趙權(quán)宇

（南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211816）

碳減排是關(guān)乎全球長遠(yuǎn)穩(wěn)定發(fā)展的重大挑戰(zhàn)［1］。因此，必須降低大氣中的CO2濃度，嚴(yán)格控制全球溫度的上升在2℃［2］，甚至1.5℃以內(nèi)［3］。繼簽訂《京都議定書》后，我國政府于2020年9月鄭重宣布了“CO2排放力爭(zhēng)于2030年前達(dá)到峰值，努力爭(zhēng)取2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和”的減碳目標(biāo)。化學(xué)、物理和生物學(xué)方法均可進(jìn)行CO2的封存和利用。在自然界，有6條天然的生物固碳途徑［4］。其中，Calvin循環(huán)是光驅(qū)動(dòng)的好氧固碳途徑，廣泛存在于地球上的高等植物和藻類中。英國牛津大學(xué)和美國加州大學(xué)等單位的科學(xué)家在Nature共同撰文評(píng)價(jià)CO2減排的10條途徑，微藻產(chǎn)品是其中之一［5］。為早日達(dá)成碳中和目標(biāo)，研發(fā)微藻基生物減排技術(shù)大有可為。

微藻通過光合作用固定CO2，在脅迫條件下富集油脂或淀粉等，是高效的光合細(xì)胞工廠。近10年來，微藻生物技術(shù)在生物燃料等領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注［6］。研究者在藻種選育、光生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)及大規(guī)模培養(yǎng)［7-8］、微藻收獲［9］等方面都取得了長足進(jìn)步。然而，開發(fā)微藻基負(fù)碳途徑還需要克服一些技術(shù)瓶頸［10-12］。微藻生物燃料的生產(chǎn)成本仍然較高，用水量大，占用土地廣，這極大限制了其產(chǎn)業(yè)化步伐。多數(shù)微藻不能耐受超過2%的CO2，而工業(yè)煙道氣中除了10%～25%的CO2，還有NOx和SOx等污染物，這些煙道氣組分都會(huì)抑制微藻生長［13］。藻種選育是微藻固碳技術(shù)路線的起點(diǎn)，藻株強(qiáng)化后有助于達(dá)到穩(wěn)定固碳的目標(biāo)。為解決微藻產(chǎn)業(yè)化層面的問題，可以利用廢水資源解決微藻培養(yǎng)中的水需求，可以通過生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提高經(jīng)濟(jì)性［14-15］。

除了不斷發(fā)現(xiàn)新的天然固碳途徑［16］，合成生物學(xué)是強(qiáng)化微藻CO2固定、廢水處理和高附加值產(chǎn)品研發(fā)，構(gòu)建微藻基碳中和途徑的強(qiáng)大工具。萊茵衣藻［17-18］、三角褐指藻［19-20］和微擬球藻［21-22］等的基因工程改造已經(jīng)成為可能，然而利用合成生物學(xué)手段進(jìn)行其他真核微藻的途徑重構(gòu)或基因工程改造仍是困難的。很多具有應(yīng)用潛力的微藻來自野外篩選，還沒有進(jìn)行基因組測(cè)序，基因工程改造成功率低。并且，多數(shù)環(huán)境耐受性并不是簡(jiǎn)單地由單個(gè)基因控制，多靶點(diǎn)的基因改造難度更大。適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（ALE）是合成生物學(xué)的重要手段［23-24］，已經(jīng)成功用于細(xì)菌、酵母和藻類的菌/藻種選育［25-26］。通過進(jìn)化工程手段可以提高微藻對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性［27］。其中，開發(fā)高附加值產(chǎn)品可提高微藻生物固碳過程的經(jīng)濟(jì)性，尚需利用合成生物學(xué)手段調(diào)控或構(gòu)建新的代謝途徑。微藻是良好的光合固碳底盤，本文將就面向碳中和目標(biāo)的微藻適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化進(jìn)行綜述。

1 微藻適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的基本流程

適應(yīng)進(jìn)化可以不通過基因工程手段而活化潛在途徑、強(qiáng)化特定代謝表型或提高環(huán)境適應(yīng)能力。自然界的生命體在長期演變中為適應(yīng)環(huán)境變化存在自然選擇，由此產(chǎn)生適應(yīng)進(jìn)化。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，微生物的適應(yīng)進(jìn)化實(shí)驗(yàn)可以作為研究進(jìn)化的工具，也可以作為開發(fā)工業(yè)新菌株的手段［28-29］。

