崔金玉，張愛娣，欒國(guó)棟，呂雪峰

（1中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；2山東能源研究院，山東 青島 266101；3青島新能源山東省實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；4中南林業(yè)科技大學(xué)，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

氣候變化是當(dāng)今人類面臨的重大挑戰(zhàn)，應(yīng)對(duì)氣候變化已經(jīng)成為全球共識(shí)。而氣候變化的潛在重要原因之一是碳的過量排放，其會(huì)導(dǎo)致地球氣候變暖、溫室效應(yīng)以及出現(xiàn)極端惡劣天氣。中國(guó)作為世界人口最多的國(guó)家，也是世界最大的碳排放國(guó)。長(zhǎng)期以來，中國(guó)積極參與全球治理，將溫室氣體減排任務(wù)納入國(guó)家五年規(guī)劃和2035遠(yuǎn)景目標(biāo)，力爭(zhēng)CO2的排放量于2030年前達(dá)到峰值，努力爭(zhēng)取在2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和［1］。碳達(dá)峰、碳中和既是我國(guó)應(yīng)對(duì)全球變化的莊嚴(yán)承諾，也是我國(guó)實(shí)現(xiàn)社會(huì)綠色、可持續(xù)發(fā)展的必由之路。發(fā)展CO2的高效資源化利用技術(shù)可同時(shí)緩解迫切的環(huán)境和能源壓力，是實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)的重要途徑。微藻是一類具有單細(xì)胞或簡(jiǎn)單多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的原核或真核生物，原核微藻主要指藍(lán)藻（藍(lán)藻科），真核微藻主要包括綠藻（綠藻科）和硅藻（硅藻科）［2］。微藻作為重要的光合固碳微生物，是生物圈初級(jí)生產(chǎn)力的主要來源，貢獻(xiàn)了全球范圍內(nèi)50%以上的生物固碳，同時(shí)還參與全球氮、氧、磷等多種物質(zhì)循環(huán)。微藻是研究光合作用機(jī)制的重要模式體系，也是極具潛力的新型微生物光合平臺(tái)。利用微藻光合固碳過程，將太陽(yáng)能和CO2直接轉(zhuǎn)化為重要生物基產(chǎn)品的模式被稱為光驅(qū)固碳合成技術(shù)。微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）微藻擁有高效的光合系統(tǒng)，光合速率高，例如藍(lán)藻光能利用率是陸生植物的數(shù)倍（藍(lán)藻3%～9%，陸生植物0.25%～3%）［3-4］。（2）微藻的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)需求低，不需要有機(jī)碳源，且其可以利用廢棄的水、氣和邊際土地資源，可以有效降低生產(chǎn)成本并提高過程綜合收益［5］；同時(shí)，微藻以大氣中的溫室氣體CO2作為碳源，具有顯著的生態(tài)效益；據(jù)估計(jì)，生產(chǎn)1 kg藻類生物量需要1.83 kg CO2

［6］，也即意味著微藻培養(yǎng)可以起到固碳減排和綠色合成的效果。（3）微藻生長(zhǎng)比植物快，培養(yǎng)周期短，生長(zhǎng)密度高；同時(shí)，其自身含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類和多糖等高附加產(chǎn)值化合物，可作為生產(chǎn)各種生物制品的直接原料［7］。（4）微藻廣泛分布于全球各種生態(tài)環(huán)境中，具有極為豐富的種質(zhì)、遺傳、代謝和生理多樣性，為多樣化的光驅(qū)固碳合成技術(shù)路線開發(fā)提供了寶貴的資源基礎(chǔ)；例如，微藻中含有多不飽和脂肪酸、色素、碳水化合物、肽、維生素、多酚、植物甾醇和激素等多種生物活性物質(zhì)，在食品、營(yíng)養(yǎng)品、藥物和化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間［8］。綜上所述，微藻生物技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用有望成為“碳達(dá)峰、碳中和”戰(zhàn)略目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的有力手段，為全球的綠色低碳進(jìn)程提供部分可行性解決方案。

微藻的天然光合代謝本質(zhì)上是為了維持生存、促進(jìn)生長(zhǎng)和實(shí)現(xiàn)增值，而光驅(qū)固碳合成技術(shù)的核心目標(biāo)是為了實(shí)現(xiàn)CO2的定向利用，讓更多的碳流流向高附加產(chǎn)值化合物的合成。近20年來，以合成生物學(xué)為代表的交叉學(xué)科的發(fā)展，使得人工設(shè)計(jì)、合成新型微藻光合細(xì)胞工廠成為現(xiàn)實(shí)，有效促進(jìn)了光合代謝的深度重塑與光合碳流的精確調(diào)控，使CO2在太陽(yáng)能驅(qū)動(dòng)下向各種天然和非天然目標(biāo)產(chǎn)物的定制化轉(zhuǎn)化。針對(duì)特定培養(yǎng)體系和應(yīng)用需求進(jìn)行微藻復(fù)雜細(xì)胞表型的人工設(shè)計(jì)和改造也成為可能。另外，通過對(duì)光合微藻代謝特性（如固碳放氧）的理解和改造，合成生物學(xué)技術(shù)還極大拓展了微藻的應(yīng)用空間和潛力，使其可以通過與其他學(xué)科和技術(shù)的融合而執(zhí)行新型的任務(wù)；而新型應(yīng)用場(chǎng)景開發(fā)過程中也存在一定挑戰(zhàn)，微藻的遺傳、生理和代謝特性還需要針對(duì)工程放大和靶向應(yīng)用過程中特定的體系、條件和環(huán)境進(jìn)行適配性的設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化。本文將結(jié)合典型案例的介紹，重點(diǎn)對(duì)合成生物技術(shù)、系統(tǒng)生物技術(shù)和人工智能等新科技浪潮的驅(qū)動(dòng)下，微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)在基本開發(fā)模式、新穎應(yīng)用場(chǎng)景以及發(fā)展動(dòng)向方面的新變化和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行總結(jié)和展望。

1 微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的基本開發(fā)模式

光驅(qū)固碳合成技術(shù)從本質(zhì)上分析是人工對(duì)微藻細(xì)胞光合作用固定CO2過程的應(yīng)用和改造，在具體過程上則是通過設(shè)備、技術(shù)、環(huán)境條件對(duì)光驅(qū)碳流轉(zhuǎn)化路線的引導(dǎo)、強(qiáng)化和重定向。本文從微藻光合代謝活動(dòng)的利用和改造模式上，將光驅(qū)固碳合成技術(shù)的基本開發(fā)模式總結(jié)為“拆盲盒”“擠海綿”和“動(dòng)刀子”3種模式（圖1），下面將對(duì)其技術(shù)流程和特點(diǎn)進(jìn)行梳理并介紹相關(guān)研究進(jìn)展、重要突破和代表性應(yīng)用示范。

圖1 微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的開發(fā)模式Fig.1 The development models of microalgae photosynthetic biomanufacturing

