尹娜,陳秋燕,王瑞芳,齊景偉,王園

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心,呼和浩特010018)

植物多糖(plant polysaccharides,PP)是由相同或者不同的單糖通過α-或者β-糖苷鍵組成的聚合度10 以上的化合物[1]。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,科學(xué)界逐漸認(rèn)識(shí)到,多糖與蛋白質(zhì)、核酸并列為3 大生物大分子,在植物體的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[2]。 同時(shí),因其具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖、抗腫瘤等生物功能[3-6],被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料、保健品和化妝品行業(yè)。 我國中草藥資源豐富,越來越多來源于中草藥的植物多糖被應(yīng)用于食品行業(yè),但仍存在如何快捷有效鑒別其生物活性并評價(jià)安全性的問題。

國際上公認(rèn)的植物多糖生物活性評價(jià)方法有體內(nèi)、外兩種。 體外試驗(yàn)可以更經(jīng)濟(jì)且更快的得到結(jié)論,但在不能確定植物多糖體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的規(guī)律時(shí),進(jìn)行以模式動(dòng)物開展的體內(nèi)試驗(yàn)是非常有必要。 斑馬魚具有遺傳同源性高、繁殖力強(qiáng)、發(fā)育快及透明易觀察等特點(diǎn),繼大鼠和小鼠之后,被美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)列為第三大模式動(dòng)物,已在藥物研發(fā)、藥理毒理學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。 近年來,植物多糖的研發(fā)和應(yīng)用已成為食品領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn),模式生物斑馬魚在植物多糖生物活性評價(jià)方面得到了一定程度的應(yīng)用。 因此,本文綜述了斑馬魚模型在植物多糖生物活性評價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 斑馬魚在植物多糖生物活性評價(jià)中的優(yōu)勢

斑馬魚作為一種脊椎動(dòng)物模型,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、藥物開發(fā)、安全藥理學(xué)、毒理學(xué)及人類疾病模型的構(gòu)建等研究領(lǐng)域[7]。 與其他哺乳類模式動(dòng)物相比,斑馬魚具有以下獨(dú)特的生物學(xué)特性:在實(shí)驗(yàn)室條件下斑馬魚可以實(shí)現(xiàn)全年產(chǎn)卵,雌性斑馬魚每周可產(chǎn)數(shù)百枚卵,具有很強(qiáng)的繁殖能力;斑馬魚胚胎發(fā)育極快,在受精后13 hpf(hours post tertilization, hpf)頭部形成,24 hpf 尾部形成,在36 hpf時(shí)出現(xiàn)所有器官的前體,并且3 個(gè)月后成魚就可以達(dá)到生殖成熟期[8];斑馬魚與人類的遺傳同源性高達(dá)87%[9],并且具有遺傳可操作與再生能力[10],這使得斑馬魚成為近年來研究脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育及造血分化的動(dòng)物模型[11];斑馬魚胚胎及幼魚透明便于觀察;給藥方式多樣,最常見的方法是將化合物直接添加到培養(yǎng)斑馬魚胚胎、幼蟲或成魚的培養(yǎng)基或水中[12];此外,還可以將不溶性物質(zhì)納入飼料中,以制備直徑為5 mm 的顆粒飼喂斑馬魚[13];口服灌胃和注射可用于輸送精確劑量的溶液(圖1)[14-15]。

2 斑馬魚及其胚胎在植物多糖功能測定中的應(yīng)用

在過去的20 年里,斑馬魚因其生物學(xué)優(yōu)勢,逐漸成為生物和生物醫(yī)學(xué)研究的最佳模式動(dòng)物之一。雖然斑馬魚最初是作為發(fā)育遺傳學(xué)的模型而被開發(fā),但是它的用途已迅速擴(kuò)展到植物多糖的多種生物活性研究中。

