趙先平，楊通平，向江*

（1.張家界市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南 懷化 418000）

0 引言

功能性消化不良（Functional Dyspepsia，F(xiàn)D）是一種慢性功能性消化系統(tǒng)疾病，以上腹痛、上腹燒灼感、餐后飽脹及早飽感等為主要臨床表現(xiàn)[1]。該病在全球范圍內(nèi)的患病率約為10%~30%[2]，在我國(guó)的患病率亦在20%以上，且呈逐年上升的趨勢(shì)[3]。雖然FD為非致命性疾病，但具有發(fā)病率高、病程長(zhǎng)、易反復(fù)的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的精神心理狀態(tài)與生活質(zhì)量[4]。目前西醫(yī)方面多以抑酸、促胃腸動(dòng)力、抗焦慮抑郁等對(duì)癥治療為主，雖可在一定程度上改善臨床癥狀，但長(zhǎng)期應(yīng)用，存在較高的不良反應(yīng)發(fā)生率[5]。已有多項(xiàng)研究證實(shí)中醫(yī)藥治療FD療效明顯，且不良反應(yīng)較少[3,6-8]。

中醫(yī)雖無(wú)FD之名，但根據(jù)FD的癥狀，可將該病歸屬于“痞滿”“積滯”“胃脘痛”等范疇，其基本病機(jī)多以脾虛為本，氣滯為標(biāo)，治療則多以健脾和胃，溫中散寒為主[9]。黃芪建中湯是《金匱要略》中治療“虛勞諸不足”的經(jīng)典方劑，具有溫中補(bǔ)虛，緩急止痛之功。有多項(xiàng)研究顯示，該方治療脾胃氣虛型FD臨床療效顯著[10-13]。因此，探究其分子作用機(jī)制十分必要。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可揭示中藥成分和靶點(diǎn)之間的協(xié)同作用機(jī)制，為客觀評(píng)價(jià)和優(yōu)化中藥復(fù)方的療效性提供關(guān)鍵技術(shù)支撐，同時(shí)有助于推動(dòng)中醫(yī)從經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)向循證醫(yī)學(xué)的創(chuàng)新性轉(zhuǎn)變[14]。分子對(duì)接技術(shù)可體現(xiàn)藥物成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，對(duì)所獲得的潛在作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果提供一定的客觀依據(jù)。目前，關(guān)于黃芪建中湯是通過(guò)哪些通路以發(fā)揮治療FD的作用，仍未有相關(guān)報(bào)道。本研究將通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，初步探索黃芪建中湯治療FD的分子作用機(jī)制，為該方治療FD及后續(xù)深入研究提供一定的理論依據(jù)。

1 方法

1.1 黃芪建中湯有效成分及靶點(diǎn)的收集與篩選

本研究通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），檢索黃芪建中湯的有效活性成分。因該數(shù)據(jù)庫(kù)中暫缺“飴糖”的相關(guān)成分，亦未在TCMID （http://www.megabionet.org/tcmid/）檢索到，故本研究未將其納入。以口服利用度≥30%，類藥性≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選；運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化匹配。

1.2 黃芪建中湯治療FD相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

運(yùn)用OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://genecards.org/）及Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://go.drugbank.com/）對(duì)FD的相關(guān)基因進(jìn)行檢索，獲取疾病基因與黃芪建中湯的藥物基因的交集靶點(diǎn)；利用Cytoscape 3.7.1繪圖軟件繪制中藥—成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將黃芪建中湯治療FD的靶點(diǎn)導(dǎo)入String（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)為“Homo Sapiens”，獲取蛋白—蛋白相互作用（protein proteininteraction，PPI）關(guān)系；運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖；借助R 4.0.0軟件繪制核心靶點(diǎn)蛋白PPI條形圖。

1.4 富集分析

通過(guò)微生信在線繪圖工具（https://www.bioinformatics.com.cn）對(duì)黃芪建中湯與FD的交集基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.5 分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證

選取PPI結(jié)果中排名前5的核心靶點(diǎn)蛋白，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）獲取靶點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)；利用PyMOL 2.4.0軟件對(duì)蛋白去水、切除配體，使用Auto Docks Tools 1.5.6軟件對(duì)其進(jìn)行加氫處理；通過(guò)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載對(duì)應(yīng)活性成分的2D結(jié)構(gòu)。運(yùn)行AutoDock進(jìn)行分子對(duì)接，借助PyMOL 2.4.0軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，以對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 黃芪建中湯的潛在活性成分及靶點(diǎn)

將TCMSP數(shù)據(jù)中檢索到的成分進(jìn)行去重，共得到有效活性成分122種；將UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去重，共有248個(gè)。各個(gè)中藥成分和靶點(diǎn)數(shù)量具體見(jiàn)表1。

表1 中藥—成分—靶點(diǎn)基本信息統(tǒng)計(jì)