1.1 “拆盲盒”——挖掘天然微藻種質(zhì)資源

微藻廣泛分布于陸地、海洋、淡水、極地等各種生態(tài)環(huán)境中，需要適應(yīng)鹽、pH、溫度、光照等各種極端環(huán)境條件及其動(dòng)態(tài)變化，與之相對(duì)應(yīng)的則是微藻類群極高的生理和代謝多樣性，以及類型廣泛的代謝產(chǎn)物（主要包括油脂、多糖、不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、色素類以及各種小分子代謝物等）。通過對(duì)微藻種質(zhì)資源進(jìn)行廣泛采集和篩選，對(duì)其胞內(nèi)代謝物進(jìn)行分析和鑒定，挖掘高附加產(chǎn)值化合物的微藻光驅(qū)固碳合成路線開發(fā)模式，被稱為“拆盲盒”，具有技術(shù)門檻相對(duì)較低、體系成熟度高等特點(diǎn)，迄今為止仍然是微藻生物工程領(lǐng)域的主要研究方向。

針對(duì)天然微藻種質(zhì)資源挖掘和分析等相關(guān)內(nèi)容，此前已有相關(guān)綜述進(jìn)行了詳細(xì)的總結(jié)，在此僅做簡(jiǎn)要介紹［8-9］。以微藻油脂合成研究為例，迄今為止研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種可用于合成油脂的微藻，具有代表性的包括三角褐指藻（Phaeodactylum）、杜氏藻屬（Dunaliella）和微擬球藻屬（Nannochloropsis）等［10］。在氮限制條件下，上述微藻胞內(nèi)積累大量甘油三酯，其結(jié)構(gòu)與普通蔬菜油甘油三酯的結(jié)構(gòu)類似，具有食用油替代產(chǎn)品的潛力；同時(shí)，微藻油脂還可以通過酯化轉(zhuǎn)變?yōu)樯锊裼停ㄖ舅峒柞サ龋?，被視為?代可再生燃料的重要產(chǎn)品［11］。近年來，一類新型產(chǎn)油微藻——真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos）逐漸引起關(guān)注，其具有生長(zhǎng)速率快、積累高含量微藻油和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等特性，總脂和中性油脂的含量分別達(dá)到干重的63.4%和56.8%，EPA則可占干重的2.4%，在醫(yī)藥健康領(lǐng)域具有可觀的開發(fā)潛力［12-14］。油脂類產(chǎn)品之外，微藻多糖也因具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗病毒和抗輻射等特性，而被視為具有廣闊的應(yīng)用前景的微藻產(chǎn)品［15］。例如，纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）可積累大量的貯藏多糖β-1，3-葡聚糖，其可占干重的80%以上［16-17］。

基于天然微藻藻株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用嘗試中，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）合成蝦青素的技術(shù)最為成功。雨生紅球藻天然可以進(jìn)行蝦青素的胞內(nèi)合成和積累（最高可達(dá)細(xì)胞生物質(zhì)干重的6%）［18-20］，且其合成的天然蝦青素（左旋3S、3′S構(gòu)象），具有比人工合成蝦青素更高的生物活性［21］。近幾年，雨生紅球藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭十分迅猛，預(yù)計(jì)到2024年全球市場(chǎng)產(chǎn)值將達(dá)到3.5億美元，中國(guó)市場(chǎng)產(chǎn)值達(dá)到2.3億美元；目前國(guó)內(nèi)天然蝦青素生產(chǎn)企業(yè)集中分布于云南省，在健康產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的大背景下表現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢(shì)?！安鹈ず小笔降拈_發(fā)策略主要以對(duì)微藻生物資源的挖掘?yàn)榛A(chǔ)，其產(chǎn)品類型上也僅限于微藻的天然代謝產(chǎn)物，無論是產(chǎn)物合成能力還是胞內(nèi)積累容量都受到微藻天然代謝模式的約束，提升空間有限。同時(shí)，所挖掘到的天然微藻資源，在培養(yǎng)、采收、產(chǎn)物提取等環(huán)節(jié)上都存在各種不確定性，同時(shí)在一定程度上限制了技術(shù)成功放大應(yīng)用的潛力。

1.2 “擠海綿”——激活微藻代謝合成潛力

對(duì)天然微藻種質(zhì)資源的開發(fā)，除了大規(guī)模新種質(zhì)篩選以挖掘藻株和產(chǎn)品外，柔性的環(huán)境（物理、化學(xué)、生物）條件誘導(dǎo)“激活”也是重要的手段。通過特殊的培養(yǎng)條件和策略“激活”微藻沉默代謝途徑和功能模塊，結(jié)合組學(xué)分析技術(shù)，探究胞內(nèi)代謝物的變化，實(shí)現(xiàn)環(huán)境響應(yīng)型高附加化合物積累的模式，被稱為“擠海綿”。相比簡(jiǎn)單的“拆盲盒”模式，該模式將有效拓展對(duì)微藻代謝網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)和利用。目前廣泛應(yīng)用的“擠海綿”策略包括逆境脅迫、化學(xué)調(diào)節(jié)劑添加以及共培養(yǎng)等手段。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，以優(yōu)化微藻和其他微生物細(xì)胞中特定代謝產(chǎn)物含量，已成為廣泛應(yīng)用的生物工程技術(shù)。例如，Yang等［22］在2015年報(bào)道稱，小球藻（Chlorella minutissimaUTEX 2341）的培養(yǎng)體系中在添加鎘離子和銅離子后，細(xì)胞油脂含量分別顯著提高了21.07%和93.90%。近年來，在常規(guī)培養(yǎng)組分和條件之外，進(jìn)一步引入具有特殊生理和代謝活性的代謝調(diào)節(jié)劑，成為調(diào)控微藻代謝合成的新策略，其中植物激素類物質(zhì)的使用已表現(xiàn)出可觀的潛力。2020年，Chen等［23］發(fā)現(xiàn)，在綠球藻（Chromochloris zofingiensi）培養(yǎng)體系中添加多種植物激素類物質(zhì)進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)吲哚丙酸（10 mg/L）可以有效刺激其蝦青素與脂類的共合成，總脂占細(xì)胞干重的含量比例達(dá)到64.5%，合成速率達(dá)到445.7 mg/（L·d），與此同時(shí)蝦青素在細(xì)胞干重中的積累量也達(dá)到13.1 mg/g，比對(duì)照菌株提高48.9%，為該藻株中已報(bào)道的最高水平。天然微藻藻株中，蝦青素的合成是作為抵抗高溫、高光等逆境脅迫因素的防御機(jī)制而存在的，植物激素類物質(zhì)的加入可以直接或間接（激活第二信使等）對(duì)其調(diào)控和代謝途徑進(jìn)行擾動(dòng)，從而促進(jìn)蝦青素的積累。

藍(lán)藻中相容性物質(zhì)的合成和積累是另一個(gè)典型的逆境脅迫激發(fā)特定產(chǎn)物合成的例子［24］。針對(duì)特定藍(lán)藻藻株，通過調(diào)節(jié)其培養(yǎng)基中的鹽濃度，即可引發(fā)胞內(nèi)特定類型相容性物質(zhì)的積累。而藍(lán)藻相容性物質(zhì)已被證明具有廣泛的用途，例如：海藻糖和甘油葡糖苷可作為食品和化妝品添加劑，具有保濕、抗氧化等功效，可作為商業(yè)蛋白穩(wěn)定劑等［25-27］；甜菜堿具有保濕、清潔、促進(jìn)代謝、抗腫瘤、降血壓、抗消化性潰瘍等作用，在人類營(yíng)養(yǎng)、動(dòng)物飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和化妝行業(yè)具有廣闊的開發(fā)空間［28-29］。近期，中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所科研團(tuán)隊(duì)利用螺旋藻這一特點(diǎn)開發(fā)了螺旋藻制備甘油葡糖苷技術(shù)，并在國(guó)際上率先實(shí)現(xiàn)螺旋藻合成甘油葡糖苷技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和產(chǎn)品商業(yè)化銷售。

