敖義鵬，何強治，周志鵬，屈富波，招昌君

陜西省城固縣畜牧獸醫(yī)工作站，陜西 城固 723200

新城疫、禽流感等有血凝素(HA)的病毒能凝集人或動物紅細胞，稱為血凝現(xiàn)象，血凝現(xiàn)象能被相應抗體抑制稱為血凝抑制試驗，這是一種利用抗原抗體的特異性反應來測定抗原或抗體的檢測技術，該技術是目前WTO 進行全球禽流感監(jiān)測普遍采用的試驗方法[1]，具體就是制備1%的禽無抗紅細胞懸液，測定抗原效價，然后根據(jù)抗原效價配制4 IU 抗原，再用4 IU 抗原測定抗體，如果待檢樣品中有抗體，抗體會與抗原結合，紅細胞就會沉淀于微量反應板孔底，傾斜微量反應板時，紅細胞就會出現(xiàn)流淌現(xiàn)象，如待檢樣品中沒有抗體，則抗原就會與紅細胞發(fā)生凝集反應，傾斜反應板時，紅細胞就不會發(fā)生流淌現(xiàn)象，根據(jù)這一方法判定抗原或抗體效價高低。

1 常見問題

1.1 紅細胞懸液制備問題

在紅細胞懸液制備時，常見問題主要有：供制備紅細胞懸液的禽的選擇不符合要求，如供制備紅細胞的禽為非無抗禽，供樣禽數(shù)量不符合要求，紅細胞溶血、配制濃度不達標等。

1.2 抗原配制問題

抗原效價測定不準確，其他相關因素控制不嚴引起抗原效價測定結果失真。

1.3 操作規(guī)范問題

移液槍頭不暢，移液器未經校核定量，操作不規(guī)范（未按規(guī)定時間、劑量和順序操作），操作前試劑沒有混勻和預溫，實驗用器械未經嚴格清洗消毒造成的污染等。

1.4 結果判定問題

試驗條件不成立，不符合判定標準，不在規(guī)定時間內判定結果，對判定依據(jù)把握不準確等。

2 對 策

2.1 規(guī)范制備紅細胞

1）非免疫雞的選擇：供制備1%紅細胞的雞，必須是未免疫新城疫、禽流感疫苗、未發(fā)生相應疫病的公雞，至少2～3 只。

2）防止溶血：采血時避免外源污染，采血針頭應選擇較大號的，抽吸時用力不要過大，采雞血前先吸取3～5 mL 稀釋液可有效防止采樣過程中的溶血或血液凝固（特別是高溫情況下，雞血凝固速度較快），避免酒精接觸雞血或紅細胞，采集的雞血應該溶于預先準備好的經過滅菌處理的PBS 液中，并輕輕混勻，在離心制備紅細胞前不能長期靜置，防止血液凝固。異物也容易引起血液凝固。

3）制備1%雞紅細胞：洗滌紅細胞時，應先混勻紅細胞，取上層紅細胞懸液用于離心，避免凝集血塊夾雜其中；紅細胞洗滌要徹底，一般至少3～5 次，充分去除其他非紅細胞成分；離心速度一般1 800～2 500 r/min、5～8 min，初次離心選擇較低速度，防止高速離心造成紅細胞堆積過緊實出現(xiàn)粘連，隨著洗滌次數(shù)的增加，離心速度依次增加、時間延長；制備的紅細胞體積符合要求，若離心速度低、時間短，紅細胞因夾雜過多洗滌液、紅細胞壓積不實，則制備的紅細胞濃度會小于目標濃度；在實際操作中，往往需采集2～3 只公雞血液用于制備1%的雞紅細胞，有時也會出現(xiàn)紅細胞部分溶血現(xiàn)象，只要對紅細胞進行充分洗滌，仍可制備出符合要求的紅細胞；判定紅細胞是否溶血的技巧是將制備好的1%的雞紅細胞懸液靜置后，看上清液是否澄清，若清澈說明合格，若呈紅色說明紅細胞有溶血現(xiàn)象[2]，應棄去重新制備。