微藻ALE的效率取決于初始藻株的種類、微藻的初始細(xì)胞密度和進(jìn)化策略等（圖1）。初始藻株需具備一定的生長、抗逆或高產(chǎn)的基礎(chǔ)及潛力。微藻的細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)體積和每次更新的體積等與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，也影響突變?cè)逯甑暮Y選效率。ALE可為連續(xù)培養(yǎng)模式，也可為間歇培養(yǎng)模式。適應(yīng)進(jìn)化的常用方法是培養(yǎng)微生物達(dá)到一定的指標(biāo)后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。不斷重復(fù)這個(gè)過程直至代謝表型趨于穩(wěn)定，獲得進(jìn)化藻株。ALE的進(jìn)化策略包括脅迫策略和非脅迫策略。需要指出的是，脅迫策略是常見的構(gòu)建抗逆藻株的途徑，而非脅迫策略在不抑制生長的條件下，改善生長表型，并提高油脂等的累積［30］。基于化學(xué)調(diào)節(jié)劑的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（CM-ALE）用于改善隱甲藻的脂質(zhì)生成［31］。化學(xué)調(diào)節(jié)劑抑制特定細(xì)胞內(nèi)酶的活性，是一種調(diào)節(jié)碳分配的化學(xué)脅迫，顯著提高微藻的脂質(zhì)生產(chǎn)。因此，CM-ALE是構(gòu)建微藻進(jìn)化菌株的有效策略。在適應(yīng)進(jìn)化中利用富里酸定向調(diào)控多不飽和脂肪酸的累積也取得了進(jìn)展［32］?；瘜W(xué)調(diào)節(jié)劑可在不抑制微藻生長的條件下，定向調(diào)控微藻目標(biāo)產(chǎn)物的合成，是目前的研究熱點(diǎn)。改變微藻ALE的藻種選擇、基本條件和進(jìn)化策略，可能會(huì)獲得不同的進(jìn)化藻株。微藻的基因突變也是隨機(jī)的。即使ALE的環(huán)境脅迫條件相同，同一個(gè)出發(fā)藻株經(jīng)過不同的ALE也會(huì)產(chǎn)生不同的進(jìn)化藻株。即使這些進(jìn)化藻株的耐受性或進(jìn)化表型相近，其突變基因也存在差異。

圖1 微藻ALE的基本流程Fig.1 Basic procedure of ALE for microalgae

2 微藻適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的基本方法

“物競(jìng)天擇，適者生存”是自然界的普遍規(guī)律。適應(yīng)是能順應(yīng)環(huán)境脅迫，或同種或異種生物的競(jìng)爭(zhēng)，最后能生存下來的都屬于進(jìn)化后的“強(qiáng)者”。這也是自然界物種不斷演變和極大豐富的原因。在實(shí)驗(yàn)室保存的萊茵衣藻也出現(xiàn)了代謝表型的變化［33］。更多的是自然界中響應(yīng)環(huán)境脅迫出現(xiàn)的突變?cè)逯?。在意大利Bossoleto二氧化碳泉附近的空氣中CO2的濃度可達(dá)1080～2160 mg/m3［34］，該地的藻株可以耐受3600 mg/m3的CO2。原則上，研究用的藻株都直接或間接來源于自然界，有些在篩選和純化后進(jìn)行過誘變等改造。從極端環(huán)境等篩選藻株往往具有高耐受性，但是篩選工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為了獲得可以耐受更高濃度CO2或其他脅迫條件的藻株，ALE是可行的改善微藻代謝表型的技術(shù)途徑。從適應(yīng)進(jìn)化或馴化的時(shí)間尺度上，可以將ALE分為短期馴化和長期進(jìn)化。

