王佩瑤,王燦,孫瑤琪,秦楊陽,黃猛,3*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,合肥 230022;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院,安徽 巢湖 238000;3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院東城院區(qū)/肥東縣人民醫(yī)院,合肥 231600)

近年來,隨著超聲新技術(shù)的發(fā)展、造影劑的完善,低頻超聲聯(lián)合微泡的應(yīng)用研究在臨床治療中引起了廣泛關(guān)注。 超聲微泡技術(shù)可為疾病提供一種無創(chuàng)、靶向、可逆的治療新方案:(1)可以使細(xì)胞膜產(chǎn)生瞬時(shí)孔,讓外來物質(zhì)通過孔進(jìn)入細(xì)胞[1],卻沒有在病理上造成靶器官的損傷,具有無創(chuàng)性;(2)不僅可以提高人體免疫反應(yīng)強(qiáng)度,而且可以提高免疫治療藥物傳遞的效率[2],實(shí)現(xiàn)局部區(qū)域的治療,具有靶向性;(3)可用于短暫和可逆的血腦屏障破壞,顯著促進(jìn)腦內(nèi)給藥[3],短暫開放組織屏障后依然能重新恢復(fù),具有可逆性。 基于這些優(yōu)于傳統(tǒng)治療方法的獨(dú)特優(yōu)勢,研究學(xué)者們將其應(yīng)用在動(dòng)物模型上,進(jìn)行了一系列的探索。 現(xiàn)對(duì)其應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 超聲微泡的制備

1.1 超聲儀器和使用試劑

超聲微泡 ( low-intensity ultrasoundwith microbubbles,USMB)是一種非侵入性、靶向性的治療方法[4], 通過在低頻超聲 ( low-intensity ultrasound,US)作用下讓通過外周循環(huán)靜脈注射的微泡(microbubbles,MB)發(fā)生一系列生物物理效應(yīng)。

US 是頻率低、功率小的超聲波,具有穿透力強(qiáng)、探測深度深、探測范圍廣的特點(diǎn)[5]。 MB 是由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或聚合物外殼及穩(wěn)定的氣體核心組成一種微米大小的球體[6]。 由于造影時(shí)間、穩(wěn)定性、安全性的需要,外殼主要應(yīng)用脂質(zhì)、聚合物[7]。 氣體核心多采用高分子量、低血液溶解度、低彌散度的氟化氣體[8]。

1.2 制備超聲微泡的技術(shù)參數(shù)設(shè)定

微泡、超聲實(shí)驗(yàn)參數(shù)的不同可能會(huì)導(dǎo)致不一樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 直徑約1 μm 的MB 與全氟碳芯和較長鏈的脂質(zhì)殼在4 MHz 的超諧波成像中表現(xiàn)最好[9]。 低機(jī)械指數(shù)(＜ 0.2)、低聲壓(＜ 0.15 MPa)超聲下微泡以穩(wěn)態(tài)空化為主,隨著機(jī)械指數(shù)、聲壓增高,微泡以穩(wěn)態(tài)空化和瞬態(tài)空化兩種方式并存,當(dāng)達(dá)到一定機(jī)械指數(shù)(＞ 0.3)、聲壓(＞ 0.2 Mpa)時(shí),微泡以瞬態(tài)空化為主[10]。 開放組織屏障的機(jī)械指數(shù)最低為0.3,而高達(dá)0.7 可以不引起明顯的出血或組織損傷[11]。

由于各項(xiàng)參數(shù)之間相互影響,以及不同實(shí)驗(yàn)條件下存在不同的最佳參數(shù),所以仍需對(duì)微泡和超聲的參數(shù)以及安全性、可行性進(jìn)行進(jìn)一步探索。

1.3 超聲微泡的制備

薄膜水化法和冷凍干燥法為國內(nèi)外制備MB 的常用方法,用超聲處理和機(jī)械振蕩作為形成氣泡所需的能量輸入方式,使含有殼膜材料的液體與氣體相混合[12]。 具體制備方法如下。

1.3.1 薄膜水化法-聲振法

稱取一定比例的殼膜材料、靶向修飾物溶解于氯仿(1 mL),得到的溶液蒸發(fā)形成薄膜,用水合液(1 mL)水合,真空干燥12 h,在55℃的培養(yǎng)箱中保持60 min 來得到脂質(zhì)體。 然后,將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到EP 管(1.5 mL),加入氟化氣體。 最后,在95 W 超聲下振8 s,獲得脂質(zhì)納米級(jí)氣泡,通過低速離心分離形成薄層。 在4℃下用PBS 處理脂質(zhì)納米級(jí)氣泡30 min,即獲得靶向納米級(jí)微泡超聲造影劑[13]。

