李靜,張利英*,雍文興,張苡銘,李洋洋,周谷城,牛帆,李高勤

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730000;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,蘭州 730000)

慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease,COPD)作為慢性疾病的發(fā)病率及死亡率的主要原因之一,預(yù)測(cè)到2030 年將成為全球第三大死亡原因[1]。 COPD 具有患病率高、死亡率高、致殘率高、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重等特點(diǎn)[2],已經(jīng)給人類(lèi)健康帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。 因此,通過(guò)建立成功的COPD動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制、治療具有重要的意義。

目前,COPD 嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型應(yīng)用較多,因?yàn)槠渚哂蟹敝吵杀镜?、繁殖周期短、基因組與人類(lèi)相似等優(yōu)點(diǎn),其建模的方法主要分為單一因素造模和復(fù)合因素模型。 單一因素誘導(dǎo)主要有煙草暴露,空氣污染物暴露,氣道內(nèi)滴注酶類(lèi)、細(xì)菌等造成COPD 模型,此類(lèi)模型耗時(shí)長(zhǎng),且無(wú)法符合氣道重塑、血管重塑、持續(xù)氣流受限等復(fù)雜的COPD 病理特點(diǎn)。 因此,為了構(gòu)建有效的動(dòng)物模型,復(fù)合因素造模越來(lái)越得到更多關(guān)注,其不僅縮短了模型時(shí)間,而且多因素可造成多種病理結(jié)果的COPD 模型,應(yīng)用更加廣泛。本文綜述了復(fù)合因素造模常用幾種方法的特點(diǎn),為研究COPD 各種機(jī)制提供依據(jù)。

1 煙草煙霧聯(lián)合造模方法

吸煙是COPD 的重要誘因,研究顯示煙草煙霧(cigarette smoke,CS)中含有尼古丁、焦油、一氧化碳等4000 多種有害物質(zhì),已知可能有60 多種參與COPD 的發(fā)生[3],因此常用CS 暴露構(gòu)建COPD 模型。 該方法已運(yùn)用于各類(lèi)動(dòng)物COPD 的模型中,如小鼠、大鼠、豚鼠、犬類(lèi)等,一般至少需要暴露2 個(gè)月才會(huì)出現(xiàn)氣道炎癥反應(yīng)等早期COPD 的病理表現(xiàn),6個(gè)月則出現(xiàn)穩(wěn)定期COPD 模型[4]。 雖然單一CS 暴露是目前較為理想的COPD 模型制備方法,且較為簡(jiǎn)便,但由于短時(shí)間內(nèi)很難引起明顯的肺泡腔擴(kuò)大、小氣道重塑及肺功能下降等明顯COPD 的特征[5],以及不同實(shí)驗(yàn)中煙霧濃度、煙熏時(shí)間不同,暫缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)CS 暴露方案[6]。 因此目前更多是利用CS 聯(lián)合其他因素造模,其造成的病理特征更加符合臨床COPD 的復(fù)雜性,在所有復(fù)合模型中應(yīng)用最為廣泛。

1.1 CS 聯(lián)合脂多糖

CS 是氧化劑自由基和不同化合物的混合物,會(huì)導(dǎo)致肺部氧化應(yīng)激,脂多糖(lipopolysac charide,LPS)是革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素,可引起肺損傷[7]。CS 聯(lián)合LPS 誘導(dǎo)模擬了COPD 的病因,不僅可形成典型特征的COPD 模型,而且有效縮短了造模時(shí)間,更加符合COPD 病理生理特點(diǎn),因此國(guó)內(nèi)外廣泛用于COPD 的模型制備。 選擇的鼠型主要以雄性C57BL/6J 小鼠及SPF 級(jí)Wistar 大鼠為主,目前最多的造模方案為第1 天、第15 天氣道滴注LPS 0.2 mL(1 mL/mg),滴注日不吸煙,2 ～ 14 d、16 ～ 28 d將大鼠置于煙熏箱內(nèi)被動(dòng)吸煙,每次持續(xù)30 min、每天2 次,共計(jì)28 d[8-9]。 觀察到肺組織及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng),其中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加,炎性細(xì)胞顯著募集[10],氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯增強(qiáng),如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、 丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)等顯著增高,以及各種炎癥因子如IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β 等明顯升高[11]。相較其他模型來(lái)看,CS 聯(lián)合LPS 模型炎性反應(yīng)明顯增強(qiáng),小氣道狹窄、肺泡壁增厚較單純CS 模型更加嚴(yán)重,因此CS 聯(lián)合LPS 更加適合炎性機(jī)制及氣道重塑的研究[12]。