4）紅細胞制備效果評判依據(jù)：離心紅細胞時若洗滌液逐步變清，表明紅細胞制備比較成功；將制備的紅細胞移入PBS 稀釋液時，有明顯的云霧狀擴散現(xiàn)象，表明紅細胞制備較好。如紅細胞經離心后，上清液始終呈紅色，數(shù)次離心后仍呈紅色，表明紅細胞有溶血，則制備的紅細胞不可用；如果紅細胞加入稀釋液中呈紅色，且經過數(shù)小時仍呈紅色，表明紅細胞有溶血現(xiàn)象，不可用；制備的紅細胞若出現(xiàn)凝血塊，紅細胞不可用。

1%雞紅細胞應現(xiàn)配現(xiàn)用，確需延長時間使用時，應在2～8 ℃下保藏，時間一般不超過3 d。在使用1%雞紅細胞前，應先觀察上清液是否澄清，若上清液渾濁或容器底部紅細胞平鋪不均勻、有結塊現(xiàn)象等，則不可用。

2.2 精準操作

1）正確制備紅細胞懸液是精準測定抗原效價的前提。1%雞紅細胞制備的準確性，影響抗原和抗體效價的測定，若制備的紅細胞濃度增大，則抗原、抗體效價測定時會被降低，因此必須準確配制1%雞紅細胞懸液。

2）準確配制4 IU 抗原。每次試驗時，都要對抗原進行標準化測定，4 IU 抗原盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，用測定抗原效價的同批次1%的紅細胞進行試驗檢測，防止不同批次的1%的紅細胞因濃度差異而影響抗體效價準確測定。按照血凝抑制試驗操作步驟進行4IU 抗原配制，完成配制后，應對4 IU 抗原再進行一次抗原效價測定（回歸試驗），若4 IU 抗原效價為2 log2，試驗有效，表明4 IU 抗原配制準確，否則應重新配制[3]，4 IU 抗原配制濃度高了易出現(xiàn)樣品抗體假陰性，反之易出現(xiàn)假陽性結果，因此必須精準配制4IU 抗原。

3）待檢血清必須符合檢測要求。待檢血清必須清亮，無溶血、無果凍樣凝固、無腐敗變質、無紅細胞等物質摻雜。若血清中含有紅細胞，在進行抗體效價測定時會出現(xiàn)比實際值高的現(xiàn)象。要嚴防樣品腐敗變質，血清或抗體的主要成分是蛋白質，如儲運不當，可導致其變質變性，從而影響檢測結果。為防止禽血清出現(xiàn)果凍樣凝固，盡可能采集青年禽血樣，采樣宜在禽進食前進行，采集的禽血清以自然析出最佳，確需離心時應靜置2 h 以上再進行離心。供樣動物機體狀況對結果也有影響，若動物脫水、血液濃稠度高等對抗體濃度也有影響。

4）準確定量。如稀釋液、紅細胞懸液、抗原、樣品等配制濃度必須準確、使用前充分混勻，使用時準確量取，對反應時間和結果判定時間要嚴格控制。在使用多道移液槍時，操作人員要注意觀察移液器吸頭液面高度，若出現(xiàn)不一致，可能是滴頭堵塞或是移液器出現(xiàn)故障，應及時排除影響。

5）嚴格比對。對待檢樣品進行檢測前，一定要做好“3 個對照”即陽性對照、陰性對照和空白（稀釋液）對照，只有3 個對照成立，檢測結果才有效。

2.3 科學研判結果

1）判定標準：抗原效價測定時的判定標準是“能使紅細胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度”，樣品抗體效價測定時的判定標準是“以完全抑制4 單位抗原的血清最高稀釋度”[4]，上述2個判定標準必須準確把控，不得用“50%凝集”判定。同時判定紅細胞沉淀還是凝集時，一定要結合紅細胞均勻分布于稀釋液體系還是沉淀于孔底、形狀、色澤以及傾斜反應板觀察時的紅細胞流動狀態(tài)，如流淌速度、長度和數(shù)量等綜合研判。