1.3.2 冷凍干燥-機(jī)械振蕩法

稱取一定比例的殼膜材料、靶向修飾物、D-葡萄糖(低溫保護(hù)劑)混合在西林瓶(3 mL)中形成混懸液,冷凍干燥后加入溶媒液(由甘油、丙二醇及去離子水按一定的比例混合制備),加入氟化氣體。密閉后在機(jī)械振蕩儀上按設(shè)定的功率及時(shí)間進(jìn)行充分混懸,即制備得到脂質(zhì)微泡超聲造影劑初品,將初品高速離心后,棄上清,取乳白色液體層,移于新的西林瓶中,鈷60 輻照滅菌[14]。

冷凍干燥-機(jī)械振蕩法制備的MB 粒徑分布較均一、濃度高、用時(shí)短,薄膜水化-聲振法制備的MB更易負(fù)載脂溶性藥物、熒光染料[15]。 此外,機(jī)械振蕩法相較于聲振法在制備攜帶質(zhì)粒DNA 分子的MB 時(shí),可以避免對(duì)DNA 的損傷[16]。 這兩種方法各有其優(yōu)點(diǎn)和弊端,因此,在制備MB 時(shí)要根據(jù)具體要求再做選擇。

2 USMB 技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用

USMB 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面。

2.1 靶向輸送藥物

晚期癌癥一般手術(shù)效果不佳,只能通過藥物治療。 若是采用化療往往因缺乏靶向性而導(dǎo)致藥物分布于全身,一方面會(huì)因藥物蓄積不足而治療效果不佳,另一方面會(huì)導(dǎo)致全身毒副作用。 而低頻超聲可通過空化效應(yīng)讓細(xì)胞膜產(chǎn)生一過性空隙,通透性增加,使藥物進(jìn)入細(xì)胞[17]。

USMB 可以產(chǎn)生一種高效的藥物傳遞系統(tǒng)[18]。MB 可在超聲的輻射引導(dǎo)下,將藥物選擇性的釋放在靶器官部位,加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的吸收,從而在不減弱療效的同時(shí),減少用藥劑量、降低副作用[19]。Li 等[20]建立裸鼠肝細(xì)胞癌模型,將其隨機(jī)分為A組(NS)、B 組(5-FU 納米氣泡)、C 組(非低頻超聲納米氣泡)、D 組(5-FU 低頻超聲納米氣泡),通過超聲觀察治療前后裸鼠的腫瘤大小、繪制生存曲線、定量分析細(xì)胞凋亡指數(shù)、計(jì)算腫瘤微血管密度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)D 組腫瘤生長速度最慢、腫瘤抑制率和凋亡指數(shù)最高、腫瘤微血管密度降低,表明USMB 負(fù)載5-FU 可以進(jìn)一步提高藥物的靶向性,進(jìn)而抑制移植瘤的生長。

因此,USMB 治療可以介導(dǎo)藥物高效、靶向運(yùn)輸至病灶區(qū)域,增加特定區(qū)域的藥物濃度。

2.2 增強(qiáng)免疫治療

腫瘤細(xì)胞在生長過程中,常通過抑制免疫系統(tǒng)介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。 對(duì)于常規(guī)的手術(shù)、放化療,腫瘤容易復(fù)發(fā)、產(chǎn)生耐藥性和不良反應(yīng)。 而超聲微泡的空化效應(yīng)可以改變腫瘤微環(huán)境,增強(qiáng)免疫激活,抑制腫瘤生長[21]。

USMB 可以輸送免疫刺激物質(zhì),實(shí)現(xiàn)了抗腫瘤免疫反應(yīng)[22]。 張蔚等[23]將小鼠脫頸椎處死、骨髓腔沖洗和尼龍毛柱法得到其骨髓源性樹突狀細(xì)胞(DCs)、脾源性T 淋巴細(xì)胞,來與小鼠前列腺癌RM-1 細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),一方面實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組(DCs + T)、共同培養(yǎng)組(DCs + T + RM-1)、超聲微泡組(DCs + T + 實(shí)驗(yàn)前24 h 采用USMB 輻照后的RM-1),實(shí)驗(yàn)前后用流式細(xì)胞儀檢測表型對(duì)比發(fā)現(xiàn)共同培養(yǎng)組DCs 的分化受抑制、超聲微泡組T 淋巴細(xì)胞比例增加,說明體外小鼠前列腺癌微環(huán)境中DCs 和T 細(xì)胞的分化受抑制,而USMB 可以促進(jìn)免疫細(xì)胞(DCs 和T 細(xì)胞)的分化;另一方面實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組(RM-1)、超聲微泡組(實(shí)驗(yàn)前24 h 采用USMB 輻照后的RM-1)、免疫組(DCs + T + RM-1)、超聲微泡聯(lián)合免疫組(DCs + T + 實(shí)驗(yàn)前24 h 采用USMB 輻照后的RM-1),24 h 后運(yùn)用劃痕試驗(yàn)、CCK-8 試驗(yàn)、Transwell 試驗(yàn)分別檢測得出各組遷移、增殖、侵襲能力,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組能力最強(qiáng)、超聲微泡聯(lián)合免疫組能力最弱,表明USMB 可以協(xié)同抗腫瘤免疫反應(yīng)。