在物理和化學(xué)擾動(dòng)之外，在生物學(xué)層面應(yīng)用共培養(yǎng)策略同樣可以對(duì)微藻光驅(qū)固碳合成過程產(chǎn)生顯著調(diào)節(jié)效果，利用菌-藻/藻-藻之間的共生關(guān)系來提高微藻生物質(zhì)和高附加產(chǎn)值化合物的生產(chǎn)正在引起關(guān)注［30］。例如，Wu等［31-32］將萊茵衣藻與慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）或圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）進(jìn)行混合培養(yǎng)生產(chǎn)氫氣，氫氣產(chǎn)率分別達(dá)到0.42 μmol/h和0.36 μmol/h，已達(dá)到萊茵衣藻產(chǎn)氫速率的17倍。2021年，Ouyang等［33］研 究 發(fā) 現(xiàn)，纖 細(xì) 裸 藻（Euglena.gracilis）與需鈉弧菌（Vibrio natriegens）的共培養(yǎng)能夠顯著提高纖細(xì)裸藻的干重（15%）、葉綠素（23.75%）和淀粉含量（12%）。另外，在共培養(yǎng)策略中，一些異養(yǎng)菌可以通過改變光合微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或小分子成分來間接影響光合微生物的基因表達(dá)［34］。例如，藍(lán)藻進(jìn)行光合作用容易產(chǎn)生活性氧，其在培養(yǎng)基中大量積累會(huì)抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)。Li等［35］在研究聚球藻（Synechococcus elongatesPCC 7942，下 文 簡(jiǎn) 稱PCC 7942）和黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）組成的人工混菌體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)R.glutinis的存在可有效清除體系內(nèi)的活性氧物質(zhì)從而解除藍(lán)藻的生長(zhǎng)抑制。

1.3 “動(dòng)刀子”——重塑微藻細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)

隨著合成生物學(xué)工具的開發(fā)和應(yīng)用，通過代謝途徑人工設(shè)計(jì)重構(gòu)和微藻天然代謝網(wǎng)絡(luò)修飾，將光合碳流重定向至天然或非天然代謝產(chǎn)物的微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)開發(fā)模式引起越來越多的關(guān)注，這種基于人工設(shè)計(jì)和理性改造的開發(fā)模式可稱為“動(dòng)刀子”。該模式主要是通過對(duì)微藻的遺傳背景和代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，進(jìn)而根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑構(gòu)建需求，引入外源基因并對(duì)內(nèi)源途徑進(jìn)行修飾和改造，很明顯該模式具有靶向性強(qiáng)、拓展性好的特點(diǎn)。“動(dòng)刀子”開發(fā)模式在原核藍(lán)藻和真核微藻中都取得了巨大的進(jìn)展。原核藍(lán)藻是地球上最早出現(xiàn)的能夠進(jìn)行放氧型光合作用的微生物［36］，與真核微藻相比，其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速、易于進(jìn)行遺傳操作的優(yōu)勢(shì)［37-38］。因此，合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用首先在藍(lán)藻遺傳 改 造 中 取 得 顯 著 成 效［39］。1999年，Deng和Coleman等［40］首次報(bào)道，在PCC 7942中利用rbcL啟動(dòng)子控制來源于Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶Ⅱ，成功實(shí)現(xiàn)了乙醇合成，乙醇產(chǎn)量約為5 mmol/L（0.23 g/L），為首次報(bào)道的人工設(shè)計(jì)構(gòu)建合成非天然代謝產(chǎn)物的微藻光合細(xì)胞工廠。以此為基礎(chǔ)，在此后20年間，藍(lán)藻光驅(qū)固碳合成乙醇技術(shù)又取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，通過系統(tǒng)的酶工程、代謝工程、底盤工程、過程工程優(yōu)化，現(xiàn)階段藍(lán)藻細(xì)胞工廠的乙醇產(chǎn)量已達(dá)到5～10 g/L的水平，合成速率也達(dá)到200～300 mg/（L·d）的水平，表現(xiàn)出一定的工程應(yīng)用潛力［41］。美國(guó)藻醇Algenol生物燃料技術(shù)公司曾經(jīng)針對(duì)藍(lán)藻光驅(qū)固碳合成乙醇技術(shù)的發(fā)展和工程應(yīng)用展開了全面系統(tǒng)的研究，通過篩選具有良好逆境適應(yīng)能力（高光、高碳、過氧化等）的新型藍(lán)藻底盤，進(jìn)而對(duì)乙醇合成途徑進(jìn)行過量表達(dá)，獲得了可以利用海水和工業(yè)廢氣進(jìn)行培養(yǎng)并穩(wěn)定生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)醇藻株，并進(jìn)行了3000組反應(yīng)器規(guī)模的工程應(yīng)用示范，該技術(shù)還于2015年獲得美國(guó)總統(tǒng)綠色化學(xué)獎(jiǎng)。而整體經(jīng)濟(jì)成本測(cè)算顯示，如果能夠?qū)a(chǎn)醇之后剩余藍(lán)藻生物質(zhì)進(jìn)行精煉制備生物柴油等其他產(chǎn)品，該技術(shù)在整體成本上已經(jīng)具備初步經(jīng)濟(jì)可行性。當(dāng)然，隨著石油價(jià)格近年持續(xù)走低，該技術(shù)的規(guī)?；瘧?yīng)用尚未取得實(shí)質(zhì)性推動(dòng)，Algenol公司的發(fā)展重點(diǎn)也逐漸轉(zhuǎn)向高值藻類營(yíng)養(yǎng)品的開發(fā)。除乙醇外，應(yīng)用合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)，藍(lán)藻光合細(xì)胞工廠合成糖、酸、脂、烴、醛、酮和芳香族化合物等數(shù)十種重要產(chǎn)品的技術(shù)路線也已打通。例如，2016年，Gao等［42］通過改造磷酸甲基赤蘚糖醇代謝途徑，使得工程菌株將約40%的光合固定碳定向到異戊二烯生物合成途徑，異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到1.26 g/L。2020年，Qiao等［25］通過引入來自魚腥藻的海藻糖合成途徑與沉睡搖蚊來源的海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TRET1，成功構(gòu)建直接固定CO2，高效合成和分泌海藻糖的聚球藻細(xì)胞工廠，胞外海藻糖產(chǎn)量可達(dá)5.7 g/L。