2.1 短期馴化

有些研究發(fā)現(xiàn)，2～19 d左右的短期馴化就可以獲得耐受酸性、高光強(qiáng)、高濃度CO2、高氨氮、高溫和高鹽度等環(huán)境脅迫的藻株。微藻短期馴化的基本條件和時(shí)間等總結(jié)于表1。相對(duì)來說，長期ALE比短期馴化可以獲得更穩(wěn)定和更具耐受性的藻株。經(jīng)過257 d（1255代）獲得的進(jìn)化萊茵衣藻藻株在0.2 mol/L NaCl的生長高于短期馴化（2 d）的藻株［41］。需要考慮兩個(gè)問題，短期馴化能否強(qiáng)化耐受表型，以及耐受表型能否穩(wěn)定遺傳。短期馴化能否成功，還要綜合考慮藻株和脅迫條件。高鹽［42］或煙道氣［43］等環(huán)境脅迫不能短期獲得耐受性，只能采取分段ALE。ALE包括出現(xiàn)不同耐受性突變株，以及高耐受藻株在不同周期中的逐步富集和低耐受株逐步被淘汰的過程（圖2）。短期馴化的藻株能否穩(wěn)定遺傳還需要更長期的考察。有必要對(duì)短期馴化和長期進(jìn)化的藻株進(jìn)行系統(tǒng)分析，探索相關(guān)的機(jī)制問題。

表1 微藻的短期馴化Tab.1 Short-term acclimation for microalgae

2.2 長期進(jìn)化

長期進(jìn)化是獲得穩(wěn)定進(jìn)化藻株的有效方式。一般來說，微藻在自養(yǎng)條件下生長速度比大腸桿菌或釀酒酵母等微生物在異養(yǎng)條件下慢，在環(huán)境脅迫條件下生長周期更長。微藻中的整個(gè)適應(yīng)進(jìn)化過程可能需要3個(gè)月到2年以上的時(shí)間。因此，提高適應(yīng)進(jìn)化的效率非常重要。微藻長期進(jìn)化的內(nèi)容總結(jié)于表2。為了提高對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，適應(yīng)進(jìn)化中的初始生物質(zhì)濃度可能需要0.5～0.8 g/L［57］，每個(gè)循環(huán)（cycle）只能增殖2～3代（generation）。整個(gè)適應(yīng)進(jìn)化周期增殖代數(shù)少，適應(yīng)進(jìn)化效率低。一般來說，大腸桿菌或釀酒酵母等微生物的適應(yīng)進(jìn)化都在500～2000代。微藻的單一適應(yīng)進(jìn)化周期1～21 d不等［32，52］。因?yàn)樵诃h(huán)境脅迫條件下微藻生長受到抑制，每個(gè)周期的最終細(xì)胞密度有限。因此，每個(gè)周期的增殖世代數(shù)可能會(huì)很低。為了獲得穩(wěn)定的藻株，總增殖代數(shù)是比總周期數(shù)更關(guān)鍵的評(píng)價(jià)指標(biāo)［27］。提高適應(yīng)進(jìn)化效率還有一些新的方法。物理和化學(xué)誘變將帶來隨機(jī)的堿基突變，而適應(yīng)進(jìn)化過程是對(duì)誘變后藻株的再篩選，并修復(fù)誘變帶來的細(xì)胞損傷［58-59］。Kondo教授等［50］結(jié)合適應(yīng)進(jìn)化和誘變的新方法，雖然接種生物質(zhì)濃度只有0.02 g/L，84 d后就獲得了耐鹽藻株。除了對(duì)純微藻的馴化，也有研究采用了對(duì)微藻群落的ALE，這樣得到的進(jìn)化藻株更接近實(shí)際應(yīng)用的需要。經(jīng)過幾個(gè)月的適應(yīng)進(jìn)化，微藻群落可以耐受30% CO2，并在火力發(fā)電廠進(jìn)行了側(cè)線測(cè)試［60］。需要注意的是，ALE的時(shí)間并非越長越好，進(jìn)化70 d得到的進(jìn)化株其生長和油脂含量等指標(biāo)就略優(yōu)于進(jìn)化80 d得到的進(jìn)化株［61］。為了提高ALE的效率，目前已經(jīng)建立了微滴培養(yǎng)系統(tǒng)的高通量ALE策略［62-63］。

3 微藻適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的應(yīng)用

3.1 CO2固定

微藻培養(yǎng)的CO2來源可以來自空氣或者煙道氣等工業(yè)廢氣。一般來說，一個(gè)藻株有最佳的CO2培養(yǎng)濃度。如果不能耐受高濃度CO2，可以通過ALE強(qiáng)化其對(duì)低pH的耐受并改善固碳能力。以10%或

