李春峰， 趙子璇， 劉桂艷

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院分子醫(yī)學(xué)與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

薔薇科山楂屬植物在全世界現(xiàn)有一千多個(gè)物種，主要分布于北半球的溫帶地域，中國(guó)是山楂重要的發(fā)源地之一，現(xiàn)有山楂品種20個(gè)，變種7個(gè)，變型1個(gè)[1]。2020年版《中國(guó)藥典》收載的山楂和山楂葉，均為山楂屬的2個(gè)種山里紅CralaeguspinnatifidaBge.Var.majorN.E.Br.和山楂CralaeguspinnatifidaBeg.的植物來(lái)源[2]。山楂主要分布于在華北區(qū)的河北、山西、內(nèi)蒙古，西北區(qū)的陜西、青海、新疆，東北三省以及華東和華中的部分省的半山地域[1]。作為山楂道地藥材產(chǎn)地的河北省興隆縣被林業(yè)部命名為“中國(guó)山楂之鄉(xiāng)”，山楂種植面積和產(chǎn)量居全國(guó)之首[3]。

山楂早在《本草經(jīng)集注》中就有記載，其性微、溫，味酸、甘，歸胃、脾、肝經(jīng)，具有消食健胃、化濁降脂、行氣散瘀、收斂止痢等功效[4]，臨床上主要用于治療食欲不振、高血脂和高血壓等疾病[5]。山楂葉在東晉《肘后方》中有記載，莖葉煮汁洗漆瘡，后兩代本草均有記載。黃酮類(lèi)和三萜類(lèi)化合物是山楂的活性成分，此外山楂中還含有苯丙素類(lèi)、甾體類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、有機(jī)胺類(lèi)和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等[5-6]。現(xiàn)代藥理研究表明，山楂果、葉和種子的提取物具有調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心力衰竭、降血壓、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[6]。本文對(duì)山楂中的黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)成分的提取分離及檢測(cè)分析方法進(jìn)行綜述，以期為山楂資源的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 黃酮類(lèi)化合物

山楂中黃酮類(lèi)化合物有6類(lèi)，包括黃酮類(lèi)(如牡荊素、葒草素等)、黃酮醇類(lèi)(如槲皮素、金絲桃苷、蘆丁等)、二氫黃酮類(lèi)(如柚皮素、北美圣草素及其苷等)、二氫黃酮醇類(lèi)(如花旗松素及其苷等)、黃烷3-醇類(lèi)(如兒茶素、白矢車(chē)菊等)、前花青素類(lèi)(即黃烷聚合物類(lèi)，如原花青素A2和原花青素B2等)[7]。山楂黃酮具有抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗心肌缺血、抗慢性心力衰竭等作用[6]，在藥物研究和保健品開(kāi)發(fā)方面極具潛力。提取分離山楂黃酮類(lèi)成分為研究和開(kāi)發(fā)其藥品和保健品提供有效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.1 提取方法

1.1.1 傳統(tǒng)提取方法 傳統(tǒng)的提取方法中既有不加熱的浸漬法、滲濾法，也有通過(guò)加熱提高提取率的煎煮法、回流法、連續(xù)回流法(也稱索氏提取法)等[8]。煎煮法相對(duì)于其他傳統(tǒng)提取方法雖然經(jīng)濟(jì)、安全、簡(jiǎn)便，但不適于提取不易溶于水或水煎煮易破壞的成分。單味藥山楂用煎煮法提取也有報(bào)道，張黎明等[9]用水煎煮法提取山楂葉總黃酮，折算提取總黃酮含量占藥材的2.19%。浸漬法和滲濾法用水或不同比例的有機(jī)溶劑(主要是乙醇)作溶劑，不加熱或低溫加熱，適于遇熱不穩(wěn)定成分的提取，缺點(diǎn)耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑多、易變質(zhì)。從提取效率上看滲濾法高于浸漬法[10-12]?；亓鞣ㄓ捎谔崛∪軇┐蠖酁橛袡C(jī)溶劑，且溫度比煎煮法低，是研究最多也是目前制藥企業(yè)常用的方法。張明[12]對(duì)比浸漬法、回流法、滲漉法提取山楂總黃酮效果，結(jié)果顯示，使用70%乙醇提取時(shí)，總黃酮提取率回流法高于滲漉法和浸漬法；使用50%乙醇提取時(shí)，滲漉法總黃酮提取率高于回流法和浸漬法，且回流法液料比最小。連續(xù)回流提取法溶劑用量少，但是規(guī)模小，不適于工業(yè)化生產(chǎn)，是實(shí)驗(yàn)室常用的提取方法之一。需要注意的是，連續(xù)回流長(zhǎng)時(shí)間高溫加熱會(huì)破壞成分，不適于提取高溫不穩(wěn)定的成分。