2.1 抗氧化活性

斑馬魚作為被廣泛應(yīng)用的抗氧化模型,通常采用偶氮二異丁脒鹽酸鹽(2, 2’-Azobis (2-methylpropionamidine )dihydrchloride, AAPH )、H2O2、百草枯、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等處理誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激,并產(chǎn)生包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)和NO-在內(nèi)的自由基。 ROS 是斑馬魚體內(nèi)代謝的產(chǎn)物,可以被特異性的染料檢測,加上斑馬魚胚胎透明的特點(diǎn)使得檢測結(jié)果更加明顯,用斑馬魚體內(nèi)ROS 檢測模型檢測ROS 水平具有可靠、快速、高效、經(jīng)濟(jì)和高通量等優(yōu)點(diǎn)[16]。 植物多糖作為天然存在的有效成分,常被用作食品添加劑。 多糖分子上存在的還原性半醛羥基,可以與超氧陰離子自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng),去除脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的多余ROS。 如圖2 所示,用2’,7’-二 氯 熒 光 黃 雙 乙 酸 ( 2 ’, 7 ’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)預(yù)處理斑馬魚幼魚在熒光顯微鏡下為綠色,熒光強(qiáng)度弱說明斑馬魚體內(nèi)ROS 產(chǎn)生少。 Wang 等[17]利用柑橘果渣制備其水提物,并研究了其體內(nèi)抗氧化活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),柑橘果渣水提物可顯著提高AAPH 誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎存活率并緩解心率,降低斑馬魚胚胎的ROS和細(xì)胞死亡水平。 同樣,Kang 等[18]研究發(fā)現(xiàn),與AAPH 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型組相比,蘆薈多糖的預(yù)暴露可顯著降低斑馬魚胚胎的ROS 水平和細(xì)胞死亡率,且呈劑量依賴性。 Jayawardena 等[19]利用分離純化后的巖藻多糖(F10)對LPS 處理的斑馬魚模型進(jìn)行研究,結(jié)果表明F10 有效降低了LPS 誘導(dǎo)產(chǎn)生的斑馬魚胚胎中的NO-、ROS 和細(xì)胞死亡水平且呈現(xiàn)劑量依賴性,同時(shí)斑馬魚胚胎中的炎性介質(zhì)一氧化氮合酶、誘生型環(huán)氧化酶均被下調(diào)。 對于高離子輻射引起的斑馬魚氧化應(yīng)激而言,植物多糖同樣具有緩解作用。 Lee 等[20]研究發(fā)現(xiàn)鐵釘菜多糖對γ射線誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激的影響,研究顯示鐵釘菜多糖可以增加斑馬魚存活率,減少卵黃囊水腫及尾巴彎曲等畸形,同時(shí)也減少了斑馬魚細(xì)胞死亡率、ROS 和NO-產(chǎn)生率。

2.2 免疫調(diào)節(jié)活性

研究發(fā)現(xiàn),斑馬魚盡管沒有淋巴結(jié)但是卻有豐富的淋巴和發(fā)達(dá)的胸導(dǎo)管,并且斑馬魚與哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)有著極大的相似性[21],同樣具有天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)。 在出生后2 周內(nèi)建立和發(fā)育完全透明的斑馬魚胚胎,以及可用免疫細(xì)胞熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的發(fā)展,使得跟蹤斑馬魚胚胎這一種完整生物體的免疫反應(yīng)成為可能[22]。 據(jù)報(bào)道,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是免疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要媒介,通過激活巨噬細(xì)胞,刺激細(xì)胞因子的分泌來誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)[23]。先前研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)來自植物、動(dòng)物和真菌的多糖可與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合,刺激TNF-α 的分泌[24-26]。 Zhang 等[27]利用斑馬魚證實(shí)了從芒果中分離出的GMP90-1 按50、100、200 μg/mL 給藥24 h 后發(fā)現(xiàn)TNF-α 的水平以劑量依賴的方式明顯增 加, 分 別 比 對 照 組 高 出 5.6%、 41.7% 和200.1%,其他關(guān)于免疫功能基因白介素-6 和白介素-1β 的水平也成劑量依賴性增加。 Udayangani等[28]將從燕麥中提取的納米級β-葡聚糖可以上調(diào)斑馬魚幼魚的TNF-α、白介素-1、β-防御素、溶菌酶、白介素-10 及白介素-12 等,發(fā)現(xiàn)其可能具有觸發(fā)先天性免疫的能力。 同時(shí)還有其他研究證實(shí)從大冬青葉[29]、金銀花和山竹中分離出來的多糖同樣也具有提高免疫調(diào)節(jié)的能力[30-31]。