因此,USMB 治療可以通過激活免疫系統(tǒng)、遞送免疫調(diào)節(jié)物質(zhì),活化免疫系統(tǒng),抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2.3 介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染

基因治療具有高序列特異性、高選擇性等特點(diǎn),是生物研究的熱點(diǎn)。 若是采用放、化療,不僅毒副作用大,且療效也不明顯。 而超聲的慣性空化作用可使細(xì)胞膜形成暫時(shí)性小孔,促進(jìn)細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的攝取,來提高基因轉(zhuǎn)染效率[24]。

US 介導(dǎo)的基因傳遞可以在不引起機(jī)體免疫反應(yīng)和病毒載體突變的情況下,安全高效的進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。 它是通過將外源性DNA 或RNA 結(jié)合到MB外殼或包裹在內(nèi),再經(jīng)US 破壞,將其釋放到靶器官區(qū)域[25]。 程祖勝等[26]將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為7 組,正常組正常飼養(yǎng),其余各組給予肝纖維化誘導(dǎo),對(duì)照組(NS)、CTGF-siRNA 質(zhì)粒組(NS + 質(zhì)粒)、超聲聯(lián)合微泡組(USMB)、超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)基因組(不同濃度梯度的低、中、高劑量質(zhì)粒 + USMB),運(yùn)用超聲及病理切片HE 染色評(píng)價(jià)肝纖維化程度、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測肝組織中CT-GF、I 型和Ⅲ型膠原的mRNA 表達(dá)、Masson 染色觀察膠原纖維含量,顯示含質(zhì)粒的分組超聲及病理切片纖維化程度降低、超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)基因組CT-GF、I 型、Ⅲ型膠原的mRNA 表達(dá)以及膠原纖維含量明顯降低且隨著質(zhì)粒劑量增大而減少,因此,在USMB 作用下CTGF-siRNA 基因能特異地作用于靶位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,有效抑制肝纖維化進(jìn)程。

因此,USMB 治療可以有效提高非病毒性載體轉(zhuǎn)染率,通過載體將基因安全高效地傳遞到靶器官。

2.4 開放血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中BBB 使大部分治療性藥物難以進(jìn)入腦內(nèi)病灶部位,嚴(yán)重影響了臨床治療效果。若是采用藥物或外科手術(shù)只能部分緩解腦部疾病癥狀,且運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能也會(huì)受損。 而超聲微泡可以產(chǎn)生空化效應(yīng),打開內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接,隨著血腦屏障的開放,載藥微泡可靶向輸送至顱內(nèi)特定部位[27]。

USMB 可無創(chuàng)、局部、可逆地打開BBB,為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)和顱內(nèi)疾病提供了新策略[28]。 Wang等[29]建立大鼠阿爾茨海默病模型、制備載腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived nerve growth factor,BDNF) 逆轉(zhuǎn)錄病毒(pLXSN) 的微泡(MpLXSNBDNF)及載增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的微泡(MpLXSN-EGFP),隨機(jī)分為對(duì)照組(NS)、MpLXSN-EGFP + US 組(經(jīng)尾靜脈注射 MpLXSN-EGFP, US 輻照腦區(qū))、MpLXSN-BDNF + US 組(經(jīng)尾靜脈注射MpLXSNBDNF,US 輻照腦區(qū))、MB + pLXSN-BDNF + US 組(經(jīng)尾靜脈注射MB 和pLXSN-BDNF,US 輻照腦區(qū)),并在MRI 引導(dǎo)下用US 照射大鼠海馬,采用免疫組化和高效液相色譜分別測定腦組織中乙酰膽堿酯酶陽性細(xì)胞的數(shù)量和乙酰膽堿的含量、突觸棘IF 染色和Western Blot 檢測突觸密度恢復(fù),結(jié)果在MRI 圖像上可以觀察到BBB 破壞部位的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)、治療組腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶陽性細(xì)胞和乙酰膽堿含量明顯減少、MpLXSN-BDNF + US 組較其他治療組突觸損失恢復(fù)地更好,表明USMB 技術(shù)可以輻照開放大鼠海馬區(qū)。

因此,USMB 治療可以安全、高效地開放BBB,使藥物能在顱內(nèi)局部達(dá)到有效濃度。

2.5 損傷腫瘤血管

與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞需要血管提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣,而通過抑制新生血管可減少腫瘤細(xì)胞的增殖。 若是用化學(xué)方法去攻擊腫瘤血管的特異性靶點(diǎn),副作用大,療效也不理想。 而腫瘤組織新生血管的管壁薄弱,對(duì)微泡介導(dǎo)的超聲空化效應(yīng)尤為敏感[30]。