20%CO2為脅迫壓力，選擇一株野外分離的小球藻為出發(fā)藻株，經(jīng)過30個(gè)周期分別獲得了兩株進(jìn)化藻株，AE10和AE20［64］。這兩株進(jìn)化藻株在1%～30% CO2條件下均能高效固碳，而且AE10的固碳能力要強(qiáng)于AE20。這也說明，適當(dāng)?shù)拿{迫壓力是ALE成功的關(guān)鍵之一，并非脅迫壓力越大獲得的進(jìn)化藻株越好。煙道氣中的NOx和SOx在微藻培養(yǎng)基中累積，會(huì)快速降低培養(yǎng)基pH，同時(shí)也會(huì)存在鹽離子毒性。選擇經(jīng)過一次ALE的進(jìn)化藻株AE10作為新的出發(fā)藻株，以模擬煙道氣作為脅迫壓力，分5段遞增模擬煙道氣濃度進(jìn)行適應(yīng)進(jìn)化后，獲得了新的進(jìn)化藻株Cv（二次進(jìn)化藻株），可以耐受10%CO2、200 mL/m3NOx和100 mL/m3SOx［43］，為微藻直接利用煙道氣進(jìn)行固碳提供了可能。需要指出的是，工業(yè)煙道氣中還含有其他痕量污染物，對(duì)微藻也存在抑制作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)化藻株AE10是通過10%CO2作為脅迫壓力經(jīng)過ALE獲得的，但是AE10具有耐受高光強(qiáng)［65］和20 g/L NaCl［42］的多種抗逆性能，再經(jīng)過兩段適應(yīng)進(jìn)化，獲得了可以耐受30 g/L NaCl的進(jìn)化藻株S20［36］。從一個(gè)淡水藻株，到一個(gè)可以在海水中生長并快速固碳的藻株，ALE發(fā)揮了重要作用。

3.2 廢水處理

微藻培養(yǎng)需要大量的水，而工農(nóng)業(yè)廢水和城市污水中含有一定濃度的氮、磷，是微藻培養(yǎng)必需的營養(yǎng)元素。利用廢水培養(yǎng)微藻可以構(gòu)建綠色生態(tài)循環(huán)，也有助于實(shí)現(xiàn)雙碳目標(biāo)。高濃度苯酚會(huì)抑制微藻生長，出發(fā)藻株L3經(jīng)過90 d的ALE，進(jìn)化后的小球藻藻株L5可以去除500～700 mg/L的苯酚［57］。ALE也成功用于強(qiáng)化球等鞭金藻（I.galbanaParke）對(duì)苯酚的耐受性［51］。先在100 mg/L苯酚的脅迫下進(jìn)化90 d，得到進(jìn)化藻株P(guān)AS-1，再在200 mg/L苯酚的脅迫下進(jìn)化90 d，得到PAS-2。PAS-1和PAS-2可以分別耐受200 mg/L和300 mg/L的苯酚。并且，這兩個(gè)進(jìn)化藻株均可在5 d完全去除200 mg/L的苯酚。從垃圾滲濾液中分離得到藻菌菌群，經(jīng)過2年的ALE，群落中小球藻的生長速率提高了兩倍，硝態(tài)氮和氨氮均可去除［53］。廢水和污水中往往含有細(xì)菌等微生物，開放式培養(yǎng)更是無法做到完全無菌，菌群的適應(yīng)進(jìn)化可以構(gòu)建更具魯棒性的培養(yǎng)系統(tǒng)［66-67］。廢水中一定濃度的有毒有害物質(zhì)，對(duì)微藻構(gòu)成脅迫。有可能通過ALE強(qiáng)化耐受性并高效去除這些污染物。廢水的種類眾多，污染物的種類和濃度也千差萬別，ALE用于強(qiáng)化微藻廢水處理藻株的研究還有必要進(jìn)一步深入。