“動(dòng)刀子”模式除了能夠?qū)崿F(xiàn)非天然產(chǎn)物的光驅(qū)固碳合成外，還能夠通過微藻代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)天然類代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)和品控。1996年，美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室首次通過控制脂質(zhì)積累的關(guān)鍵酶（乙酰輔酶A羧化酶）基因的高效表達(dá)，提高小環(huán)藻的脂質(zhì)含量，為高油脂藻種培育開辟了一條新技術(shù)途徑［43］。2014年，Hamilton等［44］首次報(bào)道關(guān)于ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成的轉(zhuǎn)基因藻株，在三角褐指藻中通過異源表達(dá)?；o酶A依賴型Δ6-去飽和酶和Δ5-延長(zhǎng)酶增加二十二碳六烯酸（DHA）的含量。2017年，Xin等［45］探究了微擬球藻中一系列內(nèi)源Ⅱ型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT2）的分工與合作機(jī)制，通過人為控制DGAT2A、DGAT2D與DGAT2C三者間轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度，實(shí)現(xiàn)了藻油中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸比重的理性設(shè)計(jì)，從而生產(chǎn)出了飽和度“定制化”的藻油，將微藻細(xì)胞工廠推入“藻油品質(zhì)定制化”時(shí)代。2021年，Jeon等［46］在微擬球藻中通過過量表達(dá)內(nèi)源性NADP-依賴型蘋果酸酶NsME1提高油脂和脂肪酸甲酯產(chǎn)量，使其產(chǎn)量比對(duì)照菌株分別提高38%和47%。通過遺傳操作進(jìn)行靶向性代謝調(diào)控和重塑，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)光合碳流的理性重定向，有效增加分配給目標(biāo)產(chǎn)物合成的代謝流；但需要注意的是，該技術(shù)模式目前更多應(yīng)用于遺傳操作體系完善、代謝和生理背景清楚的模式藻株中，而模式藻株因?yàn)樯L(zhǎng)速度、固碳效率、脅迫耐受性等工程性狀的不足，在工程放大過程中往往會(huì)遇到困難和瓶頸。在未來，這一問題有望通過兩種策略的應(yīng)用得到解決：①挖掘鑒定具有良好工業(yè)應(yīng)用屬性（生長(zhǎng)速度快、固碳效率高、高溫高光耐受能力強(qiáng)、采收性能好）的非常規(guī)微藻藻株，進(jìn)行底盤化開發(fā)，系統(tǒng)解析其遺傳、代謝和生理背景，開發(fā)并完善其遺傳操作體系，在此基礎(chǔ)上開發(fā)新一代光合細(xì)胞工廠；②針對(duì)各種工業(yè)應(yīng)用場(chǎng)景，系統(tǒng)挖掘、優(yōu)化、設(shè)計(jì)通用型功能元件和模塊，并應(yīng)用于對(duì)已有基于模式底盤的微藻光合細(xì)胞工廠的改造，針對(duì)性地提升其工業(yè)過程的適配性，推動(dòng)技術(shù)放大應(yīng)用。

研究人員在利用“拆盲盒”“擠海綿”和“動(dòng)刀子”單種模式開發(fā)和挖掘高附加產(chǎn)值化學(xué)品方面做了深入研究。前期研究人員系統(tǒng)總結(jié)了藍(lán)藻固碳合成生物燃料和化學(xué)品產(chǎn)量（0.6 mg/L～5 g/L），大部分產(chǎn)量低于異源模式微生物如大腸桿菌和釀酒酵母［39，47］，產(chǎn)量相對(duì)較高的乙醇，有大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用潛力，但大規(guī)模培養(yǎng)過程中關(guān)于不同來源CO2、不同環(huán)境對(duì)微藻生長(zhǎng)和代謝的影響，需要在未來研究中繼續(xù)探索。另外，未來可以通過選取抗逆和速生菌株，利用兩種或多種模式互補(bǔ)的策略優(yōu)化異源合成途徑與底盤適配性，進(jìn)一步提高藻株底盤性能和產(chǎn)力。例如，將基因工程改造菌株進(jìn)行脅迫條件培養(yǎng)優(yōu)化，提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量。2019年，Liu等［48］在集胞藻（Synechocystissp.PCC 6803，下文簡(jiǎn)稱PCC 6803）中表達(dá)雨生紅球藻來源的β-胡蘿卜素酮酶基因bkt和類胡蘿卜素羥化酶基因crtR-B，實(shí)現(xiàn)異源合成蝦青素，產(chǎn)量達(dá)1.12 mg/g±0.01 mg/g，并且通過缺氮脅迫培養(yǎng)優(yōu)化，蝦青素產(chǎn)量提高達(dá)到4.81 mg/g±0.06 mg/g。在未來研究中，將3種策略進(jìn)行組合，發(fā)揮協(xié)同作用，有望在新穎化合物的合成及產(chǎn)量?jī)?yōu)化過程中發(fā)揮重要作用。

2 微藻光驅(qū)固碳合成過程的新穎應(yīng)用場(chǎng)景拓展

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展驅(qū)動(dòng)著微藻光合代謝網(wǎng)絡(luò)的深度重塑，也有效擴(kuò)展了基于微藻光驅(qū)固碳合成過程的技術(shù)應(yīng)用場(chǎng)景。通過與界面技術(shù)、材料技術(shù)和電化學(xué)技術(shù)等手段的交叉融合，微藻光驅(qū)固碳合成在進(jìn)行生物基產(chǎn)品合成之外，也在生物醫(yī)學(xué)、生物光伏以及航天和生命維持等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

2.1 微藻光合放氧的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

乏氧是多數(shù)腫瘤的顯著特征，其具有促進(jìn)血管形成、腫瘤擴(kuò)散、維持腫瘤微環(huán)境及引起耐藥性等特 點(diǎn)［49］。光 動(dòng) 力 治 療（photodynamic therapy，PDT）是腫瘤治療的潛在手段之一，其通過光敏劑和特定波長(zhǎng)的激發(fā)光催化O2生成細(xì)胞毒性活性氧（reactive oxygen species，ROS）來抑制腫瘤擴(kuò)散［50］，因具有選擇性好、毒性低、創(chuàng)傷和抵抗力小等特點(diǎn)而備受關(guān)注［51］。然而，它的作用受到乏氧的限制，反過來又因消耗O2而加劇乏氧。因此，圍繞如何增加光動(dòng)力治療過程中的氧補(bǔ)充這一問題，研究者們開發(fā)了各種策略，包括直接遞送O2進(jìn)入腫瘤、酶催化產(chǎn)氧及響應(yīng)型材料原位產(chǎn)氧遞送等［52］。然而，上述緩解乏氧的策略仍面臨氧補(bǔ)充不足、原位產(chǎn)氧的化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜/不可控和潛在的生物安全性問題等挑戰(zhàn)，阻礙了相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化。

微藻作為一類光合放氧的微生物，可以利用水作為電子供體將CO2還原為有機(jī)物，并不斷釋放氧氣。受此啟發(fā)，近年來已經(jīng)成功開發(fā)了微藻與不同光敏劑結(jié)合構(gòu)建的遞送系統(tǒng)，可極大改善病灶部位乏氧環(huán)境，在增強(qiáng)PDT治療、抑制腫瘤耐藥性等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［53-60］。2020年，Huo等［54］構(gòu)建了一種光敏劑二氫卟吩e6（Ce6）與PCC 7942的雜化功能系統(tǒng)（CeCyan），可用于在光激發(fā)條件下通過光合放氧來增強(qiáng)靶向腫瘤的PDT治療。藍(lán)藻只能吸收420～660 nm范圍內(nèi)的波長(zhǎng)進(jìn)行光合作用，而光敏劑Ce6可以在660 nm下激活，因此，這一光敏細(xì)菌能夠?qū)崿F(xiàn)在單一光源激發(fā)下（660 nm）的光合作用及光敏劑活化，使得敏化后的Ce6能夠迅速與分子氧發(fā)生三線態(tài)湮滅生成單線態(tài)氧物種（1O2），為克服Ⅱ型光敏劑的氧依賴提供一種基于生物放氧的增效方案［圖2（a）］。另外，Sun等［55］將聚球藻S.elongatusUTEX 2973與可控光敏劑吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）結(jié)合制成可注射型水凝膠以緩解乏氧效應(yīng)。使用640 nm和808 nm激光照射包裝好的水凝膠，藍(lán)藻細(xì)胞將通過光合作用持續(xù)產(chǎn)生O2并產(chǎn)生大量的ROS，其在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出有效的腫瘤生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。2021年，Wang等［61］利用海藻酸鈣凝膠包裹小球藻形成“Chlorella-Gel”，進(jìn)而將其與全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）荷載光敏劑Ce6的納米粒（PFC-NPs）構(gòu)成增氧給藥系統(tǒng)。采用原位注射方式將Chlorella-Gel遞送到小鼠腫瘤部位，再將PFC-NPs靜脈注射到小鼠體內(nèi)，小球藻經(jīng)激光照射后進(jìn)行光合作用產(chǎn)生的氧氣被PFC吸收，PFC作為儲(chǔ)氧罐將氧氣存儲(chǔ)起來，供給光敏劑轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，起到了高效的腫瘤細(xì)胞殺傷效果。目前，微藻遞送系統(tǒng)在臨床應(yīng)用中仍然存在諸多挑戰(zhàn)，如光敏劑不良反應(yīng)、光源波長(zhǎng)穿透能力、微藻存活時(shí)間和生物安全性等問題，但微藻遞送系統(tǒng)為改善乏氧PDT治療開辟了一條全新的思路，隨著納米醫(yī)學(xué)、合成生物學(xué)和光學(xué)學(xué)科等交叉學(xué)科的發(fā)展與融合，這些問題有望逐步得以解決。