2.2 黃芪建中湯治療FD的相關(guān)靶點(diǎn)

以“Functional Dyspepsia”為檢索詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中得到2523個(gè)靶點(diǎn)，在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得13個(gè)，在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)得到2個(gè)，經(jīng)去重，最終共得到2533個(gè)基因。將FD基因與黃芪建中湯中的基因取交集，相交基因共有155個(gè)，具體見(jiàn)圖1。將相關(guān)藥物、成分、靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制中藥—成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，共得到378個(gè)節(jié)點(diǎn)，3078條邊，見(jiàn)圖2。圖中三角形代表藥物，圓形代表藥物的有效活性成分（其中深藍(lán)色圓形為藥物之間的共有成分），菱形代表靶點(diǎn)基因；圖中圖形大小代表degree值的高低。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

在String數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入黃芪建中湯治療FD的相關(guān)靶點(diǎn)，設(shè)最低要求互動(dòng)得分為0.4，將其PPI關(guān)系以TSV格式文件導(dǎo)出；應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。圖中圓形的大小和顏色深淺與度值成正相關(guān)。利用R 4.0.0軟件作PPI條形圖，按度值排序，排名前5的蛋白分別為蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤蛋白53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素6（IL-6）、胱天蛋白酶3（CASP3）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA），具體見(jiàn)圖4。

2.4 富集分析

對(duì)黃芪建中湯治療FD的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，如圖5。圖中圖形的顏色與P值功能富集的顯著性密切相關(guān)，圖形的大小與功能的靶點(diǎn)數(shù)目成正相關(guān)。結(jié)果顯示，黃芪建中湯治療FD的機(jī)制主要與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)控、細(xì)胞成分的正向調(diào)控、激素反應(yīng)及無(wú)機(jī)物反應(yīng)有關(guān)。對(duì)黃芪建中湯治療FD的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，將顯著性排名前15的通路進(jìn)行結(jié)果展示，見(jiàn)圖6。圖中圓形顏色越深，P值功能富集的顯著性越大；圓形越大，該功能富集的靶點(diǎn)數(shù)目越多。由圖可知，黃芪建中湯治療FD主要與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路、晚期糖基化終產(chǎn)物—糖基化終產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）通路有關(guān)。

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

將PPI結(jié)果中排名前5的核心靶點(diǎn)蛋白（AKT1、TP53、TNF、IL-6、CASP3、VEFGA）與相應(yīng)的化合物（槲皮素、柚皮素、山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素）進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為，結(jié)合能<-5kcal/mol時(shí)，提示靶點(diǎn)與分子之間結(jié)合活性較好。結(jié)果顯示，有超過(guò)3/4的結(jié)合能<-5.0 kcal/mol，表明本研究中靶點(diǎn)與相應(yīng)成分結(jié)合活性較好，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果較為可靠；其中槲皮素、柚皮素、山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇可能是黃芪建中湯治療FD的主要有效活性成分，具體見(jiàn)表2。在各種對(duì)接方式中，以β-谷甾醇與CASP3結(jié)合活性最強(qiáng)，其次是芍藥苷與TNF、芍藥苷與IL-6，對(duì)接結(jié)果展示圖見(jiàn)圖7。

表2 核心靶點(diǎn)蛋白與活性成分分子對(duì)接結(jié)合能

3 討論

根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果可知，槲皮素、柚皮素、山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇與相應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合活性較好，可能是黃芪建中湯治療FD的主要有效活性成分。研究表明，槲皮素可獨(dú)立于一氧化氮途徑，直接通過(guò)調(diào)控鉀離子ATP通道而誘導(dǎo)胃腸平滑肌松弛，從而發(fā)揮改善胃腸肌肉運(yùn)動(dòng)障礙，治療功能性消化不良的作用[15]。柚皮素可減輕焦慮樣行為障礙，考慮可能與改善線粒體功能，增強(qiáng)外核苷酸酶和乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)[16]。山奈酚具有較強(qiáng)的抗炎活性，可對(duì)抗幽門螺桿菌引起的炎癥反應(yīng)，考慮可能與該成分能夠下調(diào)促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-8等）的表達(dá)以及抑制幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A (CagA) 和空泡化細(xì)胞毒素A (VacA) 易位有關(guān)[17]。芍藥苷具有促胃腸動(dòng)力的作用，這可能與提高胃促生長(zhǎng)素和胃動(dòng)素水平有關(guān)；同時(shí)，該成分又可發(fā)揮類似氟西汀的抗抑郁作用，其機(jī)制可能與升高血漿超氧化物歧化酶和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，降低血漿丙二醛及海馬一氧化氮等有關(guān)[18]。β-谷甾醇同樣亦可發(fā)揮抗抑郁作用，其機(jī)制可能與調(diào)控5-羥色胺、多巴胺及γ氨基丁酸等有關(guān)[19]；亦有研究表明，但該作用需經(jīng)過(guò)酯化衍生化處理，增加脂溶性后才可實(shí)現(xiàn)[20]。綜上，以上5個(gè)成分可能是黃芪建中湯治療FD的物質(zhì)基礎(chǔ)。

