高麗麗，趙仁彬，王婭婕，李增政，撒亞蓮，楊同華△

昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院/云南省第一人民醫(yī)院/云南省血液疾病臨床醫(yī)學(xué)中心/云南省血液病醫(yī)院：1.血液科；2.臨床醫(yī)學(xué)中心,云南昆明 650032

細(xì)胞因子是由免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導(dǎo)多種細(xì)胞合成、分泌的一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白或多肽，可分為白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趨化因子和生長(zhǎng)因子等，其同機(jī)體的免疫細(xì)胞和免疫器官構(gòu)成人體復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,并作用于靶細(xì)胞后介導(dǎo)各種疾病的保護(hù)性或破壞性免疫應(yīng)答[1-2]。正常生理狀態(tài)下，人體內(nèi)細(xì)胞因子的水平是不可檢測(cè)或是非常低的。但在病理狀態(tài)下，細(xì)胞因子會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)。因此，對(duì)細(xì)胞因子的檢測(cè)有助于判斷機(jī)體的免疫功能，指導(dǎo)治療，評(píng)估患者的療效與預(yù)后。

雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是檢測(cè)細(xì)胞因子最經(jīng)典的一種方法，但由于所需標(biāo)本量較大，靈敏度低，穩(wěn)定性差，操作起來(lái)耗時(shí)耗力，效率低，缺乏多重性，一次只能檢測(cè)一種細(xì)胞因子，已不能滿足臨床所需。而流式微球分析法所需標(biāo)本量少，且一次檢測(cè)可快速實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)蛋白的定性和定量檢測(cè)，能反應(yīng)細(xì)胞因子之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，體現(xiàn)出免疫動(dòng)態(tài)演變關(guān)系。有研究顯示，流式微球分析法和ELISA的結(jié)果具有很好的一致性，且流式微球分析法具有更高的特異度和靈敏度，對(duì)于小體積標(biāo)本的適用性良好，可廣泛適用于臨床研究及實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行高通量細(xì)胞因子檢測(cè)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)中所用的3種試劑盒都是基于流式微球技術(shù)研發(fā)而成，不同的是各試劑盒的具體驗(yàn)操作步驟和檢測(cè)的細(xì)胞因子組合。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年12月在云南省第一人民醫(yī)院(下稱(chēng)本院)確診為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、噬血細(xì)胞綜合征(HPS)和多發(fā)性骨髓瘤(MM)的50例患者(病例組)分別作為ALL組、AML組、CML組、HPS組和MM組，每組10例。病例組男28例、女22例，年齡27～65歲。ALL、AML、CML、HPS和MM的診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)分別參照2016版《中國(guó)成人急性淋巴細(xì)胞白血病診斷與治療指南》[5]、2017版《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國(guó)診療指南》[6]、2016版《中國(guó)慢性髓性白血病診斷與治療指南》[7]、2018版《噬血細(xì)胞綜合征診治中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》[8]、2018版《多發(fā)性骨髓瘤診治指南解讀》[9]。另選取同期健康體檢者12例作為健康組，其中男5例、女7例，年齡25～60歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 NovoCyte 2060R流式細(xì)胞儀[艾森生物(杭州)有限公司]；A試劑(天津礦博同生生物技術(shù)有限公司)；B試劑(青島瑞思凱爾生物科技有限公司)；C試劑(江西諾德醫(yī)療器械有限公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及處理 采集各組受試者入院或體檢時(shí)外周血3～5 mL，注入真空分離膠促凝管，室溫自然凝固，離心5 min，取上層血清500 μL備用，標(biāo)本收集后于4～6 h內(nèi)檢測(cè)，如無(wú)法及時(shí)檢測(cè)，收集后立即-20 ℃保存，長(zhǎng)期保存l置于-80 ℃條件下，忌反復(fù)凍融。血清標(biāo)本的處理過(guò)程嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用3種不同試劑(A、B、C試劑)檢測(cè)健康組血清標(biāo)本6種細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)水平，并用篩選后試劑檢測(cè)6組血清標(biāo)本14種細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12P70、IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-17A、IL-17F、IL-22)水平。