圖2 微藻光驅(qū)固碳合成過程新穎應(yīng)用場(chǎng)景Fig.2 Schematic illustration of new application scenarios of microalgae with desired photosynthesis and biosynthesis properties[(a)The oxygenic photosynthesis and PDT process using CeCyan cells.These photosensitive CeCyan cells serve as the Ce6 carrier,delivering the photosensitizers to the tumor cells for potential photosynthesis-enhanced PDT under laser irradiation[54];(b)The engineered strain UTEX 2973,equipped with the photosynthetic machinery and a D-lactate synthesis pathway.The engineered strain S.oneidensis,equipped with a D-lactate oxida‐tion pathway and the extracellular electron transport machinery,releases electrons from D-lactate and transfers them to the anode for electricity pro‐duction[67];(c)The bioproduction of a Mars-specific rocket propellant,2,3-BDO,from CO2,sunlight and water on Mars.Photosynthetic cyanobacte‐ria convert Martian CO2 into sugars that are upgraded by engineered Escherichia coli into 2,3-BDO[72].]PS I—photosystem I;PS II—photosystem II;ATPase—adenosine triphosphate synthases;CBB cycle—Calvin-Benson-Bassham cycle

微藻光合放氧除了應(yīng)用于腫瘤治療外，在心血管疾病治療、大腦供氧強(qiáng)化和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等領(lǐng)域也能起到作用。2017年，研究人員將聚球藻注射到活的大鼠的缺血性心肌中，當(dāng)進(jìn)行光照射時(shí)，藍(lán)藻產(chǎn)生氧氣，起到了保護(hù)心肌代謝、增強(qiáng)心輸出量的效果［62］。但是，藍(lán)藻在組織中只能短暫存活，大多數(shù)注射的細(xì)胞在24 h后從組織中清除。因此，在急性心肌梗死后血運(yùn)重建需要暫時(shí)供養(yǎng)的情況下，這種治療才具有一定應(yīng)用潛力。2021年，?zugur等［63］將綠藻（衣藻屬）或PCC 6803注入蝌蚪的心臟，隨著心跳，微藻細(xì)胞緩慢地穿過血管，最終到達(dá)大腦。通過監(jiān)測(cè)頭部神經(jīng)活動(dòng)和氧氣水平，發(fā)現(xiàn)在光照條件下所輸入的微藻細(xì)胞可以持續(xù)穩(wěn)定產(chǎn)生O2。在嚴(yán)重缺氧環(huán)境，當(dāng)神經(jīng)元活動(dòng)完全停止時(shí)，光合作用產(chǎn)O2可以激發(fā)神經(jīng)元活動(dòng)的重新啟動(dòng)。上述兩個(gè)應(yīng)用均為直接注射藍(lán)藻，在進(jìn)行光照時(shí)，存在不同波長(zhǎng)對(duì)于皮膚穿透性不同的局限性，有研究者針對(duì)這一局限性，將藍(lán)藻與可控光敏劑結(jié)合，構(gòu)建近紅外光響應(yīng)時(shí)空可控的藍(lán)藻遞送系統(tǒng)，可吸收808 nm近紅外光并轉(zhuǎn)化為藍(lán)藻可吸收的藍(lán)光，能夠深層穿透組織，保證了光合產(chǎn)氧量，抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)，增加抗炎巨噬細(xì)胞數(shù)量，與甲氨蝶呤協(xié)同抗炎，表現(xiàn)出良好的抗類風(fēng)濕PDT治療效果［57］。除了這種“天然”光合作用最終產(chǎn)物O2，藍(lán)藻暗反應(yīng)過程中合成的糖類物質(zhì)，也可以供給宿主，成為第2類有益的副產(chǎn)品。另外，在不久的未來，通過合成生物學(xué)策略，改造藍(lán)藻合成各種可釋放的物質(zhì)，例如可合成促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF生成的物質(zhì)，有望在增強(qiáng)血管通透性等方面發(fā)揮功能。脊椎動(dòng)物和光合微藻嵌合體的產(chǎn)生將促進(jìn)一些光合產(chǎn)氧代謝基本原理的揭示，但更重要的是，其也為生物醫(yī)療領(lǐng)域的開辟了新的創(chuàng)新思路和發(fā)展模式。

2.2 基于微藻光驅(qū)固碳合成的新型生物光伏開發(fā)策略

發(fā)展和利用可再生能源是人類社會(huì)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的必由之路。作為地球上最豐富的可再生能源，太陽(yáng)能利用的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究具有重大的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。光伏（photovoltaics，PV）發(fā)電是利用半導(dǎo)體界面的光生伏特效應(yīng)而將光能直接轉(zhuǎn)變?yōu)殡娔艿囊环N技術(shù)，是太陽(yáng)能利用領(lǐng)域不可忽視的重要方向。但是部分光伏材料含有毒元素，廢棄太陽(yáng)能電池板總量大且難以回收等問題引發(fā)了人們對(duì)環(huán)境的擔(dān)憂［64］。近幾年，利用光合微藻產(chǎn)生物電的生物光伏（biophotovoltaic，BPV）技術(shù)［65］，因其具有碳中性、良好的環(huán)境相容性和潛在低成本等特點(diǎn)而引起關(guān)注［66］。BPV過程可以分為產(chǎn)電和放電兩個(gè)階段。在產(chǎn)電階段，太陽(yáng)光子首先被光系統(tǒng)吸收并產(chǎn)生激發(fā)電子儲(chǔ)存在高能中間體或由碳固定合成的有機(jī)化合物中，然后將捕獲的電子從細(xì)胞內(nèi)部輸出到外部電路，從而產(chǎn)生電流，即放電階段［66］。傳統(tǒng)的BPV系統(tǒng)主要將光合細(xì)胞固定在陽(yáng)極上，直接用于細(xì)胞外電子傳遞，輸出功率較低，比半導(dǎo)體光伏技術(shù)低3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。其主要原因是微藻細(xì)胞雖然具有很高的捕光能力，但胞內(nèi)產(chǎn)電和胞外電子傳遞能力極弱［67］。