1.1.2 新型提取方法 近年來(lái)，提取方法中既有通過(guò)改變儀器設(shè)備而改變提取方式的，如超臨界流體萃取、超聲波輔助提取、微波輔助提取[8]、超高壓提取、快速溶劑提取、閃式提取等，也有通過(guò)添加化學(xué)成分增加提取率的提取方法，如添加表面活性劑、添加酶液等。超聲波輔助提取對(duì)于山楂果、葉和核的研究均有報(bào)道，但是優(yōu)化后的工藝差別較大，提取率差別也很大，山楂果總黃酮提取率在6.21%～11.31%之間[13-14]。超聲聯(lián)合回流提取山楂核總黃酮，提取率(1.65%)是單獨(dú)回流提取的1.32倍[15]。超臨界流體萃取法具有選擇性，對(duì)于熱不穩(wěn)定和弱極性成分具有很好的分離效果。如果用CO2作介質(zhì)提取極性較大的成分需添加夾帶劑如乙醇、丙酮等。胡凱等[16]和劉慶文[17]分別采用極性亞臨界流體1,1,1,2-四氟乙烷(R134a)和超聲聯(lián)合CO2超臨界流體法萃取山楂果中的原花青素，提取率分別為2.50%、13.20%。微波法因具有加熱迅速、膜破壞完全、能量損失少等特點(diǎn)在山楂中也有研究報(bào)道。李敏等[18]和Luo等[19]分別對(duì)山楂果和山楂葉采用微波法和微波輔助酸水解法提取其中的黃酮類(lèi)成分，提取率、得率分別為13.42%、2.62 mg/g。閃式提取法相對(duì)于其他提取方法最突出特點(diǎn)是提取時(shí)間短、速度快，但是存在規(guī)模小等缺點(diǎn)。楊燕新等[20]通過(guò)閃式提取法提取山楂核中的黃酮類(lèi)成分，總黃酮提取率為0.64%。超高壓提取技術(shù)因其提取時(shí)間短、溶劑消耗少、低溫節(jié)能和效率高等特點(diǎn)受到人們的關(guān)注。孫協(xié)軍等[21]和周志強(qiáng)等[22]通過(guò)超高壓法分別對(duì)山楂果和山楂葉中黃酮類(lèi)成分進(jìn)行提取，山楂果中3個(gè)黃酮類(lèi)化合物(槲皮素、蘆丁和金絲桃苷)的總提取率和山楂葉中總黃酮的提取率分別為0.055%、7.068%。駱曉沛等[23]優(yōu)化超高壓提取、索氏提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取的工藝，結(jié)果顯示，山楂果中總黃酮提取率分別在最優(yōu)工藝參數(shù)條件下依次為5.44%、5.12%、4.66%、3.76%。相對(duì)于其他3種方法，超高壓提取法保留了浸漬法的優(yōu)點(diǎn)，具有溫度低、提取雜質(zhì)少、提取率高、成本較低等特點(diǎn)?？焖偃軇┨崛》m然提取速率快、時(shí)間短，但是降解熱是需要關(guān)注的問(wèn)題。曹會(huì)凱[24]通過(guò)對(duì)快速溶劑提取法、超臨界萃取法和微波法提取山楂果中黃酮類(lèi)成分工藝的考察得出，3種方法的提取率依次為4.99%、3.80%、3.64%，結(jié)果顯示，快速溶劑提取法相比于其他2種方法具有提取率高、時(shí)間短和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適于工業(yè)化生產(chǎn)。生物酶法與傳統(tǒng)的提取技術(shù)相比，可以避免高溫條件下對(duì)活性物質(zhì)的破壞，對(duì)提取物質(zhì)起到保護(hù)作用。高文秀等[25]對(duì)不同酶解協(xié)同超聲波輔助提取山楂果中總黃酮的工藝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶解協(xié)同超聲提取的總黃酮提取率(8.48%)比單獨(dú)超聲法和單獨(dú)用酶解法的提取率分別提高了29.5%、13.2%。表面活性劑提取法也是一種有效的提取方法。Han等[26]發(fā)現(xiàn)用添加表面活性劑的超聲提取法提取山楂中牡荊素等黃酮類(lèi)化合物可以獲得較高的提取率。潘芳芳等[27]考察表面活性劑提取法和熱回流法提取山楂果中黃酮類(lèi)成分的工藝，表面活性劑輔助法提取總黃酮的提取率(4.55%)相比傳統(tǒng)的乙醇回流法的提取率(3.78%)增加了16.97%，該方法一方面保留了熱回流提取法的優(yōu)點(diǎn)，另一方面表面活性劑的使用增加了提取速率，在相同的提取條件下該方法可以提高提取率，節(jié)約時(shí)間和資源，但是對(duì)于不同提取物的表面活性劑的選取還需要有一定的經(jīng)驗(yàn)。