2）正確判定：判定結果時，應將反應板傾斜45～60°進行觀察，紅細胞完全凝集時，均勻布于反應孔中，有時紅細胞凝集時會出現(xiàn)片狀凝集甚至皺縮成團（超凝）現(xiàn)象，易與紅細胞的沉淀現(xiàn)象混淆，可通過3 種方法鑒別：一是察顏色：紅細胞完全凝集或出現(xiàn)超凝時，紅細胞均勻分布于反應孔中略呈灰色，如果因超凝形成可見凝集物時的凝集物顏色往往呈灰色或灰褐色，與正常沉淀的紅細胞的鮮紅色形成鮮明對比；二是觀狀態(tài)：紅細胞完全凝集時，紅細胞呈均勻分布狀態(tài)，且在反應孔底內呈連續(xù)、整齊、均勻分布，偶爾也會出現(xiàn)凝集片、甚至凝集片狀物邊緣不整齊或出現(xiàn)皺縮（超凝）現(xiàn)象；紅細胞沉淀時，會在反應孔底出現(xiàn)紐扣狀沉淀，且有向孔底集中趨勢；在PBS 液對照孔結果正確的情況下，將血凝板傾斜，從背側觀察，結果更加清晰[5]；三是看規(guī)律：試驗中，樣品是按照對倍規(guī)律稀釋的，沉淀或凝集反應也是有規(guī)律的，加入紅細胞后，同一樣品的對倍稀釋孔會出現(xiàn)由沉淀到凝集或者由凝集到沉淀的有規(guī)律狀態(tài)，如果出現(xiàn)個別孔結果異常，表明試驗操作不當，應重新進行檢測。當傾斜反應板時，沉淀的紅細胞對照孔會出現(xiàn)“流淚”現(xiàn)象，且紅細胞流淌速度、長度和數(shù)量正常；出現(xiàn)超凝的反應孔一般不會出現(xiàn)紅細胞流淌，或者凝集物流淌極為緩慢；要注意樣品孔與紅細胞對照孔紅細胞的狀態(tài)對比，一般陰性時則表現(xiàn)同步流淌，且流淌速度、數(shù)量和線形基本一致，反之亦然。

2.4 嚴控試驗條件

1）溫度和時間：該試驗一般宜在15～25 ℃條件下進行，HA 和HI 試驗中加入紅細胞后判讀結果的時間一般為30～40 min，具體參照紅細胞對照孔，對照孔完全沉淀時要迅速判讀結果。溫度高則反應速度加快，判讀時間縮短，但溫度過高（超過37 ℃），凝集的紅細胞容易洗脫，紅細胞很快沉淀下來，導致試驗不成立[6]；溫度低，則反應速度減緩，判讀時間延長。同時要適時掌握判讀時間，判讀時間過早，出現(xiàn)凝集不全，判讀時間過遲，會出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象，亦會影響結果的準確判定。

2）樣品質量：血清樣品應澄明、無污染、無雜質、無紅細胞，否則會影響實驗結果；注意消除非特異性凝集因子影響，盡可能采集同種家禽的血制備紅細胞懸液。

3）試劑貯用：試劑保藏、運輸必須在適宜的溫度范圍內，嚴防高溫、反復融凍、曝曬、劇烈震蕩等不利因素對試劑效價的影響，試劑、1%雞紅細胞、PBS 液等使用前都要充分混勻并預溫后使用[7]，抗原和抗體都要現(xiàn)配現(xiàn)用，確需延長使用時間，一般應在2～8 ℃條件下保藏，不超過3 d，否則影響試驗結果。

4）試驗環(huán)境：所有試劑盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，確需延長使用時間的，一定要按要求規(guī)范保藏；所有操作應在無菌環(huán)境中進行；容器、稀釋液等均應經嚴格滅菌、消毒。

5）操作規(guī)范：移液器、天平等定量工具要定期校核；血凝板選用90°板，不得用110°板，否則影響試驗結果；配制PBS 液所用試劑磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀等4 種試劑構成穩(wěn)定的緩沖體系，確保試驗結果的穩(wěn)定呈現(xiàn)，一般不宜用生理鹽水等代替[8]；對投入試驗的所用器械、PBS 液等要嚴格消毒，防止污染；在進行抗原效價測定時，應該做3 個重復，取至少2 個測定結果一致的數(shù)值作為抗原效價測定值；待檢樣品對倍稀釋要規(guī)范，判定方法是：同一待檢樣品對倍稀釋后，顏色逐步變淡，均勻過渡，否則可能是漏加或重復加樣造成。