1.3.2檢測(cè)數(shù)據(jù)獲取及分析 標(biāo)本上機(jī)前行流式細(xì)胞儀質(zhì)控檢測(cè)分析，檢查各參數(shù)的測(cè)試數(shù)據(jù)是否在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，以此確保儀器的穩(wěn)定可靠運(yùn)行；完成實(shí)驗(yàn)后收集數(shù)據(jù)，使用回歸系數(shù)來(lái)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)結(jié)果參照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出精確水平，輸出數(shù)據(jù)文件，A試劑和C試劑的數(shù)據(jù)分析軟件為BD FCAP Array v3.0.1，B試劑的數(shù)據(jù)分析軟件為其自帶的分析軟件。

2 結(jié) 果

2.1健康組6種細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果比較 采用A、B、C試劑分別檢測(cè)健康組6種細(xì)胞因子水平，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。A試劑的檢測(cè)值范圍寬，高、低值差異明顯，C試劑和 B試劑的檢測(cè)值低，且較集中。C試劑和A試劑對(duì)IL-6、IL-10、IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A試劑和B試劑對(duì)IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C試劑和B試劑對(duì)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 6種細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2健康組6種細(xì)胞因子的變異系數(shù)(CV) A、B、C試劑檢測(cè)結(jié)果的CV見(jiàn)表2，A試劑檢測(cè)結(jié)果的CV比較均一。

表1 A、B、C試劑分別對(duì)健康組6種細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果比較

表2 A、B、C試劑分別檢測(cè)6種細(xì)胞因子的CV

2.3A試劑檢測(cè)各組14種細(xì)胞因子水平 篩選的A試劑對(duì)各組14種細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果顯示，ALL組、AML組、CML組和MM組IL-8檢測(cè)結(jié)果明顯高于正常參考值，HPS組IL-10檢測(cè)結(jié)果明顯高于正常參考值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健康組血清標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果在A試劑正常參考值或正常參考值上限的3倍以?xún)?nèi)，病例組5組患者的檢測(cè)結(jié)果覆蓋范圍寬。篩選的A試劑能很好地區(qū)分健康組與病例組標(biāo)本。見(jiàn)表3。

表3 A試劑對(duì)各組14種細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果比較

組別nIL-1βIL-2IFN-γTNF-αTNF-βIL-17AIL-17FIL-22健康組121.91±0.153.32±1.052.29±0.631.94±0.592.26±0.631.26±0.113.60±1.102.14±0.53ALL組101.83±0.304.54±0.883.36±0.753.20±0.703.61±0.403.22±0.343.92±1.271.62±0.43AML組102.20±0.2318.40±6.073.56±1.064.19±1.073.47±1.144.25±1.114.63±1.032.65±0.83CML組102.68±0.265.56±1.583.55±1.033.55±1.133.99±1.122.59±0.712.24±0.542.04±0.65HPS組101.77±0.393.85±1.223.75±1.152.98±0.563.61±1.122.40±0.542.64±0.320.98±0.25MM組102.06±0.785.56±1.383.52±0.773.03±0.263.88±0.682.66±0.334.66±1.072.17±0.63

3 討 論

流式微球技術(shù)是一種僅需少量標(biāo)本即可快速完成多種可溶性蛋白成分的定性和定量檢測(cè)的分析技術(shù)，是集微球技術(shù)、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)等優(yōu)點(diǎn)于一身的液相蛋白檢測(cè)技術(shù)，具有高通量、高靈敏度、重復(fù)性好、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)[10]。流式微球技術(shù)的原理是將一系列帶有不同熒光強(qiáng)度、包被有捕獲抗體的不同大小的微球作為載體，特異性捕獲液相標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，再結(jié)合生物素檢測(cè)抗體，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，以流式細(xì)胞術(shù)作為檢測(cè)平臺(tái)，探測(cè)不同熒光信號(hào)的強(qiáng)度達(dá)到對(duì)待測(cè)標(biāo)本抗原定性和定量的目的[11]。

