蔣林惠，石 敏，袁琛凱，丁紅梅

南通市食品藥品監(jiān)督檢驗中心 (南通 226006)

魚露，別名魚醬油，是一種以低值魚蝦等水產(chǎn)品為原料，經(jīng)腌漬、發(fā)酵、熬制等工藝所得的液體調(diào)味料。魚露原產(chǎn)于我國東南沿海地帶，其釀造歷史已達兩千多年，是我國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品的精粹。因其獨特的風味與營養(yǎng)價值使得魚露逐步受到世界各地居民的喜愛，被廣泛應用于食品加工業(yè)及餐飲行業(yè)[1,2]。氯丙醇類化合物是食品及食品接觸材料中的一類污染物，其對人體健康有著潛在的傷害，國際上的專家學者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，氯丙醇類化合物具有生殖、腎臟、神經(jīng)毒性，并且有致癌、致突變及誘導細胞凋亡的風險[3-6]。

食品及接觸材料的氯丙醇污染物來源較多，但魚露類調(diào)味品類的氯丙醇污染物來源主要為水解植物蛋白液。一些生產(chǎn)企業(yè)為縮短調(diào)味品的發(fā)酵周期，獲得最大經(jīng)濟利益，過量采用水解植物蛋白液，最終易導致其氯丙醇類化合物超過標準規(guī)定限量值[7,8]。GB 5009.191—2016《食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測定》中第二法中氯丙醇類化合物檢出限為3-MCPD、2-MCPD為2 μg/kg，1，3-DCP、2，3-DCP為5 μg/kg。液態(tài)調(diào)味品中加了酸水解蛋白液的3-MCPD限量值為0.4 mg/kg。這兩者都給實驗檢測的精密度、準確度提出了不小的挑戰(zhàn)。

按照已有的國標方法進行氯丙醇類化合物的檢測，其主要方法是將氯丙醇經(jīng)衍生后再采用氣相色譜—質(zhì)譜進行單離子掃描分析，間接對氯丙醇進行定量[9-11]。但魚露基質(zhì)復雜，衍生化實驗后易產(chǎn)生多種干擾物質(zhì)，會污染色譜柱并將影響目標化合物的定性定量[12]。為改善上述問題，將氣質(zhì)聯(lián)用的多反應監(jiān)測模式與同位素內(nèi)標法定量結(jié)合，采用QuECHERS前處理技術進行目標化合物純化，該方案無需衍生化，可直接測定氯丙醇類化合物，更加高效、集約、準確。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

MIKRO 220R型臺式高速冷凍離心機，德國Hettich科學儀器公司；Agilent 7890B/7000D型安捷倫氣相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司；VM-2500型，多管旋渦混勻儀，廣東安勝儀器有限公司；BSA 224S型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；DB-WAX UI型氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美國安捷倫科技公司。

D5-1，3-二氯-2-丙醇、3-氯-1，2-丙二醇、2，3-二氯-1-丙醇、1，3-二氯-2-丙醇，阿爾塔(天津)標準物質(zhì)研究院有限公司；D5-2，3-二氯-1-丙醇、D5-3-氯-1，2-丙二醇，上海安譜璀世標準技術服務有限公司；D5-2-氯-1，3-丙二醇、2-氯-1，3-丙二醇，北京曼哈格生物科技有限公司；甲醇、正己烷、乙酸乙酯，色譜純，德國默克公司；無水硫酸鎂、氯化鈉，優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司；C18(十八烷基硅烷)、PSA(N-丙基乙二胺)，優(yōu)級純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；有機相針式濾頭，0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1標準工作曲線的配置

選擇氯丙醇類化合物及同位素內(nèi)標的標準儲備液(100 mg/L)，本實驗配制線性范圍1～1 000 μg/L的標準曲線(其對應內(nèi)標物質(zhì)含量為100 μg/L，試劑為乙酸乙酯)，標準系列工作液直接進入GC-MS-MS分析。

1.2.2樣品前處理方法

實驗選擇魚露作為實驗樣品。準確稱取樣品2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入混合內(nèi)標溶液，超聲5 min，渦旋混勻后待處理。再加入2 mL甲醇、QuECHERS試劑包(無水硫酸鎂2 g，氯化鈉0.5 g，C18 100 mg，PSA 100 mg)，渦旋5 min，10 000 r/min離心，上清液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，重復提取兩次，合并上清液并定容至5 mL。取上清液過0.22 μm有機針式濾頭后進行GC-MS-MS測定。

1.2.3氣相色譜分析參數(shù)

色譜柱為DB-WAX。程序升溫：初始溫度50 ℃，以10 ℃/min升至180 ℃，保持5 min；再以30 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；后運行為310 ℃，2 min。進樣體積1 μL，不分流進樣。碰撞氣為高純氮氣，流速1.5 mL/min。載氣為高純氦氣，流速2.25 mL/min。

1.2.4串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)[13]

離子源：電子轟擊源(EI)70 eV，溫度230 ℃。溶劑延遲3 min。碰撞氣為高純氮氣，流速1.5 mL/min。采用多反應監(jiān)測模式(dMRM)掃描，主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氯丙醇類化合物的主要質(zhì)譜信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

目標化合物氯丙醇的含量用同位素內(nèi)標法定量。采用安捷倫MS Hunter工作站進行數(shù)據(jù)采集與處理，SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)整理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