圍繞以上問題，近幾年不同研究者從混合產(chǎn)電微生物菌群，微藻胞內(nèi)電子合成強(qiáng)化和胞外電子傳遞強(qiáng)化等方面展開研究。

（1）構(gòu)建雙菌生物光伏系統(tǒng)2019年，Zhu等［68］通過產(chǎn)D-乳酸的工程藍(lán)藻與高效利用D-乳酸產(chǎn)電的希瓦氏菌混養(yǎng)，搭建了具有可以進(jìn)行定向電子流生成的合成微生物組。在上述雙菌系統(tǒng)中，藍(lán)藻吸收光能并固定CO2來合成能量載體D-乳酸，希瓦氏菌則氧化D-乳酸產(chǎn)電，由此形成一條從光子到D-乳酸再到電能的定向電子流，完成從光能到化學(xué)能再到電能的能量轉(zhuǎn)化過程。通過在遺傳、環(huán)境和裝置層面的設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化，雙菌生物光伏系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了高效、穩(wěn)定的功率輸出，其最大功率密度達(dá)到150 mW/m2。采用連續(xù)流加培養(yǎng)方式，該雙菌生物光伏系統(tǒng)可穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)40 d以上的功率輸出，且平均功率密度達(dá)到135 mW/m2的較高水平［圖2（b）］。

（2）胞內(nèi)電子合成強(qiáng)化2021年，F(xiàn)iroozabadi等［69］搭建并且優(yōu)化了由PCC 6803喂養(yǎng)的BPV裝置，通過通量平衡分析（flux balance analysis，F(xiàn)BA）尋找PCC 6803提高產(chǎn)電量的關(guān)鍵步驟，進(jìn)一步預(yù)測(cè)關(guān)鍵反應(yīng)的調(diào)節(jié)化合物。結(jié)果表明，在PCC 6803的BG-11懸浮液中添加調(diào)節(jié)化合物NH4Cl，使最大功率密度達(dá)到148.27 mW/m2，是未添加對(duì)照組的40.5倍以上。

（3）胞外電子傳遞強(qiáng)化細(xì)胞色素蛋白是電子跨越絕緣細(xì)胞膜的高速通道，連接了胞內(nèi)電子生成系統(tǒng)與胞外電子傳遞系統(tǒng)，同時(shí)也是直接電子傳遞和間接電子傳遞兩種電子傳遞機(jī)制的交匯點(diǎn)［70］。2016年，Sekar等［71］將Geobacter的外膜色素蛋白OmcS引入PCC 7942，外膜色素蛋白的引入顯著提升了PCC 7942的胞外電子傳遞速率，使得BPV的電子生成能力提升了9倍。

未來可以進(jìn)一步利用合成生物學(xué)策略優(yōu)化藍(lán)藻及其他微藻的胞內(nèi)代謝提高產(chǎn)電能力；進(jìn)一步設(shè)計(jì)、優(yōu)化微藻的細(xì)胞色素蛋白系統(tǒng)，使得電子流更多流向與電極相關(guān)聯(lián)的色素蛋白；優(yōu)化電解質(zhì)的電子傳遞效率，通過改善微藻外周的電化學(xué)性能改變電子在外部環(huán)境的傳遞速率，提升微生物燃料電池的功率輸出。

2.3 微藻光驅(qū)固碳合成在航天和生命維持系統(tǒng)中的應(yīng)用

在航空航天和生命維持領(lǐng)域，基于微藻放氧型光合作用開發(fā)并應(yīng)用生命維持系統(tǒng)，有著長(zhǎng)期的研究歷史。理論上，微藻可以固定空間工作人員呼出的CO2并供應(yīng)其呼吸所需氧氣；在美國(guó)宇航局（NASA）和歐空局的相關(guān)報(bào)告和展望中，都強(qiáng)調(diào)了未來空間技術(shù)乃至行星探測(cè)過程中，微藻將起到不可替代的作用。近期，利用微藻在空間航行和地外行星探索過程中合成供給航空燃料，成為一種新的微藻航天應(yīng)用場(chǎng)景。NASA“毅力號(hào)”、我國(guó)的“祝融號(hào)”等火星探測(cè)器已經(jīng)成功登陸火星并能執(zhí)行各種預(yù)定任務(wù)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)由火星返回地球甚至未來以火星為基地進(jìn)一步進(jìn)行外太空探索的過程中，如何有效地生產(chǎn)和供應(yīng)航天燃料將成為新的課題。

從地球發(fā)射離開火星的火箭發(fā)動(dòng)機(jī)目前以甲烷和液氧（LOX）為燃料。但是，火星上并不存在這兩種物質(zhì)，這意味著首先需要從地球運(yùn)來這些燃料，然后再為返回航天器提供動(dòng)力進(jìn)入火星軌道?？紤]到火星和地球之間的引力和大氣差異，為回程運(yùn)送LOX從技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上都是難度極大甚至不可行的。因此，研究人員提出利用CO2、水和陽(yáng)光，通過生物技術(shù)支持的原位資源利用（Bio-ISRU）在火星上合成火箭推進(jìn)劑——2，3-丁二醇（2，3-butanediol，2，3-BDO）［圖2（c）］［72］。藍(lán)藻將火星CO2轉(zhuǎn)化為糖類，這些糖類通過工程改造的大腸桿菌轉(zhuǎn)化成2，3-BDO。Bio-ISRU合成2，3-BDO與傳統(tǒng)的化學(xué)催化合成2，3-BDO策略相比，能量降低32%，需要的有效載荷質(zhì)量高2.8倍，并產(chǎn)生44 t的氧氣用于殖民。通過模型指導(dǎo)對(duì)生物和材料優(yōu)化后，使Bio-ISRU耗能降低59%，有效載荷質(zhì)量降低13%，同時(shí)還能產(chǎn)生20 t多余氧氣。上述研究為推動(dòng)行星際空間的旅行做出了開創(chuàng)性的積極探索，在未來可以進(jìn)一步探究火星環(huán)境對(duì)藍(lán)藻及大腸桿菌等生理代謝的影響，并通過合成生物學(xué)等策略優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。

3 微藻合成生物技術(shù)發(fā)展的新方向展望

如上所述，隨著合成生物學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)和生物工程的快速發(fā)展，微藻光驅(qū)固碳代謝網(wǎng)絡(luò)和技術(shù)應(yīng)用范圍都得到極大拓展［5，10］。而隨之產(chǎn)生的問題是，微藻的遺傳、生理和代謝特性與全新的場(chǎng)景和過程中往往并不適配，通常需要針對(duì)工程放大和靶向應(yīng)用過程中特定的工藝和環(huán)境進(jìn)行設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化。