1.2 分離方法

1.2.1 常用分離方法 在山楂黃酮類(lèi)化合物的常用分離純化方法中有因溶解度不同而實(shí)現(xiàn)分離的沉淀法和萃取法；也有因填料不同的大孔吸附樹(shù)脂、聚酰胺、硅膠、葡聚糖凝膠等常壓柱色譜法(也叫柱層析法)以及硅膠中壓和C18高壓制備液相色譜法等[8]。色譜法在山楂的分離純化中使用較多，可根據(jù)化合物的極性大小、是否含有羰基和羥基、分子大小和帶電荷的不同從而選擇不同的填充劑進(jìn)行分離[8]。大孔吸附樹(shù)脂是氫鍵或范德華引力吸附和分子篩共同作用[8]，而且連續(xù)使用性能穩(wěn)定，不需要經(jīng)常再生，已廣泛用于制藥企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)中，是分離純化山楂總黃酮或原花青素類(lèi)成分使用最多的色譜分離方法。趙立輝[28]使用柱層析法考察4種大孔吸附樹(shù)脂(AB-8、FL-1、FL-2、FL-3)和聚酰胺對(duì)山楂果中黃酮類(lèi)化合物的純化性能，結(jié)果表明，AB-8、FL-3樹(shù)脂純化后樣品純度分別為86.6%、85.0%，加樣回收率分別為85.0%、80.0%，具有較好的純化效果。張黎明等[9]和宋小鋒等[29]都使用D101大孔吸附樹(shù)脂分離純化山楂葉提取液中的總黃酮，純度均在82%以上。劉麗南等[10]使用HPD826 氫鍵型樹(shù)脂純化，制備的提取物中10種原花青素成分總含量占干重的42%。祝波等[30]使用D101大孔吸附樹(shù)脂分離純化山楂果提取液中的原花青素，原花青素B2的純度從7.42%提高到34.39%。聚酰胺吸附量相對(duì)較大，分離效果好，但其洗脫速度較慢，且不能多次重復(fù)使用。張偉等[31]對(duì)復(fù)方山楂提取物中總黃酮的分離純化工藝進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)使用聚酰胺樹(shù)脂分離純化后的總黃酮純度可達(dá)到80.1%，純化物中總黃酮保留率高達(dá)93.0%。葡聚糖凝膠主要依靠分子篩作用，適用于初步分離后進(jìn)一步純化黃酮類(lèi)化合物的過(guò)程。馬娟娟[32]對(duì)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱分離純化山楂葉粗黃酮粉末的方法進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，40%乙醇洗脫得到3個(gè)組分，組分1～2合并總黃酮純度以及組分3的總黃酮純度分別為83.27%、94.27%。上述常壓色譜分離法具有易操作，不需要昂貴設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，常被用于化合物的組分分離，但是常壓色譜分離時(shí)間較長(zhǎng)，分離單一化合物效果不理想。在分離純化單一化合物時(shí)，常采用中壓、高壓制備液相色譜或薄層制備色譜等幾種技術(shù)聯(lián)合使用。李晶等[33]聯(lián)合應(yīng)用硅膠層析、葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)常壓柱色譜和反相制備高壓液相色譜(RP-Pre-HPLC)從山楂果實(shí)中分離出1個(gè)新化合物。

