王 霞，朱飛艷，王 晶，熊 喆，韋云芳，李 彬，魏紅江，趙紅業(yè)

(1.大理大學 藥學與化學學院，云南 大理 671000；2.云南省動物基因編輯與體細胞克隆技術重點實驗室，云南 昆明 650201；3.云南省異種器官移植工程研究中心，云南 昆明 650201；4.云南農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201)

根據(jù)國家癌癥中心公布的數(shù)據(jù)，近年來結直腸癌新發(fā)病例和死亡病例居高不下[1]。結直腸癌早期生存率高但隱匿性強，因此早期診斷至關重要[2-3]。結直腸癌的治療主要是手術切除加藥物治療，病灶切除后，復發(fā)和轉移的可能性大，晚期患者只能接受化療，但副作用很大[4]。在結直腸癌治療方案的研究中，動物試驗在體外研究結果向體內研究轉化方面發(fā)揮著重要的橋梁作用。由于生物學的相似性和重復性等特點，高質量動物模型的建立為腫瘤的發(fā)病機制、預防及藥物研發(fā)提供了客觀可靠的平臺。目前，建立的結直腸癌動物模型主要以小鼠(免疫缺陷)為試驗動物，通過化學誘導、轉基因和移植等3 種方式獲得腫瘤模型[5]?；瘜W誘導的腫瘤模型生長緩慢，腫瘤細胞增殖率低，誘導過程所需時間較長，且個體差異較大；轉基因動物模型通過改變基因組的表達而建立，成瘤率及轉移率較低，試驗時間較久，在試驗研究中應用尚少；移植模型操作簡單，成功率高，重復性好[6]。皮下腫瘤移植是把體外培養(yǎng)的腫瘤細胞移植到小鼠的皮下部位從而建立動物模型，該方法操作簡單、成瘤率高、應用廣泛[7-8]。由于裸鼠的免疫缺陷性，它不排斥移植源于異種動物的細胞或組織；此外，由于其可以保留原發(fā)腫瘤本身的遺傳性和形態(tài)特征[9]，故具有較強的生物學相似性和較高的重復性。

HT29 和HCT116 細胞同為人結直腸癌細胞。已有研究得到HCT116 細胞系小鼠皮下移植瘤[10]；在裸鼠爪墊皮下部位注射可獲得人結直腸癌HCT116細胞系轉移模型[11]；將結直腸癌細胞接種于裸鼠左側腋窩皮下可獲得人結直腸癌的裸鼠皮下移植瘤模型[12]。皮下生長的腫瘤通常易被纖維膜所包繞，故不易表現(xiàn)惡性腫瘤浸潤和轉移的特性，腫瘤轉移率低。突變或缺失可使機體失調進而導致腫瘤發(fā)生[13-14]。HT29 是細胞發(fā)生p53基因突變的結直腸癌細胞，是最常見的人類腫瘤基因。野生型p53是腫瘤的抑制關鍵因子，腫瘤發(fā)生過程中產生錯誤的突變積累到較高水平時，會導致腫瘤惡性增殖[15]。細胞周期抑制蛋白p21 在細胞增殖過程中與p53基因共同作用，調控細胞的增殖和細胞周期[16]。當DNA 發(fā)生損傷時，細胞周期阻滯，對DNA 復制錯誤的細胞生長進行抑制，達到抑制癌細胞惡性生長的作用[17]；p53基因突變或缺失的細胞中，DNA 損傷沒有得到及時修復，且不斷增殖導致錯誤蛋白積累，最終發(fā)展為惡性腫瘤[18]。因此，我們認為HT29 的惡性程度更高。

腫瘤細胞在體外培養(yǎng)過程中，增殖受到傳代等因素的影響，移植到體內的細胞系增殖能力可能會受到體內微環(huán)境影響而發(fā)生改變。本研究以2 株不同的人結直腸癌細胞系HT29 和HCT116為材料，分析其在體外培養(yǎng)和在裸鼠體內的增殖能力，比較2 株細胞的成瘤效果和成瘤條件，為結直腸癌動物模型的構建提供合適的細胞移植量，縮短成模周期，為移植瘤模型的成功建立提供可靠依據(jù)，也為結直腸癌的進一步研究奠定基礎，以期后續(xù)對裸鼠皮下移植瘤進行更進一步的生理生化和病理分析以及藥物試驗。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細胞的增殖培養(yǎng)