3.1 微藻合成生物學(xué)工具箱的開發(fā)和優(yōu)化

高效的合成生物學(xué)工具和策略，在微生物異源合成高附加產(chǎn)值化合物技術(shù)的開發(fā)中具有無法替代的重要性。但是大多數(shù)微藻中合成生物學(xué)工具箱的開發(fā)仍明顯滯后于異養(yǎng)模式菌株，對(duì)目標(biāo)蛋白、途徑和功能模塊豐度的動(dòng)態(tài)靶向調(diào)控能力存在很多欠缺。因此，微藻中合成生物學(xué)工具箱的發(fā)展完善對(duì)微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)發(fā)展有著重要的推動(dòng)意義。目前，在各種生物體系中蓬勃發(fā)展應(yīng)用的CRISPR相關(guān)技術(shù)，在微藻中通常都有著良好的應(yīng)用效果，各類微藻藻株中已經(jīng)建立了一系列基因編輯CRISPR（基于規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)）系統(tǒng)［73-77］。例如，2020年，Choi等［76］在藍(lán)藻中開發(fā)了一種dCas12a介導(dǎo)的CRISPR干擾系統(tǒng)（CRISPRi-dCas12a），通過CRISPR-RNA（crRNA）和19nt同向重復(fù)序列有效阻斷了轉(zhuǎn)錄起始，導(dǎo)致53%～94%的基因抑制。在不降低抑制強(qiáng)度的情況下，也成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)crRNA陣列中多個(gè)基因的抑制［圖3（a）］。此外，2021年，本實(shí)驗(yàn)室的Zhang等［78］在PCC 7942中開發(fā)了蛋白可控降解系統(tǒng)，在PCC 7942里用茶堿依賴型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)大腸桿菌來源的ClpXPEc蛋白降解酶和SspB輔助蛋白，并將ssrADAS蛋白降解標(biāo)簽與GFP融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)含有ssrADAS標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白GFP的有效降解，該系統(tǒng)是藍(lán)藻最早報(bào)道的翻譯后水平的調(diào)控工具之一，具有響應(yīng)快、調(diào)控范圍廣和調(diào)控效果好的優(yōu)點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了OR Gate遺傳回路，實(shí)現(xiàn)了對(duì)胞內(nèi)GlgC表達(dá)和糖原積累的調(diào)控。在未來研究中，可以進(jìn)一步評(píng)估在其他物種中建立的多種合成生物學(xué)工具，并將其應(yīng)用于微藻中。

圖3 開發(fā)新應(yīng)用場(chǎng)景和規(guī)?；囵B(yǎng)中面臨問題的策略Fig.3 Strategies for solving emerging problems rising from new application scenarios and larger application scalesPQ—plastoquinone;Cytbf—cytochrome b6f complex;A0—special chlorophyll;A1—vitamin K;4Fe-4S—iron-sulfur centers;Fd—ferredoxin

3.2 開發(fā)高效光合平臺(tái)

選擇優(yōu)良底盤性能的微藻對(duì)光驅(qū)固碳合成技術(shù)的工程化應(yīng)用具有重要作用。而目前廣泛采用的策略包括：

（1）自然界中分離和篩選具有速生和抗逆特性的候選藻株［79］。最近，有兩株新分離的聚球藻，第1個(gè)是聚球藻PCC 11801，具有天然轉(zhuǎn)化能力，生長(zhǎng)速度快，耐高光、高溫、CO2和海鹽濃度的特性［80-81］。第2個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的海洋藍(lán)藻聚球藻PCC 11901，具有自然轉(zhuǎn)化、2 h倍增時(shí)間、在高光和高鹽下生長(zhǎng)的特性，每升累積的干細(xì)胞重約為33 g［82］。最近，從鹽堿湖中分離出的耐鹽固氮菌株念珠藻Desmonostoc，比模式菌株念珠藻PCC 7120生長(zhǎng)速度快2倍［83］。

（2）選取基因型穩(wěn)定的宿主。在大規(guī)模長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，菌株基因組穩(wěn)定性問題非常重要。在未來研究中，首先可以通過降低宿主自發(fā)突變率、刪除冗余基因，構(gòu)建最小基因組等策略提高宿主基因組穩(wěn)定性。其次，將產(chǎn)物合成途徑與宿主代謝網(wǎng)絡(luò)高度結(jié)合，使得合成的產(chǎn)物有利于菌株的生長(zhǎng)。合成產(chǎn)物工程菌株，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的負(fù)擔(dān)，通過基因編輯等手段降低產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，將有利于降低工程菌株回復(fù)突變［84］。

（3）發(fā)展新型合成生物學(xué)工具和策略，拓寬微藻對(duì)太陽(yáng)光的捕集波段、提高其對(duì)太陽(yáng)光的捕集效率和光能的傳遞效率，相關(guān)內(nèi)容已有綜述論文進(jìn)行了詳細(xì)介紹［79，85-87］，本文不做詳細(xì)展開。

針對(duì)自然光合效率低的問題，2021年，美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室的研究人員，在PCC 6803構(gòu)建“人工PSⅡ”，從外部直接向光合作用電子轉(zhuǎn)移鏈（photosynthetic electron transfer chain，PETC）供電，再利用藍(lán)藻光系統(tǒng)Ⅰ驅(qū)動(dòng)CO2高效還原［88］。這種結(jié)構(gòu)的陰極在電化學(xué)上與缺乏光系統(tǒng)Ⅱ活性且不能獨(dú)立進(jìn)行光合作用的藍(lán)藻細(xì)胞結(jié)合［圖3（b）］。通過光系統(tǒng)Ⅰ，陰極照明將電子從外部電路傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的PETC，最終推動(dòng)藍(lán)藻將CO2轉(zhuǎn)化為CO2還原性產(chǎn)物。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了乙烯的光電生產(chǎn)，估算其第8天時(shí)乙烯效價(jià)可達(dá)0.365 mmol/（L·OD730），平均外源電子利用率為74.9%。這種新的光合作用概念，相比于自然光合作用，有望提高生產(chǎn)光驅(qū)固碳合成燃料化學(xué)品能力的理論上限，這無疑對(duì)于光合生物制造平臺(tái)具有重要意義。這種基于技術(shù)交叉應(yīng)用，跨越式提升微藻底盤能量利用效率的策略在未來將起到更重要的作用。

3.3 規(guī)?；囵B(yǎng)過程中防污染策略開發(fā)

嚴(yán)苛的工業(yè)過程和環(huán)境條件是實(shí)現(xiàn)微藻光驅(qū)固碳技術(shù)規(guī)?；⒎€(wěn)定化應(yīng)用的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。要在戶外大規(guī)模條件實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的微藻光驅(qū)固碳過程，需多維度和多視角地改造微藻藻株，使其適應(yīng)多樣性逆境條件。前期有相關(guān)綜述系統(tǒng)總結(jié)了優(yōu)化光合微藻在逆境脅迫下的工作穩(wěn)定性，開發(fā)能夠適應(yīng)規(guī)?；瘧?yīng)用需求的抗逆型微藻藻株和工程藻株以及優(yōu)化藻株的大規(guī)模收集性能和裂解提取工藝等［85］。雖然以螺旋藻為代表的一些微藻能夠在戶外高鹽、高堿的嚴(yán)苛培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)，對(duì)周邊環(huán)境微生物的入侵有較好的抵抗能力［89］，但是生物污染仍然是大規(guī)模生產(chǎn)大多數(shù)微藻的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一［90-91］。通過滅菌或添加抗生素能夠一定程度上降低微藻培養(yǎng)的染菌率，但無疑將極大增加生產(chǎn)成本和抗生素濫用、污染的風(fēng)險(xiǎn)［92］。近幾年，研究人員提出利用低成本的異型生物質(zhì)（如三聚氰胺）作為大量營(yíng)養(yǎng)素，結(jié)合對(duì)培養(yǎng)藻類代謝能力的改造，可以在不添加抗生素情況下就對(duì)工程藻株進(jìn)行選擇壓力篩選。2019年，Sel?o等［93］將三聚氰胺降解途徑引入到聚球藻（Synechococcussp.PCC 7002）中，利用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)提高工程菌對(duì)三聚氰胺的利用率，同時(shí)表達(dá)亞磷酸脫氫酶（PtxD：將亞磷酸轉(zhuǎn)化為磷酸鹽）使得聚球藻PCC 7002具有在亞磷酸鹽上生長(zhǎng)的能力。由于環(huán)境中大多數(shù)微生物不具備利用三聚氰胺和亞磷酸鹽的能力，以此可對(duì)此兩類非常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力作為一個(gè)選擇標(biāo)簽用于突變株的篩選［圖3（c）］。在未來研究中，需進(jìn)一步利用合成生物學(xué)拓展底物的利用范圍，在節(jié)約成本的同時(shí)降低雜菌的污染。