1.2.2 新型分離方法 相比于傳統(tǒng)的分離方法，近年發(fā)展起來(lái)的新型分離純化方法如高速逆流色譜、膜分離[8]和分子印跡等方法因具有操作時(shí)間短、制備量大、純度高等特點(diǎn)而受到人們的關(guān)注。高速逆流色譜法和膜分離技術(shù)都具有分離效率高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，前者在分離時(shí)樣品負(fù)載能力強(qiáng)、制備量大、重現(xiàn)性好，而后者在分離時(shí)不損害物質(zhì)活性、分離效率高、能耗低、無(wú)污染并且可連續(xù)生產(chǎn)。分子印跡法因具有預(yù)定性、專一識(shí)別性、高度的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的使用壽命而受到人們關(guān)注。劉妧晨等[34]采用索氏提取聯(lián)用分子印跡分離技術(shù)研究山楂中槲皮素的提取和分離同步進(jìn)行的方法，結(jié)果顯示，槲皮素的提取率(0.033 mg/g)是常規(guī)索氏提取效率的15倍，但分子印跡萃取法因過(guò)程較復(fù)雜、外加成分多、成本高等原因還未能推廣使用。對(duì)于難分離的物質(zhì)例如同分異構(gòu)體需要幾種方法聯(lián)合使用以得到理想的分離效果，例如聯(lián)合應(yīng)用高速逆流色譜法(HSCCC)與制備液相分離法分離山楂黃酮類(lèi)成分，分離出的黃酮化合物(兒茶素、牡荊素等7個(gè))的純度超過(guò)98%[35]。

1.3 檢測(cè)分析方法

1.3.1 常用檢測(cè)分析方法 化學(xué)成分的檢測(cè)分析主要包括定性和定量2個(gè)方面。薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)或高效氣相色譜(HPGC)是最常用的定性和定量檢測(cè)方法。對(duì)混合物中已知化合物進(jìn)行定性時(shí)需要對(duì)照品比對(duì)，TLC和HPLC或HPGC因其具有靈敏度高、精確度高、操作簡(jiǎn)便和適用范圍廣等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)成分的定性檢測(cè)分析中。對(duì)于分離純化得到的單一未知化合物確定結(jié)構(gòu)常用的方法是1H和13C的一維或二維的核磁共振波譜(1H-NMR、13C-NMR)、不同質(zhì)核比的質(zhì)譜(MS)、伸縮或彎曲振動(dòng)的紅外光譜(IR)和電子躍遷的紫外(UV)光譜等聯(lián)合應(yīng)用確定化合物結(jié)構(gòu)。李晶等[33]從山楂葉中提取分離純化得到1個(gè)化合物，采用HR-ESI-MS、IR和1H-NMR、13C-NMR的一維和二維譜等多種檢測(cè)方法，確定化合物的結(jié)構(gòu)式，為新化合物，命名為2′-羥基-7-(3-羥丙基)-6-甲氧基-黃酮。TLC和HPLC或HPGC也是常用的定量檢測(cè)法，測(cè)定混合物中某些化合物的含量需要用某些化合物作為對(duì)照品，并以對(duì)照品的不同濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以測(cè)定混合物中化合物的含量。TLC法具有操作簡(jiǎn)單，分析速度快，樣品用量少，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)，但是定量的精確度不高。HPLC法因其靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，是測(cè)定山楂中黃酮類(lèi)化合物最常用的定量方法。黃怡等[36]建立了HPLC同時(shí)測(cè)定山楂葉提取物中牡荊素-2″-O-鼠李糖苷、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚的含量，結(jié)果表明，HPLC法具有較高的精確度和靈敏度。胡玉等[37]以非離子表面活性劑、膠束萃取-濁點(diǎn)預(yù)富集與超聲萃取技術(shù)結(jié)合HPLC法測(cè)定山楂果中的芹菜素等9種成分含量，該方法簡(jiǎn)便快速，環(huán)境友好，準(zhǔn)確度高。目前對(duì)于定量測(cè)定混合物中某類(lèi)成分總的含量最常使用的是紫外-可見(jiàn)分光光度法(UV-VIS)，雖然該方法不能準(zhǔn)確定量某類(lèi)成分的真實(shí)含量，但是因其簡(jiǎn)便快速，仍然是山楂中總黃酮含量測(cè)定最常用的方法。張文莉等[38]以蘆丁為對(duì)照，采用2種顯色系統(tǒng)NaNO2-AI(NO3)3-NaOH和A1C13，用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)山楂葉提取物中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定和比較分析，2種顯色法測(cè)定的結(jié)果偏差較大，該方法的精確性和準(zhǔn)確度在混合物含量測(cè)定方面還需改進(jìn)和完善。

