發(fā)育過程中提出了NK細(xì)胞五階段理論，其在各階段發(fā)育中克隆性增生可導(dǎo)致特定惡性腫瘤[1]。隨著對NK細(xì)胞發(fā)育的研究和認(rèn)識的深入，2008版WHO惡性淋巴瘤分類標(biāo)準(zhǔn)中將以下4類疾病，即慢性NK細(xì)胞淋巴組織增生性疾病(cLPD-NK)、侵襲性NK細(xì)胞白血病(ANKL)、結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤、鼻型NK/T淋巴瘤(ENKTL-NT)歸為成熟NK細(xì)胞腫瘤，并認(rèn)為其發(fā)病是第4、5階段成熟NK細(xì)胞惡性克隆所致。將前體和未成熟NK細(xì)胞如髓系/NK前體細(xì)胞白血病和前體NK-淋巴母細(xì)胞淋巴瘤/白血病均歸為白血病范圍[2]。此前，由于成熟NK細(xì)胞淋巴瘤在非霍奇金淋巴瘤中發(fā)病率較低，對該疾病的認(rèn)識不充分、命名繁多，導(dǎo)致誤、漏診率均較高。近年來，隨著流式細(xì)胞術(shù)及分子生物學(xué)等綜合診斷技術(shù)的快速發(fā)展，對成熟NK細(xì)胞淋巴瘤的認(rèn)知及診斷水平均有很大提高。本研究回顧性統(tǒng)計了本中心收治的30例成熟NK細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床資料，分析了其臨床特點及實驗室檢查特征，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2021年1月本中心收治的30例成熟NK細(xì)胞淋巴瘤骨髓侵犯患者的臨床資料，其中男18例，女12例；年齡14～75歲，中位年齡42歲；ANKL 8例，ENKTL-NT 16例，cLPD-NK 6例。所有患者的診斷均參照2008年WHO造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[2]。流式細(xì)胞術(shù)檢測呈CD2+、sCD3-、cCD3+、CD5-、CD56+，無T淋巴細(xì)胞抗原受體(TCR)γδ 及 TCRαβ表達(dá)，無T、B、髓系特異性標(biāo)志表達(dá)，判定為存在抗原異常表達(dá)及克隆性增生的NK細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞。臨床分期參照Ann-Arbor分期。所有患者均為組織病理檢查確診為NK/T淋巴瘤后經(jīng)骨髓穿刺細(xì)胞形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測診斷為成熟NK細(xì)胞淋巴瘤骨髓侵犯病例。

1.2 方法

1.2.1骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)

無菌條件下行骨髓穿刺，抽吸0.2～0.5 mL骨髓液，涂片8張備用。骨髓涂片經(jīng)瑞氏-姬姆薩染液染色，在油鏡下分類計數(shù)200～500個有核細(xì)胞，并加做過氧化物酶(POX)和糖原(PAS)染色。淋巴瘤細(xì)胞占有核細(xì)胞比例5%～<20%診斷為骨髓侵犯，淋巴瘤細(xì)胞占有核細(xì)胞比例≥20%診斷為淋巴瘤細(xì)胞白血病，淋巴瘤細(xì)胞占有核細(xì)胞比例<5%診斷為疑似侵犯。參考法美英三國協(xié)作組提出的FAB形態(tài)學(xué)分型方案中關(guān)于急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL) 分型方法及細(xì)胞分化程度(原始、幼稚、成熟)將瘤細(xì)胞形態(tài)大致分為3類：(1)小細(xì)胞成熟型，以小細(xì)胞為主，較不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)較少，呈灰藍(lán)色，含A顆粒；核呈圓形或類圓形，染色質(zhì)聚集呈小塊狀，核仁消失或留有核仁殘跡。(2)原幼細(xì)胞型，細(xì)胞體多數(shù)為中等大小，不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)豐富，深藍(lán)色，個別含A顆粒；核型呈圓形或類圓形，染色質(zhì)粗顆粒，核仁隱約可見。(3)單核細(xì)胞型，細(xì)胞體大小不一，極不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)多少不一，呈灰藍(lán)色，A顆粒多少不定；核畸形變顯著，染色質(zhì)粗細(xì)不定，核仁大而可見。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)