3.4 開發(fā)高效的防逃逸技術(shù)提高人工遺傳改造生命體的可控性

盡管合成生物技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用計(jì)劃徹底變革了微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的發(fā)展模式，展現(xiàn)出令人興奮的應(yīng)用前景，但轉(zhuǎn)基因藻株意外釋放到環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)無疑也引發(fā)了嚴(yán)重的生物安全擔(dān)憂［94］。例如，許多藍(lán)藻具有自然轉(zhuǎn)化的能力，當(dāng)轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻釋放到自然界中，可能會(huì)通過基因水平轉(zhuǎn)移的方式將重組基因在自然群體間傳播［95-96］。因此，需要開發(fā)高效的防逃逸技術(shù)提高人工遺傳改造生命的可控性。目前，防逃逸策略主要有被動(dòng)和主動(dòng)控制兩種［圖3（d）］［92，97］。2018年，Motomura等［98］基于營(yíng)養(yǎng)缺陷被動(dòng)型防逃逸策略，使PCC 7942的生長(zhǎng)和生存依賴于亞磷酸鹽（H3PO3），降低了其在自然界的生存能力。2019年，Zhou等［99］在PCC 7942和S.elongatusUTEX 2973中開發(fā)了鐵離子誘導(dǎo)毒性蛋白表達(dá)的主動(dòng)控制系統(tǒng)，逃逸測(cè)試結(jié)果表明，經(jīng)過3 d的處理細(xì)胞的逃逸率低于檢測(cè)監(jiān)測(cè)最低限10?9。另外，遺傳法則的正交化也是一種可行、高效的防逃逸策略。其主要通過利用人造的編碼單元和編碼原理（包括非天然核苷酸、非天然氨基酸以及正交化的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯過程）實(shí)現(xiàn)遺傳中心法則的正交化，構(gòu)建正交化的人工生命體，其必須完全依靠實(shí)驗(yàn)室或者人工制造環(huán)境中的特殊營(yíng)養(yǎng)供給才能維持活性，一旦進(jìn)入自然環(huán)境則無法繁衍增殖［100］。該策略為開發(fā)微藻防逃逸技術(shù)提供了一種潛在的方向。

4 總結(jié)

在全面推動(dòng)“碳達(dá)峰、碳中和”任務(wù)實(shí)施的大背景下，開發(fā)高效、低成本綠色環(huán)保的新技術(shù)具有重要的戰(zhàn)略意義。微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)因其具有利用太陽(yáng)能直接將二氧化碳轉(zhuǎn)化為重要生物基產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)而得到廣泛關(guān)注。得益于合成生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，對(duì)微藻天然光合代謝網(wǎng)絡(luò)重塑的深度和廣度都在不斷加強(qiáng)，越來越多的生物燃料和生物基化學(xué)品的微藻光驅(qū)固碳合成路線都已成功打通。微藻種質(zhì)資源的大規(guī)模挖掘和高通量分選、微藻遺傳和代謝機(jī)制的系統(tǒng)解析與動(dòng)態(tài)模擬以及蓬勃發(fā)展的合成生物技術(shù)，正在全面重塑微藻在生物技術(shù)和生物工程領(lǐng)域的發(fā)展模式和應(yīng)用場(chǎng)景。本文將微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)開發(fā)總結(jié)為“拆盲盒”“擠海綿”和“動(dòng)刀子”3種基本模式，并對(duì)其研究進(jìn)展、重要突破和代表性應(yīng)用示范進(jìn)行了介紹。在可見的未來，針對(duì)持續(xù)增長(zhǎng)的微藻種質(zhì)資源庫(kù)，在全面的“掃描性”種質(zhì)評(píng)價(jià)和基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，結(jié)合環(huán)境擾動(dòng)與人工改造的多維手段，充分激發(fā)微藻光合代謝潛力，深度拓展微藻固碳合成網(wǎng)絡(luò)，必將極大加強(qiáng)對(duì)微藻光合碳流的人工設(shè)計(jì)和駕馭能力。在代謝與合成之外，合成生物學(xué)技術(shù)手段還使得改變微藻細(xì)胞生理和代謝行為的時(shí)空限定成為可能，有望實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間、特定環(huán)境、特定信號(hào)響應(yīng)性的微藻放氧、固碳、產(chǎn)電等設(shè)定活動(dòng)，從而推動(dòng)微藻生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)、生物光伏、航空航天技術(shù)等全新場(chǎng)景和技術(shù)領(lǐng)域的交叉融合。當(dāng)然，隨著微藻生物技術(shù)應(yīng)用深度和廣度的全面拓展，微藻的遺傳、生理和代謝特性還需要針對(duì)工程放大和靶向應(yīng)用過程中特定的體系、條件和環(huán)境進(jìn)行適配性的設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化。目前，大多數(shù)微藻中合成生物學(xué)工具箱的開發(fā)仍明顯滯后于異養(yǎng)模式菌株，加強(qiáng)微藻合成生物學(xué)工具箱的開發(fā)和優(yōu)化對(duì)微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)發(fā)展有著重要的推動(dòng)意義。選擇優(yōu)良底盤性能的微藻對(duì)擴(kuò)大化培養(yǎng)具有重要意義，除了篩選速生和抗逆底盤菌、增強(qiáng)菌株穩(wěn)定性，還可通過合成生物學(xué)策略拓寬微藻對(duì)太陽(yáng)光的捕集波段、提高其對(duì)太陽(yáng)光的捕集效率和光能的傳遞效率等。擴(kuò)大化培養(yǎng)過程中，生物污染仍然是大規(guī)模生產(chǎn)大多數(shù)微藻的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一，拓展底物利用范圍，既可以降低生產(chǎn)成本，也可以抑制雜菌污染。無論是傳統(tǒng)的遺傳操作還是新興的代謝工程與基因組工程，其潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)都需要引起重視并針對(duì)性地進(jìn)行限制策略的開發(fā)，而高效的防逃逸技術(shù)將提高人工遺傳改造生命體的可控性。“雙碳”目標(biāo)引導(dǎo)下社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式轉(zhuǎn)型的大背景為微藻生物技術(shù)和生物工程發(fā)展提供了廣闊的平臺(tái)，而微藻合成生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展無疑正成為該領(lǐng)域的全新發(fā)展動(dòng)力，隨著越來越多高效、穩(wěn)定、安全的人工合成微藻光合細(xì)胞工廠的開發(fā)應(yīng)用，微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的發(fā)展將獲得更多的助力，相關(guān)產(chǎn)業(yè)落地應(yīng)用也必將不再遙遠(yuǎn)。