總之,斑馬魚在為評價(jià)植物多糖的免疫能力和免疫活性物質(zhì)的相關(guān)應(yīng)用中提供了理想的模型,不僅可以確定植物多糖的適宜濃度,還可以確定添加的形式,因此斑馬魚在驗(yàn)證植物多糖免疫方面具有很廣闊的開發(fā)前景。

2.3 心臟保護(hù)

斑馬魚的心臟是兩腔的,但與人類有共通的基本特性,其心率、收縮力學(xué)與動(dòng)作電位等與人類在生理方面表現(xiàn)出相同的特征[32-34]。 斑馬魚的心臟由心房、心室、動(dòng)脈球及靜脈竇組成,位于魚體頭段與胸腹段交界處最后一對鰓絲的后下方。 在5 hpf時(shí),心臟祖細(xì)胞出現(xiàn),于16 ～ 22 hpf 分化為心室和心房的心肌細(xì)胞[35];24 hpf 跳動(dòng)的線性心臟血管發(fā)育形成;48 hpf 心肌細(xì)胞重新排列,心臟的發(fā)育基本完成,心臟通過舒張期實(shí)現(xiàn)泵血功能[36]。 同時(shí)斑馬魚在早期的發(fā)育階段并不依賴心臟循環(huán)生存。 因此,心臟的發(fā)育紊亂不會(huì)立即造成胚胎死亡。 再加上斑馬魚全身透明的特點(diǎn)可以看到心臟,使得斑馬魚成為一個(gè)具有吸引力的心臟模型(圖3)。

特非那定,是一種從抗精神病藥物的篩選中發(fā)現(xiàn)用于治療過敏性疾病,和可選擇性阻斷Hl 受體而產(chǎn)生抗組胺作用的藥物,常被用來誘導(dǎo)斑馬魚的心臟損傷[37]。 研究發(fā)現(xiàn)許多植物提取物均可以緩解由特非那定所引起的斑馬魚心臟損傷。 斑馬魚的心率是評價(jià)心功能的指標(biāo)之一,記錄每分鐘的心跳次數(shù)可用來評價(jià)植物多糖對心臟毒性的影響。 例如段文娟等[38]研究了不同相對分子質(zhì)量的瓜萎多糖使特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚心率上升、解緩了斑馬魚的心率異?；钚?其中100 μg/mL 總樣、1 μg/mL石油醚萃取物和10 μg/mL 石油醚萃取物具有顯著的保護(hù)作用,乙酸乙酯萃取物和水層樣品在100 μg/mL 質(zhì)量濃度下表現(xiàn)出一定的改善心臟毒性作用。 鄭秀花等[39]則探究了瓜蔞不同部位的多糖對于特非那定引起的血流的節(jié)間血管數(shù)量和心率下降具有緩解作用,且結(jié)果表明60%醇沉的瓜萎多糖對心臟的保護(hù)作用最好。 何俊霖等[40]利用斑馬魚模型研究發(fā)現(xiàn)中低劑量異甘草素具有良好的抗血管生成和減慢心率的作用,高劑量則會(huì)隨著作用時(shí)間的延長起到抑制發(fā)育的作用。 靜脈竇(SV)是血液進(jìn)入心房的部位,動(dòng)脈球(BA)是血液流出心室的部位。 斑馬魚SV-BA 的距離可反應(yīng)心臟環(huán)化程度,心房和心室的位置發(fā)生改變,SV-BA 距離相應(yīng)變化。 通過在顯微鏡下測量SV-BA 間距可判斷植物多糖對斑馬魚心臟的影響[41]。 陳秋燕等[42]研究證明添加不同濃度提純后的麩皮多糖能夠使受損傷后的斑馬魚心臟SV-BA 間距縮小,同時(shí)在最優(yōu)濃度時(shí)斑馬魚的心臟損傷修復(fù)率可達(dá)82.19%(斑馬魚心臟損傷修復(fù)率:心臟損傷修復(fù)率(%)= (給藥治療組斑馬魚心臟SV-BA 間距-特非那定組斑馬魚心臟SV-BA 間距)/ (正常對照組斑馬魚SV-BA 間距-模型組斑馬魚SV-BA 間距)× 100%)。 此外原花青素和西洋參等的多糖提取物同樣具有心臟保護(hù)作用[43-44]。 可見,以斑馬魚為模型探討植物多糖對心臟的保護(hù)是切實(shí)可行的,同時(shí)也為各類植物中藥的研發(fā)帶來了新思路。