1.2 CS 聯(lián)合大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)

長(zhǎng)期暴露于空氣污染也是COPD 的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素,最近有研究表明,PM2.5 暴露在動(dòng)物模型中可引發(fā)免疫紊亂,促進(jìn)肺部炎癥,加劇氣道重塑[13]。 目前,予以吸入含有PM2.5 顆粒的氣體或氣管內(nèi)滴注PM2.5 混懸液兩種方法構(gòu)建COPD 大鼠模型,因其制備工藝繁雜,故通過(guò)此類(lèi)方法建立模型的研究較少[14]。 Wang 等[15]將雄性C57BL/6小鼠同時(shí)暴露于超聲霧化器釋放的PM2.5(110 μg/m3)及被動(dòng)吸煙裝置中,每次10 支,每天2 次,每周5 d,連續(xù)10 月,觀察結(jié)果顯示,CS + PM2.5 較CS 組、PM2.5 組的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯增加、氣管上皮細(xì)胞顯著增生以及IL-6、IL-8 炎癥因子均增高。Chu 等[16]首先將小鼠全部暴露于煙霧裝置中,每次45 min,每天4 次,持續(xù)90 d,結(jié)束后將小鼠轉(zhuǎn)移到PM2.5(770 μg/m3)的容器中,每次30 min,每天4次,持續(xù)90 d,造模完后顯示CS + PM2.5 組的肺功能包括吸氣峰流量(PIF)、呼氣峰流量(PEF)以及巨噬細(xì)胞、IL-6、IL-8、TNF-α 均較CS 組明顯增加。此類(lèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷r(shí)間均在6 個(gè)月以上,建模時(shí)間較長(zhǎng),但可形成持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng),在證明COPD的小鼠更容易受到空氣污染同時(shí),對(duì)COPD 穩(wěn)定期研究、小氣道重塑也具有重要意義。

1.3 CS 聯(lián)合細(xì)菌

感染是COPD 急性加重常見(jiàn)原因,主要以細(xì)菌感染為主,常見(jiàn)的細(xì)菌有銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌等[17]。 細(xì)菌感染易致動(dòng)物死亡,故對(duì)鼠的選擇要求較高,通常選用SD 大鼠為模型動(dòng)物[18],選擇的方法是細(xì)菌混懸液經(jīng)氣管滴注或鼻腔滴注,且需要反復(fù)染菌才可造成COPD 模型。 細(xì)菌感染很少單獨(dú)構(gòu)建COPD 模型,通常都是聯(lián)合CS 或另一種細(xì)菌造成復(fù)合模型。陳慶蕓等[19]采用CS 聯(lián)合肺炎鏈球菌造模方法,分別在1、14、28 d 經(jīng)鼻滴注肺炎鏈球菌混懸液后觀察大鼠的血氧顯著降低,同時(shí)CO2含量升高,氣道阻力增加,聯(lián)合模型較單純的CS 模型程度更重,其表現(xiàn)也臨床患者相似。 Herr 等[20]利用CS 聯(lián)合不同濃度的流感嗜血桿菌( nontypeable haemophilus influenzae,NTHi)在不同時(shí)間內(nèi)造成COPD 模型的比較中發(fā)現(xiàn),CS 組2 周、3 個(gè)月、6 個(gè)月的炎癥細(xì)胞數(shù)量并未出現(xiàn)太大變化,NTHi 組在2 周和3 個(gè)月時(shí)BALF 中出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞和中心粒細(xì)胞,而這種現(xiàn)象在聯(lián)合組中更為明顯;更有趣的是,CS 暴露6個(gè)月后反而抑制了IL-17A 的表達(dá),但聯(lián)合組出現(xiàn)了明顯的升高,因此認(rèn)為細(xì)菌刺激IL-17A 是必要的,而IL-17A 可導(dǎo)致氣道產(chǎn)生大量黏液,其他研究表明CS 聯(lián)合細(xì)菌使巨噬細(xì)胞、杯狀細(xì)胞化生,黏液分明泌顯增多,近年來(lái)研究證實(shí)黏液分泌增多是COPD的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制[21]。 CS 和細(xì)菌成分的共同應(yīng)用導(dǎo)致了COPD 的發(fā)展特征,包括可引起氣道炎癥,但很少造成肺氣腫及氣道重塑[22]。 有研究數(shù)據(jù)表明,微生物暴露的程度可能決定了COPD 模型的炎癥表型[23],并且COPD 發(fā)生機(jī)制與細(xì)菌及其產(chǎn)物有密切相關(guān),因此CS 聯(lián)合細(xì)菌更適用于COPD 的細(xì)菌炎癥機(jī)制及黏液分泌失衡的研究。