1.3.2 新型檢測(cè)分析方法 為了快速檢測(cè)混合物中的化學(xué)成分，超高效液相色譜(UPLC)因其檢測(cè)速度和分離度均優(yōu)于傳統(tǒng)的HPLC而備受青睞。但若使用不當(dāng)，色譜柱很容易堵塞。液-質(zhì)連用的分析技術(shù)(HPLC-MS)，檢測(cè)前不需要對(duì)樣品進(jìn)行特殊的前處理，具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，該方法定性和定量檢測(cè)能同時(shí)進(jìn)行[24]。Zhang等[39]建立超高效液相色譜與電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)聯(lián)用的方法，通過(guò)該方法分離測(cè)定山楂葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷等4種黃酮類(lèi)化合物，與HPLC法相比，該方法不一定需要對(duì)照品比對(duì)也能檢測(cè)鑒別混合物中化合物的結(jié)構(gòu)，但是儀器相對(duì)昂貴，通常需要專業(yè)人員進(jìn)行操作和維修，成本較高。

2 三萜類(lèi)化合物

山楂中的五環(huán)三萜化合物有3種類(lèi)型，包括烏蘇烷型(熊果酸、科羅索酸等)、齊墩果烷型(如山楂酸、齊墩果酸等)、羽扇豆烷型(如白樺酯酸)；四環(huán)三萜類(lèi)化合物主要有環(huán)阿屯烷型(如環(huán)阿屯)、羊毛脂烷型(如牛油樹(shù)醇、24-亞甲基-24-二氫羊毛脂甾醇等)[7]。目前，三萜酸(五環(huán)三萜)是山楂中三萜類(lèi)成分研究的主要對(duì)象，如山楂酸、熊果酸、科羅索酸、白樺酯酸和齊墩果酸等，因其具有一定的抗病毒[6]和抗糖尿病[40]等重要藥理作用而受到研究者的關(guān)注。

2.1 提取方法

2.1.1 傳統(tǒng)提取法 熱回流法也是較多地應(yīng)用于山楂中三萜類(lèi)成分的提取。呂丹等[41]采用熱回流法提取山楂果皮中的三萜類(lèi)化合物，提取率為1.98%(即提取總?cè)普忌介ぶ械暮?，并且實(shí)現(xiàn)同步提取多酚和黃酮類(lèi)成分，既節(jié)約成本，又避免資源浪費(fèi)。陳寶龍等[42]通過(guò)比較95%乙醇回流法、堿醇水浸提法、60%乙醇回流法和堿水超聲法提取山楂果中三萜酸(齊墩果酸和熊果酸)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸和熊果酸在前2種方法的剩余殘?jiān)芯幢粰z測(cè)到，表明提取較為完全，而在后2種提取方法殘?jiān)芯粰z測(cè)到，表明未提取完全。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況，堿醇水浸提法提取效率高、成本低、安全、易于規(guī)?；?，故選取堿醇水溶液浸提法為最終方案。