由PPI結(jié)果可知，TP53、IL-6、TNF、AKT1、VEFGA、CASP3為黃芪建中湯治療FD的核心靶點(diǎn)。TP53是目前已知與人類腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因，有研究表明該基因多態(tài)性可增加幽門螺桿菌感染者發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)，且與病理分級(jí)有關(guān)[21]。TNF作為受關(guān)注度較高的炎癥因子之一，同樣與幽門螺桿菌感染密切相關(guān)，嚴(yán)重者可致胃黏膜屏障受損，發(fā)展為胃潰瘍[22]。IL-6作為另一重要的炎癥因子，與胃腸功能有一定的相關(guān)性。研究表明，IL-6水平與FD患者焦慮、抑郁評(píng)分成正相關(guān)性，臨床中應(yīng)重視此指標(biāo)的檢測(cè)[23]。AKT1與組織細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及存活密切相關(guān)，激活后可加速炎癥反應(yīng)，考慮可能與幽門螺桿菌感染有關(guān)；另外，該靶點(diǎn)雖有抗抑郁作用[24]，但目前仍無(wú)黃芪建中湯抗抑郁的相關(guān)機(jī)制研究。VEGF具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增長(zhǎng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。研究表明VEGF與抗抑郁療效之間可能存在一定的相關(guān)性，其水平偏低，抑郁核心癥狀程度越重，可能是潛在的療效指標(biāo)[25]。CASP3作為細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵酶，是白芍的作用靶點(diǎn)之一，亦與抗抑郁相關(guān)[26]，但目前尚需更深層次的研究。經(jīng)分子對(duì)接驗(yàn)證，以上靶點(diǎn)與黃芪建中湯成分結(jié)合活性較好，可能在治療FD方面發(fā)揮著主要作用，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性。

根據(jù)GO功能富集分析可知，黃芪建中湯治療FD主要與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)控、細(xì)胞成分的正向調(diào)控及激素反應(yīng)等生物過(guò)程有關(guān)，體現(xiàn)了其治療過(guò)程的多樣性。由KEGG通路富集分析可知，黃芪建中湯治療FD的機(jī)制主要與AGE-RAGE通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與幽門螺桿菌存在密切的關(guān)系，即動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在幽門螺桿菌，而幽門螺桿菌又可通過(guò)增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，加劇冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度[27,28]，故臨床中應(yīng)將抗動(dòng)脈粥樣硬化與抗幽門螺桿菌協(xié)同治療，齊頭并進(jìn)，以起到較好的療效。AGEs和RAGE與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂和內(nèi)皮的損傷密切相關(guān)[29]，而AGEs又與動(dòng)脈僵硬度相關(guān)，是冠狀動(dòng)脈疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[30]；剪切應(yīng)力是作用于血管腔表面的摩擦阻力，過(guò)高或過(guò)低均可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[31,32]；脂質(zhì)代謝紊亂亦是動(dòng)脈粥樣硬化病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[33]。因此，動(dòng)脈粥樣硬化是黃芪建中湯治療FD的關(guān)鍵性機(jī)制，而以上3條通路均與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)聯(lián)密切，間接參與FD的發(fā)病，但目前仍無(wú)較為直接的相關(guān)性研究，今后可嘗試從此通路進(jìn)一步加深對(duì)FD的研究。此外，從中醫(yī)角度亦可解釋以上3條通路與FD的關(guān)系。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的中醫(yī)病因可歸屬于“虛”“痰”“瘀”[34]，氣虛不足以推動(dòng)津血運(yùn)行，致津聚為痰，氣機(jī)不暢，瘀血阻絡(luò)，這與FD“脾虛為本，氣滯為標(biāo)”的病機(jī)極為相似?！督饏T要略·血痹虛勞篇》云：“虛勞里急，諸不足，黃芪建中湯主之”，故以補(bǔ)虛為根本治則，采用黃芪建中湯治療FD具有一定的中醫(yī)理論依據(jù)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)，初步探討了黃芪建中湯治療FD的分子作用機(jī)制。黃芪建中湯治療FD的主要有效活性成分可能是槲皮素、柚皮素、山奈酚、芍藥苷、β-谷甾醇，該方可能通過(guò)調(diào)控AGERAGE通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路，作用于TP53、IL-6、TNF、AKT1、VEFGA、CASP3等核心靶點(diǎn)，而促胃動(dòng)力、抗幽門螺桿菌、改善焦慮抑郁狀態(tài)，最終發(fā)揮治療FD的作用。因目前關(guān)于黃芪建中湯治療FD的相關(guān)機(jī)制研究較少，本課題組今后將參考網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，設(shè)計(jì)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)行更深層次的機(jī)制研究。