2.4 脂質(zhì)代謝

斑馬魚的脂質(zhì)分布及代謝與人類的非常相似,并且斑馬魚體內(nèi)主要的載脂蛋白人類的載脂蛋白具有很高的同源性。 迄今為止,關(guān)于高脂血癥模型的大多數(shù)研究都集中在哺乳動(dòng)物上,包括高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥的小鼠、大鼠、兔和倉鼠模型。 但是,這些模型通常耗時(shí)且昂貴[45-46]。 用細(xì)胞模型進(jìn)行藥物篩選也是可行的,但是由于細(xì)胞模型缺乏器官結(jié)構(gòu),難以分析各組織器官中的脂質(zhì)代謝情況。對比而言斑馬魚可以全程觀察并研究其發(fā)育狀況,方便分析飲食中的脂類分子在體內(nèi)代謝的情況,為在斑馬魚幼蟲中大規(guī)模篩選影響脂類代謝的小分子化合物提供了基礎(chǔ)。 例如,Wei 等[47]利用固態(tài)發(fā)酵杏鮑菇產(chǎn)生的多糖(PESF)能夠顯著減少斑馬魚幼體高脂血癥模型中的脂滴數(shù)量。 在濃度為200、400 和600 μg/mL 時(shí),PESF 將脂質(zhì)含量分別降低到(62% ± 20%)、(33% ± 9%)和(67% ± 15%),結(jié)果表明,PESF 在斑馬魚幼體高脂血癥模型中具有抑制脂質(zhì)積累的生物活性。 同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)從菊苣中提取的多糖可以通過降低總膽固醇和甘油三酸酯的含量減少肝脂肪的變性,進(jìn)而對高膽固醇誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚起到降脂作用,還可以減少脂質(zhì)合成相關(guān)基因脂肪酸合成酶基因和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白1,并增加脂質(zhì)氧化相關(guān)基因的表達(dá)[48]。

除此之外,高膽固醇斑馬魚模型已運(yùn)用于抗動(dòng)脈粥樣硬化植物化學(xué)物質(zhì)的篩選和機(jī)理研究中。例如,姜黃和月桂樹的水提物已顯示出可以減輕體重,并能夠降低以高脂肪日糧(HCD)喂養(yǎng)的斑馬魚的總膽固醇和甘油三酯水平[49]。 該小組隨后使用相同的HCD 斑馬魚模型研究出1,8-桉樹腦(姜黃和月桂葉粉的親水提取物的主要成分)可以通過提高抗氧化活性和增強(qiáng)的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮抗炎和降脂作用[50]。 此外,使用高膽固醇斑馬魚模型還揭示了肉桂和丁香的水提物以及葡萄皮[51],枇杷葉和巴西莓的水提取物的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性[52]。

2.5 腸道蠕動(dòng)

斑馬魚沒有典型結(jié)構(gòu)的胃,但消化管胃段在功能上與人類的胃高度同源。 在細(xì)胞學(xué)和解剖學(xué)角度,斑馬魚的腸道結(jié)構(gòu)與人類的相似,均由上皮細(xì)胞、結(jié)締組織、環(huán)狀肌及外縱肌組成[53],并且在功能上也與人類高度同源。 在72 hpf 時(shí)斑馬魚胚胎發(fā)育成幼魚,在攝食的情況下,首次出現(xiàn)不穩(wěn)定的腸道自發(fā)性收縮。 當(dāng)斑馬魚幼魚發(fā)育至120 ～ 144 hpf時(shí),其腸道出現(xiàn)自發(fā)性的蠕動(dòng),這時(shí)便可以通過觀察植物多糖對斑馬魚腸道蠕動(dòng)次數(shù)的影響來評價(jià)植物多糖對斑馬魚腸道功能的作用。

