劉曙光 周 燦 隆雪明 楊彥寧 歐海軍 張 港 陳福華 賀宇文

（湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

玉米赤霉醇，又名“右環(huán)十四酮酚”，是玉米赤霉菌正常新陳代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物—玉米赤霉烯酮的還原產(chǎn)物，是雷索酸內(nèi)酯類非甾體類的同化激素。此外，ZAL 還是一種效果良好的皮埋增重劑，具有促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)的合成，提高飼料的轉(zhuǎn)化率和酮體瘦肉率的作用[1-3]，被冠以“畜大壯”之稱。實(shí)驗(yàn)研究表明ZAL在哺乳動(dòng)物中應(yīng)用具有一定的危害性[4]。1998 年歐盟就禁止了以ZAL 為代表的激素類藥物在畜禽生產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用。中國(guó)于2002 年發(fā)布農(nóng)業(yè)部第193 號(hào)公告明確規(guī)定禁止ZAL 用于所有食品動(dòng)物，且所有可食動(dòng)物源性食品產(chǎn)品中不得檢出。2010 年衛(wèi)生部明確將ZAL 列入動(dòng)物源性食品中禁止添加使用的藥品及其他化合物名單。ZAL 是主要的玉米赤霉烯酮的代謝產(chǎn)物，分別為α-ZAL、β-ZAL，且兩者之間可以相互進(jìn)行轉(zhuǎn)化[5]。李熠等[6]對(duì)ZAL 在體內(nèi)的代謝和毒代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，多達(dá)41 種α-ZAL的代謝產(chǎn)物及14 種隱蔽性α-ZAL 的代謝產(chǎn)物首次見諸報(bào)道，同時(shí)研究指出，α-ZAL 在體內(nèi)代謝中有效釋放出其毒性原型，增加機(jī)體暴露的總量且具有顯著的種屬代謝差異性。此外，該項(xiàng)研究揭示了α-ZAL 致癌性。因此，基于α-ZAL在體內(nèi)的快速代謝特性和其多種代謝產(chǎn)物總體展現(xiàn)出對(duì)動(dòng)物和人的毒性，及現(xiàn)行檢測(cè)方法對(duì)α-ZAL 不得檢出的硬性要求，對(duì)《QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肝中玉米赤霉醇》方法進(jìn)行不確定度評(píng)估是十分緊要的。

不確定度，作為一個(gè)新穎的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系術(shù)語(yǔ)，它的引入是為了從根本上改變隨機(jī)誤差或系統(tǒng)誤差的傳統(tǒng)分類，從大數(shù)據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)角度去測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量，相比于測(cè)量誤差等歷史統(tǒng)計(jì)值來(lái)修正測(cè)量結(jié)果[7-8]，主要用于表征合理賦予被測(cè)量的值的分散性。測(cè)量不確定度被認(rèn)為是闡明檢測(cè)結(jié)果是否優(yōu)良的關(guān)鍵性指標(biāo)[9-11]，也是國(guó)際上推薦的用于定量評(píng)估測(cè)量結(jié)果的有效手段[12]，可分析和評(píng)定影響測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的各個(gè)分量，充分掌握關(guān)鍵因素，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文根據(jù)JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》 和CNAS-GL006-2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》的要求，參照相關(guān)文獻(xiàn)[13-16]，采用QuEChERS- 液相串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)豬肝中α-ZAL、β-ZAL 的殘留進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，并對(duì)得到的不確定度結(jié)果進(jìn)行綜合分析和評(píng)估，以此來(lái)探究影響不確定度的主要因素，為該方法后續(xù)在實(shí)際檢測(cè)工作中的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，此外，還可為其它的類固醇類激素藥物的殘留檢測(cè)方法的不確定度測(cè)量提供一個(gè)理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：QTRAP 4500，美國(guó)SCIEX 公司；

超高效液相色譜儀：LC-30A，日本島津公司；

臺(tái)式高效冷凍離心機(jī)：X1R，德國(guó)Thermo公司；

電子天平：PL203，梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司；

固相萃取裝置：24TMDL，美國(guó)SUPELCO公司；

α- 玉米赤霉醇：100.4 μg/mL，天津阿爾塔β-玉米赤霉醇：100.4 μg/mL，天津阿爾塔乙腈：色譜純，美國(guó)默克；

QuEChERS 萃取鹽包：美國(guó)Agilent 公司；

Captiva EMR-Lipid：300 mg,3 mL，美 國(guó)Agilent 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別用吸量管吸取質(zhì)量濃度為100 μg/mL的2 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL 至100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，即得100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

分別吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng/mL） 于空白試樣中，余下操作同2.3.2 處理。即得濃度為1、2、5、10、20 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