1.1.1 細胞系來源及培養(yǎng)試劑

人結直腸癌細胞系HT29 和HCT116 購自中國科學院細胞庫；RPMI1640 培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司；雙抗(青霉素—鏈霉素)購于Biological industries 公司；胎牛血清購于 ExCell Bio 公司；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒和BCA 總蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司；p53 抗體、p21 抗體和β-actin 抗體購自美國 Abcam 公司；二抗購自美國R&D 公司。

1.1.2 細胞培養(yǎng)

取凍存的細胞株HT29 和HCT116 于37 ℃水浴鍋中迅速解凍3 min，加入DMEM 培養(yǎng)液，1 500 r/min 離心3 min 以洗去凍存液；將細胞置于培養(yǎng)皿中，加入含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；隔天換液，分皿，1 周后收集細胞并計數(shù)。將HT29 和HCT116 細胞密度調整為2×106和1×107mL-1，將細胞懸液分裝于1.5 mL 離心管中，每支離心管裝200 μL，置于冰盒中保存，以備接種。

1.1.3 CCK-8 檢測細胞增殖活性

將細胞培養(yǎng)于96 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，每孔加人CCK-8 反應液10 μL，隨后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；取出后使用酶標儀讀取每個孔在450 nm 的OD 值，并計算細胞相對增殖率。

1.1.4 細胞單克隆試驗

取對數(shù)生長期的細胞，按每孔1 000 個細胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)7 d 后用細胞固定液固定30 min，然后用10% Gisma 染色30 min，用蒸餾水輕輕洗去Gisma 染色液，放置干燥，于顯微鏡下觀察細胞單克隆生長情況并拍照。

1.2 腫瘤細胞p53 和p21 蛋白表達測定

HT29 和HCT116 細胞使用阿霉素(doxorubicin，DOX)誘導后，采用蛋白質免疫印跡試驗進行測定。使用RIPA 細胞裂解液將處理組細胞放置于4 ℃裂解20 min，離心，收集細胞上清，采用BAC 法測定上清液中的總蛋白濃度；加入SDS 上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱10 min，得到變性的全細胞總蛋白樣品。細胞總蛋白使用SDS-PAGE 電泳，然后取出SDS-PAGE 凝膠，鋪上聚偏氟乙烯樹脂(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，使用膜轉印儀進行蛋白轉??；轉印了蛋白的PVDF 膜首先經5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，隨后加入稀釋后的一抗于4 ℃孵育過夜，然后加入二抗于室溫孵育2 h。經增強化學發(fā)光底物顯色后，使用凝膠成像儀進行蛋白表達量顯影。

1.3 腫瘤細胞的成瘤差異比較

1.3.1 腫瘤細胞接種

為比較HT29 和HCT116 細胞裸鼠移植成瘤的差異并篩選兩者的最適細胞接種量，設置單只細胞接種量為4×105(IN1)和2×106個 (IN2)進行腫瘤細胞接種。將25 只裸鼠在恒定條件下適應性飼養(yǎng)1 周，隨機分為5 組：對照組、HT29 細胞IN1組、HT29 細胞IN2組、HCT116 細胞IN1組和HCT116 細胞IN2組。對照組每只裸鼠于腹股溝部位皮下注射PBS 溶液200 μL，試驗組裸鼠每只相同部位注射細胞懸液200 μL。

1.3.2 裸鼠體質量和腫瘤體積的測定

各組裸鼠體質量和腫瘤體積從細胞接種的第4 天起，每2 d 測量1 次，持續(xù)14 d，每次于固定時間使用電子游標卡尺測量腫瘤最長直徑(d1)和最短直徑(d2)，并計算腫瘤體積(V)。V=1/2d1d22。