2.1.2 新型提取方法 在近年發(fā)展起來(lái)的提取方法中，超聲波輔助提取對(duì)于提取山楂果和果皮中的三萜類(lèi)化合物均有報(bào)道，其中凍融-超聲提取法提取山楂果中三萜酸和超聲提取法提取山楂果皮渣中三萜酸的提取率分別為3.41%[43]、2.33%[44]。微波提取法較多研究于山楂核和果中的三萜類(lèi)化合物提取，通過(guò)在最佳提取工藝條件下比較可以發(fā)現(xiàn)，山楂果中三萜酸的含量(提取率3.42%)高于核中三萜酸的含量(提取率1.14%)[45-46]。植奇明[47]選擇95%乙醇作為超臨界流體萃取山楂中總?cè)频膴A帶劑可以獲得較高的提取率。協(xié)同提取是在較短時(shí)間、溶劑消耗少的情況下可獲得較高提取率?？茉圃芠48]通過(guò)考察微波輔助提取、熱回流提取和超臨界流體萃取山楂總?cè)频墓に囇芯浚玫讲捎脝我惶崛》椒ㄌ崛∩介側(cè)频奶崛÷室来螢?.08%、2.57%、0.97%，但3種方法協(xié)同提取(超臨界-回流-微波)獲得的提取得率可高達(dá)5.13%，結(jié)果表明，相對(duì)于單一的提取方法，將各個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起進(jìn)行協(xié)同提取是一種有效的提取方法，也為新型提取技術(shù)的發(fā)展提供了借鑒。相對(duì)于傳統(tǒng)的提取方法，近年發(fā)展起來(lái)的方法普遍具有提取效率高、時(shí)間短和得率高等優(yōu)點(diǎn)，但是這些方法由于成本普遍較高，使用中儀器易出現(xiàn)故障，若進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)還需要針對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行不斷地改進(jìn)和完善。

2.2 分離方法 重結(jié)晶法、大孔吸附樹(shù)脂層析法是分離純化山楂中三萜類(lèi)成分常用的方法。黃超華等[49]使用重結(jié)晶法從山楂果中分離純化得到純度較高的熊果酸。袁懷波等[50]采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂串聯(lián)柱分離山楂果中的三萜酸，用70%乙醇洗脫得到總?cè)扑嵯疵撀屎图兌确謩e為79.02%、29.02%。柱層析法是分離山楂三萜類(lèi)化合物常用的技術(shù)，然而單一的方法不能有效的分離純化，常需要結(jié)合其他方法連續(xù)分離以提高分離效率。陳寶龍等[42]通過(guò)比較3種純化山楂三萜酸中有效成分的方法，結(jié)果表明，齊墩果酸和熊果酸用大孔樹(shù)脂純化后的純度在50%以下，活性炭吸附純化后的2種三萜酸純度較高為59.04%，而活性炭吸附聯(lián)合結(jié)晶純化后的2種三萜酸純度大于70%，并且不會(huì)導(dǎo)致三萜酸的損失，是山楂中三萜酸純化分離的理想方法。目前分離純化山楂中單一化合物最有效的方法仍然是制備液相色譜，對(duì)于較難分離的化合物能夠起到很好的分離效果。Qiao等[51]將該方法與柱層析法聯(lián)合使用可以快速、有效地從山楂果中分離鑒定15種三萜酸類(lèi)成分。

2.3 分析檢測(cè)方法

2.3.1 常用檢測(cè)分析方法 分光光度法和高效液相色譜法是檢測(cè)三萜類(lèi)成分常用的方法，前者是基于三萜苷元和香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色的顏色反應(yīng)，是一種快速、簡(jiǎn)單的測(cè)定總?cè)祁?lèi)成分的方法；后者在三萜類(lèi)化合物檢測(cè)分析中廣泛應(yīng)用，具有檢測(cè)精度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。黎海衫[52]采用90%乙醇熱回流提取和AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離山楂果中的熊果酸，HPLC法測(cè)定熊果酸含量，熊果酸浸出率1.07%，純度97.0%，回收率大于98.1%。林科等[53]將山楂果中熊果酸用乙醇浸提，濃縮后的沉淀用堿水溶解酸水沉淀得熊果酸粗品，再通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行分離，純化后的熊果酸用分光光度法測(cè)定純度達(dá)到90%。李建中[54]采用可變波長(zhǎng)高效液相色譜建立三萜類(lèi)化合物含量測(cè)定方法，在該方法下檢測(cè)山楂中的三萜類(lèi)化合物熊果酸和齊墩果酸不但能夠得到較好的分離效果，而且還具有精度高、快速準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。采用紅外光譜、核磁共振波譜和質(zhì)譜等也是山楂中三萜類(lèi)化合物鑒定結(jié)構(gòu)常用的方法。黃超華等[49]通過(guò)薄層色譜法和紅外光譜法對(duì)山楂提取物中的有效成分進(jìn)行分析和鑒定，最終確定是三萜類(lèi)物質(zhì)熊果酸。宋少江等[55]對(duì)55%乙醇水洗脫部分進(jìn)行分離純化后，采用IR和NMR法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與鑒定，最終確定熊果酸等5個(gè)化合物。Zhou等[56]對(duì)70%乙醇回流提取部分分離純化后，采用NMR和HR-ESI-MS等方法鑒定得到1個(gè)新的倍半萜。