稱取5.00 g 豬肝試樣置于50 mL 離心管中，加入3 mL 水和陶瓷均質(zhì)子，渦旋混勻1 min，加入10 mL 乙腈渦旋提取10 min，加入QuECh-ERS 萃取鹽包，混勻，低溫離心10 min，取上清液2.4 mL 至10 mL 離心管中，加入0.6 mL水混勻，過(guò)Captiva EMR-Lipid(300 mg, 3 mL)脂肪去除柱，擠干小柱，接收全部洗脫液，渦旋混勻，過(guò)0.2 μm Nylon 濾膜，濾液供高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 儀器條件

(1) 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C8（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相A 為2 mmol/L 乙酸銨0.05%乙酸水溶液，流動(dòng)相B 為甲醇，（梯度洗脫程序見表1）。流速為0.3 mL/min，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

表1 梯度洗脫程序

(2) 質(zhì)譜條件

離子源：電子噴霧離子源（ESI），掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4500 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)∶10 psi；霧化氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣(GS2)：50 psi；碰撞氣(CAD)：Medium；質(zhì)譜掃描參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4 殘留量計(jì)算公式

被測(cè)組分殘留量按以下公式計(jì)算：

式中：X—試樣中被測(cè)組分的含量，μg/kg；

C—試液中被測(cè)組分的濃度，μg/L；

V—萃取溶劑乙腈體積，mL；

f—試樣處理過(guò)程中的稀釋倍數(shù)（本方法為1.25）；

m—試樣的稱樣質(zhì)量，g。

2 不確定度分析與評(píng)定

2.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)檢測(cè)流程和殘留量計(jì)算模型分析，影響試樣中α-ZAL，β-ZAL 測(cè)定結(jié)果不確定度μrel(X)的主要因素有：

（1）待測(cè)液的濃度C 引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C)；

（2） 試樣稱量m 引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(m)；

（3）試樣前處理V 引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(V)；

（4）測(cè)量回收率引入的不確定度μrel(R)；

（5） 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(χ)。

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 待測(cè)液的濃度C 引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C)

分析整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可知不確定度主要來(lái)源為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線的擬合等過(guò)程。而標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制主要包括標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制、稀釋和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備等過(guò)程。

（1）儲(chǔ)備液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C1)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，α-ZAL 標(biāo)準(zhǔn)溶液純度為99.9%，不確定度為±5%，采用均勻分布處理，則因純度引入的不確定度為

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，β-ZAL 標(biāo)準(zhǔn)溶液純度為99.9%，不確定度為±5%，采用均勻分布處理，則因純度引入的不確定度為

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C2)

用分度吸量管吸取0.1 mL 標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液至100 mL 容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，即100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。根據(jù)常用玻璃量器規(guī)定，0.1 mL A 級(jí)分度吸量管、100 mL A級(jí)單標(biāo)容量瓶及溫度波動(dòng)引入的不確定度見表3。采用均勻分布，量具及溫度波動(dòng)引入的不確定度見表3。

如表3，標(biāo)準(zhǔn)中間液引入的不確定

表3 標(biāo)準(zhǔn)中間液配制引入的不確定度

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C3)

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制：分別用0.5 mL、1.00 mL、2.00 mL 吸量管（A 級(jí)）分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng/mL） 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL 于5 個(gè)空白試樣中，其余操作2.3.2 處理，即得1、2、5、10、20 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的不確定度

如上所示，ZAL 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的不確定度：

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C4)

本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)系列為5 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定2 次后以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比值殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，由公式

式中p 為對(duì)C0測(cè)定次數(shù)，p=5；n 為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)n=10；為5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度，樣品測(cè)定5 次后得到的平均濃度結(jié)果為C0（見表8），各相應(yīng)的數(shù)值及計(jì)算結(jié)果見表6。

表6 線性回歸方程擬合引入的不確定度

綜上所述，α-ZAL 待測(cè)液的濃度C 引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C)

同理可得，β-ZAL 待測(cè)液的濃度C 引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C)=0.04303

2.2.2 試樣稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(m)

試樣稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來(lái)源于分析天平的校準(zhǔn)和樣品稱取誤差。稱量采用千分之一天平，由天平檢定證書可得，天平的示值允差為±0.005 g，按均勻分布計(jì)算，千分之一天平相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μ(m1)==0.0028868；樣品稱量5 次，分別為5.012 g、4.988 g、5.006 g、4.994 g、5.000 g，平均稱重5.000 g，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.009482 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μ(m2)=所以，樣品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 試樣前處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(V)

提取過(guò)程需要加入10 mL 乙腈渦旋提取10 min，加入QuEChERS 萃取鹽包離心，混勻，低溫離心10 min，取上清液2.4 mL 至10 mL 離心管中，加入0.6 mL 水混勻，過(guò)Captiva EMR-Lipid (300 mg，3 mL)脂肪去除柱，擠干小柱，接收全部洗脫液。其不確定度見表7。