3.3 表型強(qiáng)化

表型強(qiáng)化包括強(qiáng)化生長表型和強(qiáng)化代謝表型。野生型大腸桿菌的生物質(zhì)合成只能達(dá)到理論計(jì)算值的40%～60%。剛剛構(gòu)建的單基因敲除突變體甚至無法正常生長。這些突變體經(jīng)過適應(yīng)進(jìn)化，生物質(zhì)合成或代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等均會(huì)顯著增加，與基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果接近［68］。微藻固碳之后，細(xì)胞內(nèi)將進(jìn)行碳分配，調(diào)控獲得更多的油脂或糖。理論上，抑制糖合成將提高油脂的累積。但是，經(jīng)誘變獲得的兩株萊茵衣藻糖合成缺陷突變株的油脂含量并未顯著提高［30］。在最佳生長條件下，以該兩株藻作為出發(fā)藻株，經(jīng)過84 d的ALE，進(jìn)化后藻株的生長均得到強(qiáng)化。并且，其中一進(jìn)化藻株在缺氮條件下的油脂含量與進(jìn)化前相比提升了將近1倍。ALE除了強(qiáng)化了生長，對(duì)油脂［69］和色素的合成［46-47］也有促進(jìn)作用。環(huán)境脅迫條件將在微藻胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基，并調(diào)控碳分配向DHA等多不飽和脂肪酸［54-56］。微藻油脂等高附加值產(chǎn)品的累積往往通過培養(yǎng)過程的環(huán)境脅迫來獲得，但是環(huán)境脅迫會(huì)限制微藻生長。如果采取兩段法，第一段生長，第二段油脂或糖等累積，兩段法的總體時(shí)間過長會(huì)降低產(chǎn)率［65］。如果通過ALE獲得進(jìn)化藻株，可以既不抑制微藻生長，又高產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，將進(jìn)一步提高微藻固碳技術(shù)途徑的可行性。

4 微藻適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的機(jī)制分析與合成生物學(xué)

4.1 機(jī)制分析

進(jìn)化前后的藻株在生理生化［70］、基因水平［71］、轉(zhuǎn)錄水平［72-73］、代謝物濃度［45］和表觀遺傳［58］等方面均存在差異。出發(fā)藻株和進(jìn)化藻株的比較組學(xué)分析有利于理解進(jìn)化藻株對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)與耐受機(jī)制［74］。微生物的適應(yīng)進(jìn)化多數(shù)是點(diǎn)突變，進(jìn)化前后的菌株只在1～80 bp堿基上存在差異，只有在個(gè)別情況下是大片段基因變化造成的表型差異［75］。而且，可能有多個(gè)基因型具有相似的表型。釀酒酵母耐受鹽酸和乳酸的研究也表明有多個(gè)途徑都可以實(shí)現(xiàn)耐酸表型［76］。藻類的基因組比微生物大得多，基因注釋也不完善。適應(yīng)進(jìn)化前后比較基因組學(xué)研究將從根本上揭示適應(yīng)進(jìn)化的分子機(jī)制。此外，需要從熱力學(xué)等角度認(rèn)識(shí)適應(yīng)進(jìn)化過程。黃和等［54-56］構(gòu)建了多個(gè)裂殖壺菌的進(jìn)化株。綜合分析這些裂殖壺菌適應(yīng)進(jìn)化藻株的發(fā)酵過程。結(jié)果表明，DHA發(fā)酵過程的有效能效率與生物量產(chǎn)率存在線性關(guān)系（R2=0.8044），說明適應(yīng)進(jìn)化可以通過強(qiáng)化生長表型提高DHA有效能效率，為進(jìn)一步通過適應(yīng)進(jìn)化提高DHA發(fā)酵性能提供參考［77］。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以在全基因組尺度比較出發(fā)藻株和進(jìn)化藻株的實(shí)時(shí)差異。光合作用對(duì)微藻生長具有重要影響。一般的環(huán)境脅迫可能會(huì)對(duì)光合系統(tǒng)活性造成損傷，使得微藻的生長受到抑制。對(duì)比耐受苯酚進(jìn)化藻株L5和出發(fā)藻株L3，比較轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明適應(yīng)進(jìn)化確實(shí)強(qiáng)化了代謝網(wǎng)絡(luò)中多數(shù)基因［70］。但是苯酚的存在仍會(huì)下調(diào)光合作用、氧化磷酸化和部分氨基酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)。耐受苯酚的機(jī)制來源于光合作用、抗氧化酶和色素合成等相關(guān)基因的上調(diào)［70，78］。對(duì)可耐受30 g/L的鹽的適應(yīng)進(jìn)化藻株S30和AE10進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組分析［42］。結(jié)果表明，高鹽度嚴(yán)重影響光合作用、氧化磷酸化、脂肪酸合成和酪氨酸合成代謝，相關(guān)基因顯著下調(diào)?？寡趸浮O2固定、部分氨基酸代謝、中心碳代謝和ABC傳遞系統(tǒng)顯著上調(diào)。值得注意的是，除了C3固碳途徑，C4固碳途徑和景天酸代謝途徑的基因都顯著上調(diào)。這說明相關(guān)途徑與耐鹽相關(guān)。耐受模擬煙道氣的進(jìn)化藻株Cv在模擬煙道氣和10%CO2中的比較轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中顯著變化的基因僅有495個(gè)，集中在光合作用、氧化磷酸化和氨基酸代謝等代謝途徑中［43］。進(jìn)化藻株Cv在模擬煙道氣中通過上調(diào)光合作用、氧化磷酸化、氮還原和硫代謝中cysA基因，快速利用氮和硫，防止溶解在培養(yǎng)基中的NOx和SOx降低pH，保護(hù)微藻光合系統(tǒng)。耐受苯酚［70］、鹽［42］和模擬煙道氣［43］的適應(yīng)進(jìn)化轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)制研究結(jié)果表明，耐受性均涉及光合系統(tǒng)、抗氧化等多個(gè)代謝途徑中多個(gè)基因的顯著變化，進(jìn)行多基因的合成生物學(xué)改造存在困難。經(jīng)過650天ALE得到可耐受高濃度葡萄糖的寇氏隱甲藻（C.cohnii）進(jìn)化藻株［52］。代謝組學(xué)分析結(jié)果表明，甘油、谷氨酸、丙二酸和琥珀酸是中樞代謝物。這些組學(xué)分析獲得了微藻的一些代謝調(diào)控規(guī)律和耐受機(jī)制，比較基因組學(xué)的研究可以獲得更多基因或元件信息，為合成生物學(xué)改造提供借鑒。