2.3.2 新型檢測(cè)分析方法 液質(zhì)聯(lián)用等新型檢測(cè)分析技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)于山楂中三萜類(lèi)化合物的研究具有重要意義。許紅蕾等[57]采用液相色譜-二極管陣列光譜檢測(cè)/電噴霧離子化質(zhì)譜(HPLC-DAD/ESI-MS)聯(lián)用技術(shù)從山楂葉提取物中鑒定得到11個(gè)化合物。岳曉芝[58]采用HPLC/ESI-IT-MS法和喬曉莉等[59]采用超高液相/電噴霧-飛行時(shí)間/質(zhì)譜(UPLC/ESI-TOF/MS)法分別從山楂中分析鑒定出了12、13個(gè)化合物。馬志良等[60]采用柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)/質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC/FLD-APCI/MS)同時(shí)測(cè)定6種三萜酸的含量。在山楂三萜類(lèi)化合物的檢測(cè)與分析方法中，隨著檢測(cè)分析技術(shù)不斷發(fā)展，由測(cè)定單一成分的薄層色譜法以及紅外光譜法逐漸發(fā)展成為同時(shí)測(cè)定多種化合物的液相色譜和電噴霧離子化質(zhì)譜(HPLC-DAD/ESI-MS)聯(lián)用技術(shù)，該檢測(cè)方法也將含量測(cè)定和結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)合到了一起，這些新技術(shù)的應(yīng)用不但具有較高的精確度和準(zhǔn)確性，而且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短，對(duì)于山楂有效成分的進(jìn)一步研究和發(fā)展具有重要的推動(dòng)意義。

3 展望

近年來(lái)，很多新的技術(shù)已被廣泛地用于山楂有效成分的提取分離和檢測(cè)分析中，獲得了大量的研究成果，有力地推動(dòng)了山楂中有效成分的深入研究和發(fā)展。在提取技術(shù)方面，新的提取方法如超聲提取、微波提取和超臨界萃取等都具有縮短提取時(shí)間、提高提取率等優(yōu)點(diǎn)，但是新的提取技術(shù)儀器成本較高，儀器容易出現(xiàn)故障等問(wèn)題還需要進(jìn)一步的改進(jìn)。而相對(duì)傳統(tǒng)的提取方法熱回流提取，由于該方法具有成本低，環(huán)保無(wú)污染，簡(jiǎn)便易行等一些優(yōu)點(diǎn)依然是工業(yè)生產(chǎn)中常用的方法。在分離純化方面，萃取法、沉淀法和柱色譜法等單獨(dú)的分離技術(shù)還不能使化合物分離的純度較高。將不同的分離純化技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合使用，可以實(shí)現(xiàn)有針對(duì)性的連續(xù)分離，能夠極大地縮短分離時(shí)間，提高分離效率和純度。在檢測(cè)分析方面，對(duì)于總提物含量的測(cè)定大多使用分光光度法測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品曲線進(jìn)行含量計(jì)算，雖然該方法簡(jiǎn)便易行，短時(shí)高效，但是由于雜質(zhì)和溶液本身對(duì)檢測(cè)結(jié)果存在較大的干擾，該方法的準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步完善和提高。在對(duì)山楂有效成分的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)中，如何將傳統(tǒng)的技術(shù)方法和新型的技術(shù)方法相結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，協(xié)同創(chuàng)新，實(shí)現(xiàn)易行高效、經(jīng)濟(jì)節(jié)能和利于環(huán)保的技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際的科學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)中將是急需解決的主要問(wèn)題。