2 LPS 聯(lián)合造模方法

LPS 是革蘭陰性桿菌的細(xì)胞壁成分,可存在于空氣污染和有機(jī)粉塵中[24]。 有研究表明,單獨(dú)氣管內(nèi)滴注LPS 可誘導(dǎo)肺部炎癥[25],然而,LPS 不是慢阻肺的主要病因,反復(fù)滴注模擬反復(fù)感染導(dǎo)致炎癥爆發(fā),只能觀察到COPD 部分病理改變[26]。 為了復(fù)制人類(lèi)COPD 的病理生理,利用LPS 復(fù)合因素構(gòu)建模型的研究也越來(lái)越多,主要是聯(lián)合煙熏法或彈性蛋白酶。 彈性蛋白酶是一種可溶性蛋白水解酶,由肺中活化的中性粒細(xì)胞釋放,通過(guò)募集炎癥因子、降解肺組織彈性蛋白及纖維蛋白、促進(jìn)氣道粘液分泌等參與了大多數(shù)肺部疾病的發(fā)生[27]。 彈性蛋白酶主要造成以蛋白酶-抗蛋白酶失衡的特征模型,此模型可產(chǎn)生嚴(yán)重的肺氣腫[28],但彈性蛋白酶在COPD 肺氣腫中的作用依賴(lài)于多種病理生理機(jī)制,這為COPD 的機(jī)制研究帶來(lái)了干擾。 Ishii 等[29]第1天經(jīng)鼻滴注0.5 U 豬胰彈性蛋白酶(porcine pancreatic elastase,PPE),隨后在第7、10、14 天分別經(jīng)鼻給予25 mg LPS,觀察到在PPE 基礎(chǔ)上聯(lián)合LPS 可加劇肺氣腫,肺組織中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及相關(guān)炎癥介質(zhì)明顯增加,造成一個(gè)肺氣腫急性加重模型。 De Oliveira 等[30]通過(guò)每周4 次氣管內(nèi)滴注PPE,每次0.2 U,連續(xù)滴注4 周,第5 周向氣管內(nèi)滴注LPS 0.2 mg,與PPE、LPS 組相比,PPE +LPS 組表現(xiàn)出更嚴(yán)重的肺泡壁破壞、肺泡過(guò)度膨脹、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及間質(zhì)水腫,中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),IL-1β、IL-6、TNF-α 和VEGF 水平升高等,此研究還檢測(cè)相關(guān)肺外指標(biāo),聯(lián)合組射血分?jǐn)?shù)更低、膈肌功能顯著降低、橫膈膜結(jié)構(gòu)紊亂、心室壁增厚等,成功建立肺氣腫惡化模型。 研究表明多次使用PPE 滴注可形成與人類(lèi)肺氣腫相識(shí)的肺外效應(yīng)[31],而LPS 聯(lián)合PPE 使肺部炎癥兩次激活,炎癥因子釋放造成嚴(yán)重的肺氣腫急性加重模型,雖然此模型與人類(lèi)COPD 發(fā)病機(jī)制不同,但對(duì)于肺氣腫相關(guān)機(jī)制研究依然具有重要意義。