采取2 mL肝素抗凝的骨髓標(biāo)本，用直接免疫標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。流式細(xì)胞儀購自美國BKM公司(型號：BC Navios)，標(biāo)記的抗體有CD10、CD79b、CD19、CD20、CD22、FMC7、CD23、CD25、CD103、CD11c、sCD3、cCD3、CD5、CD2、CD16、CD56、CD57、CD1a、CD26、CD7、CD4、CD8、CD13、CD14、CD33、MPO、CD41a、CD61、CD71、CD34、CD38、CD45、HLA-DR、TdT、Kappa、Lambda等。獲取500 000個有核細(xì)胞，采用CD45/SSC/FSC設(shè)門。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 臨床特點

8例ANKL患者多數(shù)出現(xiàn)發(fā)熱，淋巴結(jié)腫大并伴有不同程度肝功能損害，乳酸脫氫酶(LDH)、鐵蛋白升高，5例繼發(fā)噬血細(xì)胞綜合征(HPS)；16例ENKTL-NT患者表現(xiàn)為發(fā)熱15例，伴有不同程度淋巴結(jié)、肝腫大10例，脾腫大8例，其臨床表現(xiàn)與ANKL患者極為相似。1例cLPD-NK患者有發(fā)熱，淋巴結(jié)腫大現(xiàn)象。ANKL患者血象多以全血細(xì)胞減少為主(6例)，ENKTL-NT患者以兩系或三系血細(xì)胞下降為主，但二者血象差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。6例cLPD-NK患者均出現(xiàn)白細(xì)胞(WBC)總數(shù)增高，WBC總數(shù)較ANKL、ENKTL-NT患者均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 NK淋巴細(xì)胞瘤臨床特點

-:表示無數(shù)據(jù)。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

各類型成熟NK細(xì)胞淋巴瘤在骨髓中的細(xì)胞大小及形態(tài)特征表現(xiàn)不同，ANKL患者瘤細(xì)胞多數(shù)以原幼細(xì)胞型為主，ENKTL-NT患者瘤細(xì)胞以單核細(xì)胞型為主，原幼細(xì)胞型也可見；cLPD-NK患者以成熟小細(xì)胞型為主。見圖1～3、表2。

圖1 原幼細(xì)胞型

圖2 單核細(xì)胞型

圖3 成熟小細(xì)胞型

表2 NK淋巴細(xì)胞瘤骨髓細(xì)胞學(xué)分型情況

2.3 免疫表型

30例患者免疫表型主要為CD56、CD2、CD57、CD16、CD7、cCD3、CD26等，見表3。多數(shù)ANKL、ENKTL-NK、cLPD-NK患者CD56、CD2呈陽性，ANKL患者CD57、CD7低表達(dá)，ENKTL-NK、cLPD-NK患者CD57、CD7高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。1例臨床診斷ANKL患者流式免疫分型檢測到兩群細(xì)胞，A群免疫表型CD56medCD7+CD11c+cCD3+CD2+CD4-CD8-mCD3-CD94-CD161+考慮為NK T淋巴細(xì)胞，占11.11%；B群免疫表型CD34+CD117+DR+CD38+CD13+CD33+CD56bri+CD7+cCD3-cd161-CD94-為異常髓系NK前體細(xì)胞，占46.78%瘤細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為原幼細(xì)胞型，比例占59%。1例cLPD-NK患者細(xì)胞形態(tài)可見原始及幼稚淋巴細(xì)胞占6%，大顆粒成熟淋巴細(xì)胞占46%，免疫表型CD56+CD2+CD57+cCD3-CD16+CD4-CD8-，免疫組織化學(xué)檢查Ki-67結(jié)果為35%。