1.4 腫瘤組織的病理學檢測

1.4.1 腫瘤組織的獲取

裸鼠成瘤14 d 后，使用5%水合氯醛對所有裸鼠進行麻醉，剝取裸鼠皮下腫瘤組織和癌旁組織，置于4%甲醛溶液中固定，于4 ℃冰箱保存。

1.4.2 腫瘤組織切片和HE 染色

將固定的組織塊裝入包埋盒，置于廣口瓶中用水流沖洗20 min，使用全自動生物組織脫水機對切片進行脫水，脫水后使用生物組織包埋機進行石蠟包埋。將包埋的石蠟塊放入切片機，切取厚度為5 μm 的石蠟切片，將切片攤至載玻片，將載玻片置于60 ℃烤片機上烘烤20 min。將石蠟切片裝入載玻片架，經二甲苯脫蠟和梯度酒精復水→蘇木素室溫染色15 min→水洗→分化液分化3 s→水洗→反藍液反藍10 s→水洗→純溶伊紅染色5 min→梯度酒精脫水→二甲苯透明→中性樹脂封片得到HT29 和HCT116 腫瘤組織和癌旁組織的HE 染色切片，于顯微鏡下觀察組織學形態(tài)并拍照。

1.5 統(tǒng)計與分析

采用 GraphPad Prism 7 和SPSS 17.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。對蛋白表達水平以及小鼠體質量和腫瘤體積進行雙因素方差分析，然后進行Tukey’s 事后檢驗；對細胞增殖采用Student’st檢驗進行分析。試驗結果采用“平均值±標準差”表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 HT29 和 HCT116 腫瘤細胞的增殖

由圖1 可知：在接種細胞量相同情況下，HCT116 細胞的增長率極顯著高于HT29 細胞(P＜0.01)；單克隆形成試驗也表明：接種相同數(shù)量的HCT116 和HT29 細胞7 d 后，HCT116 克隆點的細胞面積明顯大于HT29 的細胞面積。

圖1 HT29 和HCT116 腫瘤細胞增殖差異比較Fig.1 Differences of proliferation between HT29 and HCT116 tumor cells

2.2 HT29 和HCT116 腫瘤細胞p53 和p21 蛋白的表達水平

由圖2 可知：DOX 誘導后，HT29 和HCT116細胞的p53 蛋白水平均無顯著變化(P＞0.05)，且HT29 細胞中p53 蛋白水平極顯著高于HCT116細胞(P＜0.01)；HT29 細胞中，p21 蛋白在DOX誘導前、后均不表達，HCT116 細胞中p21 蛋白正常表達，且在DOX 誘導后表達水平極顯著升高(P＜0.01)。

圖2 HT29 和HCT116 腫瘤細胞p53、p21 蛋白表達水平差異Fig.2 Differences of protein expression levels of p53 and p21 between HT29 and HCT116

2.3 HT29 和HCT116 腫瘤細胞移植對小鼠體質量的影響

由圖3 可知：細胞移植12 d 內，HT29 和HCT-116 的單只接種量為4×105和2×106個時，裸鼠體質量均無顯著變化(P＞0.05)。

圖3 接種HT29 和HCT116 的裸鼠體質量變化Fig.3 Changes in body weight of nude mice inoculated with HT29 and HCT116

2.4 HT29 和HCT116 腫瘤細胞的成瘤性

由圖4 可知：單只細胞接種量為4×105和2×106個時，HT29 細胞移植裸鼠在移植的第4 天觀察到腫瘤生成，HCT116 細胞移植裸鼠僅在2×106個的接種量下第4 天后觀察到腫瘤產生；各處理組產生的腫塊體積在第8 天開始呈逐漸增大的趨勢，但與其他移植時間的大小無顯著差異(P＞0.05)；同一接種量下，HT29細胞移植裸鼠腫瘤體積顯著高于HCT116 細胞移植組(P＜0.05)。說明HT29 細胞比HCT116 細胞的成瘤效果顯著，高濃度的癌細胞移植有利于腫瘤形成。

圖4 HT29 和HCT116 細胞接種裸鼠的腫瘤體積Fig.4 Tumor volume in nude mice inoculated with HT29 and HCT116 cells