3 其他因素復(fù)合造模方法

除上述應(yīng)用較多的復(fù)合模型外,利用機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣(motor vehicle exhaust,MVE) 聯(lián) 合LPS 建 立COPD 模型[32],CS 聯(lián)合接種H3N1 病毒成功建立AECOPD 模型[33],張?zhí)鹛鸬萚34]運(yùn)用銅綠假單胞菌及肺炎鏈球菌建立放大炎癥的AECOPD 模型,除此之外還有氯化鈣 + 山黎豆類(lèi)制、煙熏 + 間歇低氧等方法來(lái)構(gòu)建COPD 模型。 總之,復(fù)合因素多構(gòu)成急性加重期特征為主的COPD 模型,但不同的因素又有不同的模型特點(diǎn),所以需要我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇更加貼近的模型。

4 COPD 模型評(píng)估

4.1 一般情況

COPD 是一種全身性疾病,在造模過(guò)程中可以觀察鼠的皮毛光澤度、精神狀況、活動(dòng)情況、飲食水量、體質(zhì)量,以及呼吸狀況有無(wú)咳嗽、噴嚏、呼吸急促、呼吸道有物分泌物從口鼻流出、有無(wú)氣道痰鳴音等。 一般情況作為初步的評(píng)價(jià)指標(biāo),也可為后續(xù)是否繼續(xù)造模提供依據(jù)。

4.2 肺功能及血?dú)夥治鰷y(cè)定

肺功能的測(cè)定在COPD 中具有重要意義,FEV1/FVC(1 秒率)更是臨床診斷COPD 的金標(biāo)準(zhǔn)。 COPD 模型中肺總量、殘氣量增大,肺活量(FVC)及最大呼氣量(PEF)均有所降低[35]。 吸氣峰流量(PIF)、呼氣峰流量(PEF)測(cè)定表示氣道阻塞程度,除此之外動(dòng)態(tài)肺彈性在肺氣腫中明顯增加,其表示肺泡最大程度的過(guò)度膨脹和纖維化程度[31],靜態(tài)順應(yīng)性測(cè)定等也在評(píng)估COPD 中廣泛應(yīng)用。 Sun 等[36]通過(guò)測(cè)量FEV25/FVC、FEV50/FVC、FEV75/FVC 等氣流速率參數(shù),提示氣流受限情況。血?dú)庀嚓P(guān)指標(biāo)如動(dòng)脈氧分壓(PaO2)、血氧飽和度(SaO2)、動(dòng)脈二氧化碳分壓(PaCO2)的水平提示缺氧程度。 肺功能測(cè)定對(duì)有無(wú)持續(xù)氣流受限有重要意義,且操作方便,可重復(fù)性良好。

4.3 病理改變

從整體觀察COPD 肺體積增大、腫脹、顏色變淺和彈性下降等[37]。 鏡下觀察穩(wěn)定期肺組織彈性減退,肺泡持續(xù)擴(kuò)大,肺泡數(shù)量顯著減少,小血管管壁增厚,也可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道上皮細(xì)胞增生。在急性加重期可觀察到肺上皮細(xì)胞出現(xiàn)變形、壞死,細(xì)胞間質(zhì)有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主的炎性浸潤(rùn),支氣管黏膜上皮脫落,黏液腺增生、肥大,管腔可見(jiàn)大量黏液,氣管上皮柱狀細(xì)胞增生,肺泡管、肺泡囊明顯擴(kuò)大,有時(shí)可見(jiàn)肺泡壁變薄破裂形成肺大泡[38]。 病理檢查可直觀觀察到氣管和肺組織的病理特征,評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度,是評(píng)價(jià)模型是否成功的最直接有力的證據(jù)。

4.4 炎癥指標(biāo)

炎癥反應(yīng)作為COPD 發(fā)生的重要機(jī)制,在評(píng)價(jià)模型中具有重要地位。 通常在血清、肺泡灌洗液、肺組織中檢測(cè)炎性細(xì)胞及炎癥因子水平,炎性細(xì)胞常見(jiàn)有白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、TH17 細(xì)胞數(shù)量等,炎癥介質(zhì)有IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α、TGF-β 等,其測(cè)定為COPD 炎性浸潤(rùn)和嚴(yán)重程度提供依據(jù)。