氯丙醇類化合物極易溶于甲醇、乙腈和水等極性溶液，將這三者進行試驗比較，最終選擇甲醇作為提取試劑。甲醇能將魚露中的一些物質(zhì)進行沉淀，并且該溶劑可直接進入氣質(zhì)聯(lián)用儀分析，避免溶劑替換。無水硫酸鎂與氯化鈉四比一的經(jīng)典配比能夠產(chǎn)生有效鹽析，另外C18和PSA能吸附魚露中的多種雜質(zhì)，包括甾醇、有機酸、脂肪酸等[14,15]。實驗中選擇甲醇-固相分散萃取試劑進行液態(tài)調(diào)味品的快速前處理，所得上清液能夠直接進行GC-MS-MS分析，并且其最終回收率較高，詳見表2。

表2 空白魚露樣品加標回收實驗結(jié)果(n=6)

2.2 色譜柱的選擇

氯丙醇類物質(zhì)均屬強極性化合物。若直接進行氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析則需要選擇極性色譜柱。本實驗選擇DB-WAX強極性色譜柱進行分析，結(jié)果峰型好，分離效果優(yōu)，詳見圖1。

注：保留時間對應化合物分別為10.902(D5-1，3-DCP)、10.957(1，3-DCP)、11.718(D5-2，3-DCP)、11.793(2，3-DCP)、14.303(D5-3-MCPD)、14.383(3-MCPD)、15.298(D5-2-MCPD)、15.406(2-MCPD)。 圖1 氯丙醇及同位素內(nèi)標物質(zhì)的混合標準溶液(1 mg/L)總離子流圖

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

基于氯丙醇類化合物的標準溶液及內(nèi)標工作液，實驗選擇多反應監(jiān)測模式進行目標化合物的數(shù)據(jù)采集分析，通過前級離子、產(chǎn)物離子及多反應監(jiān)測模式下的碰撞能量優(yōu)化。首先進行一級質(zhì)譜掃描獲得目標化合物的保留時間及主要碎片離子，選擇離子豐度最高的2個碎片離子作為前級離子?；谇凹夒x子設置碰撞能量9 V，采集質(zhì)荷比(m/z)20～90范圍內(nèi)的碎片離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種目標化合物均僅有一個碎片離子的響應值突出，故僅選用一個產(chǎn)物離子。在確定前級離子及產(chǎn)物離子后進行碰撞能量的優(yōu)化，設置四階梯(5 V，9 V，12 V，15 V)的碰撞能量，考察其對應能量下離子對響應值，選擇最高離子響應值的碰撞能量最為最優(yōu)能量。氯丙醇類化合物的MRM質(zhì)譜圖如圖2，各化合物的前級離子、產(chǎn)物離子及最優(yōu)碰撞能量見表1。

圖2 氯丙醇類化合物及同位素內(nèi)標物質(zhì)的MRM質(zhì)譜圖

2.4 標準曲線及檢出限(基質(zhì)效應)

基于氯丙醇類物質(zhì)標準儲備液，配制線性濃度1、5、10、20、40、100、200、400、1 000 μg/L的標準曲線(其對應內(nèi)標物質(zhì)含量為100 μg/L，試劑為乙酸乙酯)，直接進樣GC-MS-MS分析。以氯丙醇與其內(nèi)標物的相對響應作為縱坐標(Y)，相對濃度作為橫坐標(X)，繪制標準工作曲線，標準曲線詳細信息詳見表3。4種氯丙醇在0.001～1.0 mg/L范圍內(nèi)均能夠呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)(R)均達0.999。本實驗的檢出限與國家標準GB 5009.191—2016中第二法的檢出限相當，能夠滿足日常檢測需求。

魚露基質(zhì)較為復雜，采用QuECHERS凈化包，甲醇提取后能夠有效的降低基質(zhì)效應對于目標化合物在定性定量方面的干擾，為進一步降低基質(zhì)效應，采用同位素內(nèi)標做加標進行內(nèi)標法定量確保檢測的準確性。

表3 氯丙醇的線性方程及檢出限

2.5 精密度和加標回收實驗

以空白魚露作為樣本進行加標回收率和方法精密度實驗，將相對標準偏差(RSD)表示方法的精密度?？瞻佐~露樣品中加入1，3-DCP、2，3-DCP、3-MCPD、2-MCPD的標準品及對應內(nèi)標，進行3水平6平行實驗。加標濃度分別為10 μg/kg、100 μg/kg、500 μg/kg，結(jié)果詳見表2。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，4種氯丙醇類化合物3個加標水平的回收率和相對標準偏差(RSD)分別為1，3-DCP：65.9%～97.4%(1.86%～1.03%)；2，3-DCP：80.7%～98.5%(1.71%～0.74%)；3-MCPD：81.6%～90.2%(8.25%～4.77%)；2-MCPD：82.8%～105.3%(9.55%～1.97%)。結(jié)果表明，經(jīng)本方法測定所得的方法回收率和精密度均能購滿足日常檢測需求。空白樣品加標實驗也能驗證該實驗方案能夠有效的降低基質(zhì)效應對于氯丙醇結(jié)果的準確度影響。

3 結(jié)論

本實驗基于QuECHERS前處理技術結(jié)合氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，進行魚露中氯丙醇的快速測定。通過對檢出限、線性方程、空白樣品加標回收率、加標精密度等方法學實驗驗證。通過驗證確認，本實驗方法能夠滿足目前對于魚露中氯丙醇的檢測要求。與國標方法相比，本方法無需衍生化反應，更加簡便、高效、集約。