4.2 進(jìn)化工程的動(dòng)態(tài)研究

為深入理解適應(yīng)進(jìn)化的機(jī)制，需要考察適應(yīng)進(jìn)化的動(dòng)態(tài)過程。在ALE過程中，隨著周期的增加，產(chǎn)生不同的突變株，而且突變株種群也在不斷變化（圖2）。在環(huán)境脅迫條件下，能夠適應(yīng)的突變將保存下來，并在種群內(nèi)部占據(jù)主體，最后可能得到單一突變體，或者得到幾個(gè)突變體的組合。如果能快速鑒別和篩選這些高耐受突變體，將顯著提高ALE效率。在提高耐受性的ALE中，環(huán)境脅迫壓力是主要的篩選條件，如果是面向提高生長和代謝物高產(chǎn)表型的ALE，則需要研發(fā)有針對(duì)性的檢測(cè)指標(biāo)或生物傳感器。

為了更好地理解ALE的動(dòng)態(tài)過程，已經(jīng)開發(fā)一個(gè)ALE的優(yōu)化程序，ALEsim［79］，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)和優(yōu)化ALE提供了工具。ALEdb 1.0則是一個(gè)微生物ALE的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫［80］，該數(shù)據(jù)庫包含11000個(gè)突變體的信息。通過以往這些ALE的成功實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以更精準(zhǔn)地設(shè)計(jì)微藻ALE過程。需要注意的是，部分文獻(xiàn)中關(guān)于ALE過程的描述不夠細(xì)致，或者根本沒提供ALE過程的詳細(xì)數(shù)據(jù)，很難進(jìn)行系統(tǒng)比較。這也要求在微藻的ALE實(shí)驗(yàn)中采集足夠的信息，為今后的分析打下基礎(chǔ)。更需要從酵母［81-83］或細(xì)菌的ALE中借鑒經(jīng)驗(yàn)，完善微藻ALE的設(shè)計(jì)［24，83］。

4.3 合成生物學(xué)在ALE中的應(yīng)用

近年來，合成生物學(xué)在基因組編輯［84-86］、代謝調(diào)控［87-88］等方面都有了突破性進(jìn)展。合成生物學(xué)和進(jìn)化工程結(jié)合［89］，將提高微藻ALE的效率，構(gòu)建更有抗逆性和固碳能力的藻株。