表7 提取過(guò)程引入相對(duì)合成不確定度μrel(V)

綜上所述，ZAL 提取過(guò)程引入相對(duì)合成不確定度：

2.2.4 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(χ)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品含量為10 μg/kg 的樣品進(jìn)行5 次重復(fù)測(cè)定，平均含量為()，標(biāo)準(zhǔn)偏差s(x)=標(biāo)準(zhǔn)不確定度為樣品重復(fù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(χ)=測(cè)得結(jié)果（見表8）。

表8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度μrel(χ)

2.2.5 添加回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(R)

對(duì)添加水平為10 μg/kg 的樣品進(jìn)行5 次平行重復(fù)(n=5)，α-ZAL 和β-ZAL 加標(biāo)回收率引入的相對(duì)不確定度結(jié)果見表9。

根據(jù)JJG 196-2006《測(cè)量不確定度評(píng)定和表示》需要校正系統(tǒng)誤差，因此進(jìn)行t 分布(公式：，μ 期望值，為平均回收率，n=5，s(R)回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差考察平均回收率是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若t 計(jì)t95=2.57，說(shuō)明顯著差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需用回收率校正因子校正測(cè)定結(jié)果X，否則不必校正。由表9 中可知豬肝中α-ZAL 和β-ZAL 的陽(yáng)性添加結(jié)果都不需校正。

表9 添加回收率引入的相對(duì)不確定度

2.2.6 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度及貢獻(xiàn)率

根據(jù)各分量評(píng)定的相對(duì)不確定度，合成豬肝中α-ZAL 和β-ZAL 測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，并評(píng)定各個(gè)分量對(duì)測(cè)定不確定的貢獻(xiàn)率，各影響因素的不確定結(jié)果見表10。合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(X)按下式計(jì)算：

表10 不確定度評(píng)定結(jié)果

2.2.7 擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

化合物擴(kuò)展不確定度U 根據(jù)如下公式計(jì)算：

在置信概率為95%，取擴(kuò)展因子k=2，豬肝中的α-ZAL 和β-ZAL 的擴(kuò)展不確定度及結(jié)果見表11。

表11 不確定度評(píng)估結(jié)果

根據(jù)各不確定度分量的評(píng)定結(jié)果，待測(cè)液濃度引入的不確定度分量最大，其次為添加回收。待測(cè)液濃度引入又分為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制和稀釋，標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等4 個(gè)過(guò)程帶來(lái)不確定度。其中，占比最大的是標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，其次為標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制，評(píng)價(jià)結(jié)果與王同珍等研究[17-18]基本一致，但又存在一些差異，這與采用前處理方法，選用儀器與器皿精密度及考慮因素的多少均相關(guān)。

為完善該方法的質(zhì)量控制體系，在檢測(cè)過(guò)程中可加強(qiáng)一下幾個(gè)環(huán)節(jié)的控制而減小不確定度的引入。第一，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制主要與量器誤差、量器使用頻次，以及實(shí)驗(yàn)人員的操作水平有關(guān)[19-20]。量具的選用，應(yīng)考慮其誤差的大小，合理利用，減少逐級(jí)稀釋過(guò)程；第二，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶入的不確定度較大，主要是曲線擬合時(shí)所選用的C0值的大小決定。在其他條件不變的情況下C0值越大，其曲線擬合的不確定度越小。因而檢測(cè)中應(yīng)根據(jù)待測(cè)樣品實(shí)際含量和儀器的檢測(cè)性能，選擇合適梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，可降低其不確定度。如有需要，可采取適當(dāng)濃度單點(diǎn)校正的方式進(jìn)行計(jì)算，亦可大大降低檢測(cè)過(guò)程中的不確定度；第三，方法添加回收是檢測(cè)過(guò)程中質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，可通過(guò)優(yōu)化前處理過(guò)程、規(guī)范試驗(yàn)操作等方法提高加標(biāo)回收率，減小其平行誤差，減小測(cè)量不確定度。

3 結(jié)論

本文基于內(nèi)部建立的QuECHERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肝中玉米赤霉醇含量的方法，分別從待測(cè)液濃度、樣品稱量、樣品前處理等方面，對(duì)不確定度進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示影響不確定度的主要因素是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和方法的添加回收。因此，針對(duì)待測(cè)濃度及操作過(guò)程中等對(duì)不確定度影響較大的因素，在檢測(cè)檢驗(yàn)應(yīng)用中，需要加強(qiáng)控制，以有助于進(jìn)一步提高測(cè)定結(jié)果的可信度。