表3 30例患者免疫表型

2.4 骨髓細(xì)胞學(xué)與流式細(xì)胞術(shù)診斷率

30例患者根據(jù)骨髓形態(tài)學(xué)診斷骨髓侵犯陽性15例，疑似11例，陰性4例。流式細(xì)胞學(xué)檢測診斷骨髓侵犯陽性26例，疑似3例，陰性1例。流式細(xì)胞術(shù)檢測陽性率明顯高于涂片檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(86.7%vs. 50.0%,P<0.05)。

3 討 論

2008年WHO標(biāo)準(zhǔn)將ANKL、ENKTL-NT、cLPD-NK均歸入成熟NK細(xì)胞腫瘤，這類疾病的發(fā)病率、分布狀況因地域和種族的不同而有所差異。與歐美國家比較，成熟NK細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病率在包括中國的亞洲國家相對較高[3]。ENKTL-NT首發(fā)于骨髓患者的臨床表現(xiàn)與ANKL患者極為相似，且病情進(jìn)展快，加大了臨床診斷的難度。cLPD-NK較為罕見，表現(xiàn)為無痛性的臨床過程，通常以WBC增多被發(fā)現(xiàn)，外周血NK細(xì)胞不明原因增高，>2×109/L至少6個月[4]。本研究結(jié)果顯示，cLPD-NK患者WBC總數(shù)均高于前二者，但由于NK細(xì)胞缺乏一種特征性的重排抗原受體基因，使得很難區(qū)分惡性克隆和反應(yīng)性過程，因此，診斷往往被推遲，臨床鑒別診斷困難。

ANKL臨床罕見，起病急，病死率極高。本研究8例ANKL患者中7例臨床表現(xiàn)出發(fā)熱，5例淋巴結(jié)腫大，6例患者全血細(xì)胞減少，4例患者肝腫大，并伴有不同程度的肝功能不全，分別有7例和5例患者LDH、鐵蛋白升高，與文獻(xiàn)報道一致[5]。ENKTL-NT占所有非霍奇金淋巴瘤的5%～15%，多首發(fā)于鼻部及其周圍組織，以發(fā)熱為主，侵襲性強，進(jìn)展快，預(yù)后較差[6-7]。本研究ENKTL-NT骨髓侵犯患者也有不同程度的肝、脾、淋巴結(jié)腫大，且多數(shù)表現(xiàn)為發(fā)熱，外周血常規(guī)可有不同程度的一系或多系血細(xì)胞減少，在臨床表現(xiàn)方面與ANKL難以鑒別。本研究統(tǒng)計的多數(shù)ANKL、ENKTL-NT患者EB病毒-DNA載量、LDH、鐵蛋白均升高的臨床數(shù)據(jù)可用于協(xié)助腫瘤負(fù)荷的評估，幫助指導(dǎo)早期ANKL、ENKTL-NT的分期及預(yù)后。TAKAHARA等[8]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定了20例ENKTL-NT患者血清EB病毒-DNA水平，結(jié)果顯示，20例患者EB病毒-DNA均處于較高水平。隨著治療的進(jìn)行EB病毒-DNA水平降低，而在復(fù)發(fā)時增加。SUZUKI等[9]和FEI等[10]也研究了ENKTL-NT患者治療前血漿EB病毒-DNA水平與幾個臨床因素的關(guān)系，結(jié)果表明，可檢測的血漿EB病毒-DNA與更高的臨床階段、B癥狀、更差的表現(xiàn)狀態(tài)有關(guān)，臨床分期、治療前血漿EB病毒-DNA水平是重要的預(yù)后因素。因此，ANKL、ENKTL-NT被認(rèn)為是EB病毒相關(guān)淋巴瘤[11]。