ALE為合成生物學(xué)提供新的抗逆基因或元件。ALE后獲得的進(jìn)化藻株中存在一定的基因突變，通過比較基因組學(xué)等手段可以獲得潛在的抗逆基因或代謝工程改造的候選基因。相關(guān)元件的挖掘?qū)檫M(jìn)一步的合成生物學(xué)改造提供參考［90］。生物元件是合成生物學(xué)的基本要素之一［91］。目前，利用比較基因組學(xué)等手段，獲得了微藻耐受低溫等的基因和元件信息。在極地雪藻（Chlamydomonas nivalis）從22℃轉(zhuǎn)到4℃培養(yǎng)時(shí)，12個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和3個(gè)RNA鍵合蛋白出現(xiàn)顯著變化，積極調(diào)控微藻進(jìn)行響應(yīng)［92］。通過基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等多組學(xué)數(shù)據(jù)全面分析了可在接近0℃生長的小球藻的基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白等水平的差異，進(jìn)一步的發(fā)掘?qū)?huì)獲得新穎的生物元件［93］。通過合成生物學(xué)手段強(qiáng)化光合系統(tǒng)效率，對(duì)微藻的藻種改造至關(guān)重要［94］。在藍(lán)藻中獲得的相關(guān)元件也可為真核微藻借鑒。

從進(jìn)化藻株篩選的候選抗逆基因等還需要進(jìn)行驗(yàn)證。已從自然進(jìn)化的藻株中發(fā)現(xiàn)了基因變異［71，95］。在低濃度CO2的環(huán)境中，微囊藻（Microcystis）的無機(jī)碳利用基因以bicA+sbtA為主。當(dāng)CO2濃度增加，則以bicA為主［95］。在模式微生物中發(fā)現(xiàn)候選抗逆基因，通過合成生物學(xué)手段改造微生物，再通過ALE強(qiáng)化表型是比較成熟的菌種改造路線。比如，檸檬烯會(huì)抑制解脂耶氏酵母生長，造成檸檬酸產(chǎn)量低。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)82個(gè)基因上調(diào)響應(yīng)檸檬烯脅迫。從中選擇8個(gè)候選基因進(jìn)行改造，確實(shí)獲得了高產(chǎn)檸檬烯的酵母菌株［96］。微藻的轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)信息也揭示了一些顯著變化基因，可以采取類似策略進(jìn)行改造。但是真核微藻的合成生物學(xué)改造在模式微藻中成功率較高［97］。對(duì)非模式真核微藻很難通過反向代謝工程手段進(jìn)行驗(yàn)證。主要原因是受限于真核微藻基因組信息和基因操作工具的缺乏、低效。比如微藻同源重組效率低［98-99］，而非模式微藻的基因組編輯工具尚需完善［100］。微藻的代謝調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，往往是多個(gè)基因協(xié)同作用，而多基因的基因操作就更為困難。此外，真核微藻中光合作用也非常重要，但是釀酒酵母和大腸桿菌均無光合系統(tǒng)，藍(lán)藻等原核生物的基因操作較為成熟，可以考慮在藍(lán)藻中驗(yàn)證。利用合成生物學(xué)手段進(jìn)行多位點(diǎn)編輯，可以獲得具有遺傳多樣性的進(jìn)化菌株，也是提高ALE效率的潛在方法［24］?；蚪M多位點(diǎn)編輯在酵母中應(yīng)用較廣［101］，但是對(duì)于微藻還是困難的。隨著技術(shù)的發(fā)展，非模式真核微藻的基因組編輯工具將更高效，其基因組多位點(diǎn)編輯也會(huì)成為可能。

5 挑戰(zhàn)與展望

微藻通過光合作用進(jìn)行固碳，在自然界中為碳循環(huán)貢獻(xiàn)著力量。面向“雙碳”重大戰(zhàn)略需求，需要發(fā)揮微藻的優(yōu)勢(shì)，提出可行的碳中和路線。根據(jù)這些技術(shù)路線的需要，ALE強(qiáng)化藻種代謝表型和耐受性，并提高這些技術(shù)路線的技術(shù)可行性和經(jīng)濟(jì)可行性。目前，微藻的ALE還存在效率低、機(jī)制分析不明確、合成生物學(xué)應(yīng)用少等問題。