因各試劑盒中使用的微球、抗體及孵育時(shí)間不同，細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果有所差異[12]。不僅如此，標(biāo)本的留取及處理、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)、標(biāo)曲的擬合、儀器設(shè)備的條件及數(shù)據(jù)分析，每個(gè)步驟若操作不當(dāng)均可影響檢測(cè)結(jié)果。在標(biāo)本的留取及處理過(guò)程中需著重注意以下3點(diǎn)：(1)首先要確保標(biāo)本的合格，若標(biāo)本發(fā)生溶血，血細(xì)胞碎片、血紅蛋白等均會(huì)影響細(xì)胞因子與微球的結(jié)合。通過(guò)多次洗滌細(xì)胞及標(biāo)本上機(jī)前將流式細(xì)胞儀調(diào)至最佳狀態(tài)可以有效去除血清中的雜質(zhì)[13]。此外，細(xì)胞因子標(biāo)本的留取采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血獲取，并于收集后0 ℃立即離心，或暫存于4 ℃條件下4 h內(nèi)離心分離出血漿的標(biāo)本是最好的[14]。(2)標(biāo)本與微球結(jié)合的過(guò)程中若混勻的不夠充分，會(huì)造成微球成團(tuán)，導(dǎo)致細(xì)胞因子分群異常，影響結(jié)果的分析[13]。(3)當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)指標(biāo)的水平過(guò)低時(shí)會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)值不在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，以致沒(méi)有檢測(cè)結(jié)果。低靈敏度主要是由標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)計(jì)而引起的，通過(guò)增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的低水平標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)或重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線可以解決此問(wèn)題[13，15-16]。

本實(shí)驗(yàn)室中3種試劑的標(biāo)本處理及標(biāo)準(zhǔn)品的制備各有不同。標(biāo)本處理：C試劑和B試劑標(biāo)本孵育均在流式管中進(jìn)行，C試劑標(biāo)本孵育一步完成，B試劑標(biāo)本孵育分兩步完成，孵育過(guò)程中未持續(xù)振蕩混勻，單槍加樣，效率低，洗滌后需離心去上清，容易致微球損失。A試劑標(biāo)本孵育分三步完成，使用96孔濾膜板，排槍加樣，孵育過(guò)程中持續(xù)振蕩混勻，每完成一步都通過(guò)真空泵抽濾反復(fù)洗滌細(xì)胞，微球不易丟失，整個(gè)操作過(guò)程方便快捷，極大地降低了人力、物力和時(shí)間成本。標(biāo)準(zhǔn)品的制備：C試劑2倍倍比稀釋?zhuān)采w范圍較窄，較低濃度的細(xì)胞因子不易檢出；A試劑3倍倍比稀釋?zhuān)采w范圍更寬，低值更靈敏，同時(shí)兼顧中高值；B試劑4倍倍比稀釋?zhuān)缍冗^(guò)大，CV、重復(fù)性差。可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)不同可致每組檢測(cè)敏感區(qū)間有所差異。通過(guò)對(duì)比三者的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程及檢測(cè)結(jié)果，A試劑相對(duì)于C試劑和B試劑有更多的優(yōu)勢(shì)所在，更適用于臨床。在多項(xiàng)研究中，A試劑也體現(xiàn)了其可用性[17-19]。

總之，細(xì)胞因子的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于診斷和評(píng)估不同的疾病狀態(tài)至關(guān)重要。優(yōu)化細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒的設(shè)計(jì)和提高實(shí)驗(yàn)人員的操作水平，可提高細(xì)胞因子結(jié)果的準(zhǔn)確性，有利于指導(dǎo)臨床診療。