4.5 影像學(xué)改變

目前對(duì)于臨床診斷COPD 來(lái)講,除了肺功能測(cè)定,影像學(xué)資料可直接觀察COPD 的肺部病變進(jìn)程。X 光片檢查、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography,CT)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)作為常用檢查手段,在COPD 模型中可觀察到支氣管管壁增厚、肺紋理增粗、肺氣腫、肺纖維化等,嚴(yán)重模型可觀察到肺大泡等影像學(xué)改變[39],通過(guò)胸部微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)可觀察肺的形態(tài)學(xué)變化,判斷肺氣腫的定量改變。 除此之外,近年來(lái)小動(dòng)物正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission tomography,PET)-計(jì)算機(jī)體層掃描(computed tomography,CT)技術(shù)的發(fā)展,同樣為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的活體觀察創(chuàng)造了條件[40]。 影像學(xué)檢查具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、無(wú)創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn),目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛。

4.6 其他指標(biāo)

除上述評(píng)估方法之外,免疫組織化學(xué)法作為病理診斷的重要手段,通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色,以確定肺組織細(xì)胞內(nèi)的抗原,并對(duì)其進(jìn)行定位、定性及半定量的研究[41],其相較HE 染色更為優(yōu)化、精確,同時(shí)可評(píng)估中心粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞等細(xì)胞水平,對(duì)COPD 的病理機(jī)制研究至關(guān)重要。 蛋白免疫印跡(Western Blot)通過(guò)檢測(cè)COPD 肺組織及肺泡灌洗液中相關(guān)機(jī)制蛋白,來(lái)確認(rèn)模型是否成功。 此外小動(dòng)物活體體內(nèi)光學(xué)成像(opticalinvivoimaging,OI)技術(shù)采用生物發(fā)光和熒光兩種方式,可以直接在動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)炎癥發(fā)生、特定基因表達(dá)等多種細(xì)胞基因行為,期待在未來(lái)COPD 研究廣泛應(yīng)用。 除此之外,肺力學(xué)測(cè)量、形態(tài)計(jì)量指標(biāo)、肺的血流動(dòng)力學(xué)變化等都是評(píng)估COPD及全身疾病的指標(biāo)。

5 結(jié)語(yǔ)

COPD 是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性疾病,其病因、發(fā)病機(jī)制、病理變化復(fù)雜多樣,且其病情進(jìn)展緩慢呈進(jìn)行性,因此目前尚未有根治COPD 的方法。缺少完全符合人類(lèi)COPD 特征的動(dòng)物模型便是一個(gè)限制因素,單一因素造模方法目前研究較多,但由于其耗時(shí)長(zhǎng),病理特征不明顯,很難符合臨床COPD的特征。 目前多采用復(fù)合因素造模,不同因素造成其病理特征的側(cè)重點(diǎn)不同,對(duì)深入機(jī)制的研究有重要作用。 動(dòng)物與人類(lèi)的生理病理尚有差異,想要建立接近人類(lèi)COPD 特點(diǎn)的模型,評(píng)估方法必不可少,在評(píng)估模型時(shí),需注意結(jié)合功能學(xué)、病理學(xué)、影像學(xué)及炎癥細(xì)胞等多種方法,以保證模型成功的準(zhǔn)確性。 盡管復(fù)合模型已經(jīng)從多方面靠近COPD 病理特點(diǎn),但COPD 包括多種的病理變化,如肺氣腫、小氣道重塑、血管重塑、支氣管炎等,要想完全再現(xiàn)COPD 的功能變化仍然是個(gè)未解的問(wèn)題。 盡管復(fù)合因素模型應(yīng)用廣泛,模型良好,但其研究的模型動(dòng)物、耗時(shí)長(zhǎng)短、藥物劑量、誘導(dǎo)方式等依然沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。 期待未來(lái)有更多實(shí)驗(yàn)著重于慢阻肺動(dòng)物模型的研究,為解決COPD 的發(fā)病機(jī)制、尋找有效靶點(diǎn)藥物等作出貢獻(xiàn)。

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