（1）進(jìn)一步提高微藻的固碳效率，服務(wù)碳中和目標(biāo)。微藻固碳的利用率和對(duì)不同工況的適應(yīng)性還有待提高。部分進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)的CO2停留時(shí)間短，造成對(duì)CO2的利用率低。從光生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)等方面可以提高碳的利用率，對(duì)藻種來說，微藻快速生長就可以高效固碳。還需要提高微藻對(duì)不同工況的適應(yīng)性，特別是室外培養(yǎng)中溫度和光強(qiáng)等周期性變化。在培養(yǎng)體系中加入CO2吸收劑也是增加CO2溶解度和固碳效率的方法，有些吸收劑對(duì)微藻也會(huì)產(chǎn)生抑制，需要通過ALE強(qiáng)化對(duì)這些吸收劑的耐受性。

（2）提高微藻廢水處理效率，滿足微藻對(duì)水資源需要同時(shí)有效固碳。微藻廢水處理中除了氨氮和鹽脅迫，不可避免地還要受其他化合物和微生物的影響。對(duì)于含菌系統(tǒng)如果提高微藻的生長，發(fā)揮藻和菌各自的作用，也可以通過ALE構(gòu)建更穩(wěn)定的體系，進(jìn)而提高微藻廢水處理效率。

（3）綜合開發(fā)微藻高附加值產(chǎn)品，提高碳中和路線的經(jīng)濟(jì)性。ALE除了可以提高微藻的生長，并高效固碳，還提高了油脂或者色素的產(chǎn)率。為了進(jìn)一步提高微藻碳中和技術(shù)路線的經(jīng)濟(jì)性，還需要篩選新的微藻高附加值產(chǎn)品?？梢酝ㄟ^加入化學(xué)誘導(dǎo)劑的方法提高這些產(chǎn)品的產(chǎn)率，相關(guān)的策略還有待進(jìn)一步完善。

（4）探索微藻ALE的分子機(jī)制和代謝調(diào)控規(guī)律。微藻進(jìn)化藻株的機(jī)制分析從根本上來說，還要通過比較基因組和表觀組學(xué)的方法進(jìn)行分析。目前相關(guān)研究還不充分，因?yàn)槲⒃宓幕蚪M測(cè)序數(shù)量比微生物少得多，基因注釋還不完善。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等更多的是從代謝調(diào)控角度闡明相關(guān)機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組及代謝組的研究一般僅停留在代謝網(wǎng)絡(luò)層面，對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究不多?？鼓嫘耘c信號(hào)傳導(dǎo)途徑息息相關(guān)。構(gòu)建多組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)分析，將有助于明確對(duì)微藻代謝和抗逆機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為進(jìn)一步的合成生物學(xué)研究服務(wù)。

（5）提高微藻ALE的效率。隨著微藻ALE研究的深入，特別是可以借鑒其他微生物ALE的成果，從藻株篩選、ALE條件和進(jìn)化策略等角度合理設(shè)計(jì)，努力使微藻盡快達(dá)到ALE的終點(diǎn)，獲得進(jìn)化藻株。搜集ALE中的動(dòng)態(tài)信息并構(gòu)建模型，獲得ALE的進(jìn)化規(guī)律?？梢院驼T變等方法結(jié)合，構(gòu)建更多的突變體，并高效篩選滿足耐受性的藻株。加入適當(dāng)濃度的化學(xué)調(diào)節(jié)劑，可以在不抑制微藻生長的前提下，調(diào)控胞內(nèi)代謝產(chǎn)物累積，也有利于提高微藻ALE效率。

（6）發(fā)揮合成生物學(xué)的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建非天然固碳途徑。以微藻作為可光合作用的底盤，通過進(jìn)化工程強(qiáng)化藻株的耐受性，并獲得更多的進(jìn)化藻株。通過比較基因組學(xué)分析等，發(fā)掘固碳和抗逆元件，可以在其他生物中進(jìn)行異源表達(dá)，并合成新的非天然代謝途徑，為實(shí)現(xiàn)碳中和目標(biāo)貢獻(xiàn)力量。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，真核微藻的基因工程改造效率將不斷提高。研發(fā)新模式微藻的底盤細(xì)胞，并通過合成物學(xué)手段構(gòu)建固碳和高附加值產(chǎn)品生物合成新途徑，將助力微藻合成生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)碳中和目標(biāo)。