本研究將30例成熟NK腫瘤細(xì)胞根據(jù)其骨髓細(xì)胞形態(tài)特征分為3種類型，ANKL骨髓侵犯以原幼細(xì)胞型為主。據(jù)文獻(xiàn)報道，根據(jù)免疫表型CD56的表達(dá)強度，NK細(xì)胞可分為兩種亞型，即90%的NK細(xì)胞為CD56dim/CD16bri-，另外10%的NK細(xì)胞為CD56bri-/CD16dim。后一組被認(rèn)為代表了NK細(xì)胞分化的早期階段，因該組中的細(xì)胞端粒較長，并且在異基因造血干細(xì)胞移植后出現(xiàn)的時間早于前一組[12-13]。CD56dim/CD16dimNK細(xì)胞屬中間階段的細(xì)胞，逐漸失去增殖能力，開始表達(dá)偏后期的CD57和KIR[14]。本研究結(jié)果顯示，7例ANKL患者的異常NK細(xì)胞為CD56bri-/CD16dim和CD57陰性，提示贅生的白血病細(xì)胞存在分化失敗和凋亡障礙。而早期的NK細(xì)胞也意味著侵襲力較強，這也解釋了ANKL骨髓侵犯的細(xì)胞類型表現(xiàn)為原幼細(xì)胞型的說法。本研究中ENKTL-NK骨髓侵犯則以單核細(xì)胞型為主，原幼細(xì)胞型也可見；TAKAHARA等[8]回顧ENKTL-NT發(fā)展史提到，以前組織學(xué)上ENKTL-NT由血管中心性和多形性淋巴網(wǎng)狀浸潤組成，被稱為多形性網(wǎng)狀細(xì)胞增多癥，形態(tài)學(xué)上網(wǎng)狀細(xì)胞與變形性大的單核細(xì)胞具有相似之處，與本研究ENKTL-NT骨髓侵犯以單核細(xì)胞型為主的結(jié)果一致。cLPD-NK以成熟小細(xì)胞型為主，與楊再林等[15]提出的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致?？梢姡?種成熟NK腫瘤的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的細(xì)胞特點差異較大，特征明顯，可為臨床診斷與鑒別診斷及進(jìn)一步檢查提供思路與方向。

有研究表明，流式細(xì)胞學(xué)對這三類疾病骨髓侵犯的陽性檢出率高于細(xì)胞形態(tài)學(xué)。但當(dāng)淋巴瘤細(xì)胞骨髓侵犯比例大于5%時兩種方法的陽性檢出率較為一致。而差異主要體現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)變異性小且瘤細(xì)胞比例少的病例中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)對瘤細(xì)胞比例少、形態(tài)特征明顯的淋巴瘤細(xì)胞的陽性檢出率較高。而流式細(xì)胞學(xué)檢測對少量的、形態(tài)變異程度不高的細(xì)胞淋巴瘤的檢測更具有優(yōu)勢，其靈敏度也高，與張巧梅等[16]研究結(jié)果一致。本研究中有1例臨床診斷ANKL淋巴瘤患者流式細(xì)胞學(xué)查見兩群異常細(xì)胞群，A群免疫表型CD56medCD7+CD11c+cCD3+CD2+CD4-CD8-mCD3-CD94-CD161+考慮為NK T淋巴細(xì)胞，占11.11%；B群免疫表型CD34+CD117+DR+CD38+CD13+CD33+CD56bri+CD7+cCD3-cd161-CD94-考慮為異常髓系NK前體細(xì)胞，占46.78%；該患者細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為原始及幼稚淋巴細(xì)胞，占59%。國外學(xué)者將NK細(xì)胞腫瘤按其起源分為兩類五型，第一類為前體NK細(xì)胞腫瘤，包括髓系/NK前體細(xì)胞急性白血病和前體NK-淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤；第二類為成熟NK細(xì)胞腫瘤，包括ANKL、ENKTL-NT和cLPD-NK[17]。根據(jù)上述分類，該患者可劃為髓系/NK前體細(xì)胞急性白血病。而這類白血病在2008年WHO造血和淋巴組織腫瘤分類中并未分類于T/NK細(xì)胞淋巴瘤中，只是在系列不明的急性白血病章節(jié)中進(jìn)行了非結(jié)論性的論述，加之該疾病臨床罕見，臨床醫(yī)師對NK細(xì)胞的發(fā)育途徑及NK細(xì)胞腫瘤診療尚未達(dá)成共識，最后診斷為ANKL。但二者需進(jìn)行鑒別，髓系/NK前體細(xì)胞急性白血病起病隱匿，常以淋巴結(jié)、縱隔等部位的髓外浸潤為首發(fā)表現(xiàn)，最終轉(zhuǎn)化為白血病，預(yù)后較差，免疫表型強調(diào)CD34陽性，同時表達(dá)髓系/NK細(xì)胞標(biāo)志[18]。ANKL雖也常見于髓外浸潤，但免疫表型除表達(dá) CD56外，還常表達(dá)CD2、CD16，而CD34陰性，發(fā)病常與EB病毒感染有關(guān)，一般不表達(dá)髓系抗原。