USMB 可誘導(dǎo)明顯的微血管損傷,導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡[31]。 Shen 等[32]構(gòu)建裸鼠皮下前列腺腫瘤模型,隨機(jī)分組為對(duì)照組(假治療)、US 組(US)、USMB 組(USMB),采用彩色多普勒血流成像、HE染色、免疫印跡和透射電鏡,發(fā)現(xiàn)USMB 組腫瘤壞死(腫瘤體積明顯減小、細(xì)胞核消失、胞漿空泡化增加、核周池?cái)U(kuò)張)、血管管腔閉塞、血流信號(hào)消失、COX-2 和血管內(nèi)皮生長因子的強(qiáng)度明顯降低,而在對(duì)照組和US 組腫瘤有完整的血管內(nèi)皮和血管腔,因此,得出USMB 可能導(dǎo)致裸鼠皮下腫瘤的血管閉塞和生長抑制作用。

因此,USMB 治療可以導(dǎo)致廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞死亡,從而導(dǎo)致腫瘤血管系統(tǒng)的機(jī)械性破壞。

2.6 輔助血栓消融

血栓脫落可能會(huì)導(dǎo)致急性腦梗死,最應(yīng)采取的措施是使阻塞的血管早期再通、及時(shí)恢復(fù)供血。 若是采用藥物只能治療超早期腦梗死,而且具有出血危險(xiǎn)性高及治療時(shí)間窗短等因素限制的影響。 而超聲波可以利用其機(jī)械效應(yīng),幫助溶栓藥物擴(kuò)散到血凝塊中,并機(jī)械地分解血凝塊,提高超聲溶栓的效果[33]。

USMB 不僅可以達(dá)到對(duì)靶向血管內(nèi)血栓的完全溶解,同時(shí)也能達(dá)到預(yù)防微循環(huán)的再栓塞作用[34]。王蕊等[35]制備大鼠下肢微動(dòng)脈血栓栓塞模型,隨機(jī)分為對(duì)照組(持續(xù)泵入MB)、治療組1(1000 周期低頻長脈沖治療超聲+持續(xù)泵入MB)、治療組2(5000周期低頻長脈沖治療超聲+持續(xù)泵入MB),并同時(shí)進(jìn)行連續(xù)成像超聲觀察、重復(fù)再灌注微血栓懸液,留取栓塞前、栓塞后、治療1 min、治療10 min 下肢再灌注成像圖像,描繪視頻強(qiáng)度-時(shí)間曲線,對(duì)比栓塞前后下肢微血管血流容積,結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組的溶栓效果顯著高于對(duì)照組,得出低頻長脈沖治療超聲聯(lián)合MB 對(duì)大鼠下肢微動(dòng)脈血栓栓塞有良好的治療效果。

因此,USMB 治療可以通過超聲聚焦于血栓部位,加用溶栓劑輔助血栓消融實(shí)現(xiàn)超聲溶栓。

3 問題與展望

眾多的研究均表明,利用USMB 治療能無創(chuàng)、靶向、可逆地靶向輸送藥物、增強(qiáng)免疫治療、介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染、開放血腦屏障、損傷腫瘤血管、輔助血栓消融,為疾病的治療提供新途徑、新思路。 雖然目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面已有不少研究表明USMB 技術(shù)的應(yīng)用廣泛,但是實(shí)際應(yīng)用于臨床卻仍需完善諸多問題:(1)明確不同生物物理效應(yīng)相對(duì)應(yīng)的具體作用原理,提高臨床治療效率;(2)恰當(dāng)利用超聲的熱效應(yīng),減少不必要損傷;(3)提升微泡制備技術(shù),兼顧考慮載體半衰期和穿透效率;(4)加強(qiáng)微泡穩(wěn)定性,延長在靶器官區(qū)域停留時(shí)間;(5)探究不同疾病的最佳超聲參數(shù),做到有針對(duì)性地治療。

針對(duì)USMB 技術(shù)的應(yīng)用研究,無論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面,還是實(shí)際臨床方面,超聲新技術(shù)的發(fā)展、造影劑的完善都面臨著諸多挑戰(zhàn)。 這不僅需要臨床供給指引,還需要多學(xué)科合作。 盡管存在許多問題,但已取得的研究成果充分顯示了USMB 技術(shù)潛在優(yōu)勢,隨著對(duì)其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面應(yīng)用的深入研究,USMB 將廣泛應(yīng)用于臨床,對(duì)臨床治療作出巨大貢獻(xiàn)。

參 考 文 獻(xiàn)(References)

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