尼羅紅(9-二乙基氨基-5 H-苯并[α]吩惡嗪-5-酮)是一種無毒,可用于標(biāo)記活體細(xì)胞培養(yǎng)中的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中脂滴的熒光染料[54]。 當(dāng)用尼羅紅溶液處理斑馬魚卵時(shí),可與含有豐富脂肪的卵黃囊結(jié)合。 當(dāng)斑馬魚成長到5 ～ 6 d 時(shí),大部分的卵黃囊被吸收,斑馬魚開始依靠自發(fā)的腸蠕動(dòng)進(jìn)食,在熒光顯微鏡下可以清晰的觀察到斑馬魚腸道中尼羅紅分布,同時(shí)尼羅紅不會(huì)被其他組織所吸收[55](圖4)。 當(dāng)斑馬魚腸道的熒光強(qiáng)度減弱時(shí),說明給予的食品或藥物有助于腸蠕動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn),添加濃度為125、250、500、1000 和2000 μg/mL 益身清(多種植物提取物的產(chǎn)物)時(shí)斑馬魚腸道內(nèi)容物的熒光強(qiáng)度顯著低于對照組,且促進(jìn)腸蠕動(dòng)的作用也從0%隨著濃度的增加分別上升到25%、45%、49%、62%、66%[56]。 楊勝杰等[57]認(rèn)為管花肉蓯蓉提取物可以明顯促進(jìn)斑馬魚腸道蠕動(dòng),且呈劑量依賴性,并且在濃度2000 μg/mL,促進(jìn)率可達(dá)23.26%,達(dá)到潤腸通便的能力。 低聚果糖是一類重要的功能性低聚糖,廣泛存在于菊苣、菊芋、大蒜、洋蔥及小麥等植物中[58]。 侯海榮等[59]在研究過程中得出了隨著低聚果糖溶液濃度在125 ～ 500 mg/mL 濃度范圍內(nèi)增加時(shí),斑馬魚的腸道蠕動(dòng)次數(shù)也逐漸增加,并且在500 mg/mL的低聚果糖溶液處理24 h 后,斑馬魚的腸道收縮強(qiáng)度與蠕動(dòng)也更加明顯。 由上可知斑馬魚的腸道蠕動(dòng)模型可以為之后植物多糖提取物在藥品中的添加提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 結(jié)語

當(dāng)前,關(guān)于植物多糖的生物活性研究主要集中于體外試驗(yàn),缺乏體內(nèi)試驗(yàn)研究。 因此本文著重介紹了植物多糖評價(jià)中的斑馬魚模型,總結(jié)和討論將斑馬魚作為一種工具,為快速、經(jīng)濟(jì)的篩選和評估對人類健康有潛在益處的植物多糖提供了一種可靠且易用的策略。 同時(shí)為了使斑馬魚對人類健康更具指導(dǎo)意義,應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行特定的基因敲除、過度表達(dá)或引入目標(biāo)基因來探索斑馬魚與人類之間的機(jī)制關(guān)系,以及了解植物多糖對斑馬魚的調(diào)節(jié)機(jī)制,使植物多糖在未來的開發(fā)中發(fā)揮出精準(zhǔn)作用。此外應(yīng)多關(guān)注植物多糖在斑馬魚的添加形式及時(shí)間,研究植物多糖在斑馬魚中的生物利用度和生物可及性。 總的來說,斑馬魚模型是評價(jià)植物多糖的有效工具,可以在功能食品、營養(yǎng)品和化妝品的開發(fā)中發(fā)揮重要作用。

參 考 文 獻(xiàn)(References)

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