本研究中1例cLPD-NK患者淋巴細(xì)胞異常增生，原始及幼稚淋巴細(xì)胞占6%，由于慢性NK細(xì)胞增多癥多數(shù)為含大顆粒的成熟淋巴細(xì)胞，免疫表型CD56+CD2+CD57+cCD3-CD16+CD4-CD8-，免疫組織化學(xué)檢查Ki-67結(jié)果為35%；結(jié)合該患者初診時伴發(fā)熱及淋巴結(jié)腫大的臨床表現(xiàn)，較其他cLPD-NK患者而言，疾病侵襲力較大，警示該患者應(yīng)密切隨訪，觀察病情是否進(jìn)展。目前國內(nèi)尚未見cLPD-NK高級別轉(zhuǎn)化的文獻(xiàn)報道，但在國外有患者轉(zhuǎn)化為ANKL的文獻(xiàn)報道[19]。BARCENA等[20]采用流式細(xì)胞術(shù)對60例患者外周CD56lowNK細(xì)胞進(jìn)行了大量標(biāo)記物評估，通過人雄激素受體測定建立克隆性，結(jié)果顯示，與正常NK細(xì)胞比較，克隆NK細(xì)胞顯示CD7、CD11b、CD38表達(dá)降低，CD2、CD94、人類白細(xì)胞抗原(HLA)-DR水平升高，同時CD158a、CD158b、CD161殺傷相關(guān)受體表達(dá)受限，得出了CD94hi/HLA-DR+表型圖譜可用于證明是NK細(xì)胞克隆性的結(jié)論。

綜上所述，本研究將成熟NK細(xì)胞腫瘤侵犯骨髓的臨床表現(xiàn)及實驗室特征進(jìn)行了歸納總結(jié)，證實其臨床特征和血象特點具有一定的診斷價值。而細(xì)胞形態(tài)學(xué)是發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞簡便、快捷的手段，對分型具有一定指導(dǎo)意義。但僅依靠形態(tài)學(xué)檢查也不能確診，對精準(zhǔn)診斷腫瘤類型流式細(xì)胞學(xué)的特異度及靈敏度均高于細(xì)胞形態(tài)學(xué)。而二者聯(lián)合應(yīng)用能提高診斷準(zhǔn)確性，特別是針對臨床表現(xiàn)較為惰性的cLPD-NK，聯(lián)合檢測才能做到早期精準(zhǔn)診斷。所以，NK細(xì)胞克隆性的有用標(biāo)記物的選擇對診斷該疾病尤為重要。當(dāng)然，需要進(jìn)行更多前瞻性臨床研究，檢測所有殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體亞型，并對NK細(xì)胞進(jìn)行二代基因測序，以更好地了解該疾病的發(fā)病機制，更好地進(jìn)行臨床靶向治療。