2.5 腫瘤組織病理學檢測

成瘤14 d 后，HT29 細胞移植組成功從裸鼠皮下剝離腫瘤組織，而HCT116 組未獲得腫瘤組織。將HT29 腫瘤組織與正常肌肉組織進行切片和HE 染色，結果(圖5)顯示：正常肌肉組織呈正常分化的肌肉細胞；HT29 細胞腫瘤組織內可見細胞核膨大，呈圓形，染色體著色不均，有空泡樣細胞核，腫塊組織內細胞間聯(lián)系松散，未見明顯組織分化。

圖5 HT29 細胞接種裸鼠癌組織及正常組織的HE 染色 (20×)Fig.5 HE staining of cancer tissue and normal tissues of nude mice inoculated with HT29 cells

3 討論

移植瘤的形成在動物模型建立過程中受許多因素影響，如細胞活力及數(shù)量、注射用細胞懸液的制備情況和細胞培養(yǎng)條件等細胞因素以及裸鼠品種及大小、發(fā)育時間、健康與否和接種方法等試驗動物因素。本研究主要針對細胞活力、細胞數(shù)量和細胞周期等進行試驗設計。

在進行皮下移植腫瘤細胞試驗時，如果接種量太小，可能造成移植瘤生長緩慢或效果不明顯，過高則可能造成裸鼠死亡。本研究設置了4×105和2×106個2 種單只細胞接種量，探究細胞接種量對裸鼠成瘤效果的影響。HCT116 細胞在2×106個的單只接種量下可以成瘤，說明該接種量是HCT116 細胞的較合適接種量；而 HT29細胞在4×105和2×106個的單只接種量下均可成瘤，表明高濃度的腫瘤細胞移植有利于成瘤，且HT29細胞的成瘤效果較好。與HT29 相比，HCT116細胞的體內成瘤效果較差，其一，可能是荷瘤時間過短，瘤體還沒有完全發(fā)育，瘤體體積較?。黄涠?，可能是因為HT29 是p53突變的結直腸癌細胞，HCT116 細胞p53野生型使癌細胞凋亡，從而防止癌變。

靶向高增殖是侵襲性腫瘤的突出問題，腫瘤的特征之一是無限制的細胞增殖[19]。體外培養(yǎng)過程中，腫瘤細胞增殖速率的快慢并不能完全反映腫瘤細胞在體內的增殖。在體外，HT29 細胞增殖速率低于HCT116，其原因可能是HT29 細胞過度產生p53 腫瘤抗原，但在p53基因的273 位發(fā)生突變，導致組氨酸取代精氨酸[20]；本研究也表明：p53 蛋白在HT29 細胞內高表達，且p53蛋白的高表達可能抑制了p53 下游p21 蛋白表達。前期研究表明：p53基因缺失可促進豬成纖維細胞增殖[21]；在本研究中，與HT29 相比，HCT116 細胞增殖速率顯著升高，p53 蛋白表達量極顯著下降，且在HCT116 細胞中，DOX 誘導下p21 顯著升高，可能是由于p53 蛋白表達過低使細胞穩(wěn)態(tài)維持能力下降，細胞受到脅迫后應激反應增強，p21 蛋白表達水平升高。

突變型p53可增加癌細胞的惡性程度，還能轉變?yōu)榘┗騕22]，可阻止細胞凋亡和細胞周期停滯，還能直接與 DNA 啟動子附近區(qū)域結合，或者反式激活啟動相關基因的表達[23]。突變型p53轉錄的下游靶基因大多上調了腫瘤的生存信號通路，促進腫瘤血管生成[24]。HCT116 的p53 蛋白表達量極顯著低于HT29 細胞，惡性腫瘤通常具有惡性增殖的特點，該結果提示HT29 為惡性程度更高的腫瘤細胞?？梢姡[瘤細胞在體外增殖速率的快慢不能完全真實反映腫瘤細胞的惡性程度，必須結合腫瘤細胞的其他生物學特性、相關分子機制以及在體內的增殖狀況才能較全面地分析和判斷腫瘤細胞的惡性程度。

4 結論

高濃度的癌細胞移植利于腫瘤的形成。HCT-116 細胞的增殖速率高于HT29，但HT29 細胞移植成瘤效率顯著優(yōu)于HCT116 細胞，這可能與HT29細胞中p53基因突變導致p53 蛋白高表達及其下游p21 蛋白低表達有關。