賀勝焜，劉美玲，朱坤鵬，靳連群，董德榮，張麗，張哲，楊超杰*，奉水東*

（1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽(yáng) 421200）（2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南鄭州 450000）（3.中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京 100071）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是革蘭氏陰性細(xì)菌，嗜鹽，常見(jiàn)于海水和海產(chǎn)品中，1951年在日本首次報(bào)導(dǎo)了由副溶血弧菌引起的食源性胃腸炎，是由于當(dāng)?shù)鼐用窠?jīng)常生食海鮮引起的[1]，此后世界各地都有副溶血弧菌胃腸炎暴發(fā)的報(bào)道[2-5]。在中國(guó)，常見(jiàn)因食用海產(chǎn)品造成食物中毒的現(xiàn)象，而副溶血弧菌是引起食物中毒的主要病原體，Li等[6]報(bào)道了2003～2017年期間國(guó)家食源性疾病暴發(fā)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)報(bào)告的數(shù)據(jù)，在已知病因的13 307起疫情中，11.30%的疫情是由副溶血弧菌引起的，僅次于毒蘑菇（31.80%）。

副溶血弧菌引起的食物中毒在夏季多發(fā)，通常是因?yàn)槭秤昧耸懿≡蚣?xì)菌毒素污染的食物，主要與不同種類的海產(chǎn)品有關(guān)，包括螃蟹、蝦、貝類、梭魚(yú)、魚(yú)類和牡蠣等[7,8]。人感染副溶血弧菌毒素的常見(jiàn)臨床癥狀包括胃痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱、寒戰(zhàn)和水樣大便。副溶血弧菌在感染過(guò)程中，利用其粘附因子與宿主細(xì)胞上的纖維連接蛋白和磷酸結(jié)合，釋放不同的效應(yīng)物和毒素到細(xì)胞質(zhì)中，造成細(xì)胞損傷和嚴(yán)重的疾病[9]。目前已知副溶血弧菌可產(chǎn)生三種溶血素，分別由tdh，trh和tlh基因編碼的熱穩(wěn)定直接溶血素（Thermostable Direct Hemolysin，TDH），TDH相關(guān)溶血素（TDH-Related Hemolysin，TRH）和熱不穩(wěn)定溶血素（Thermolabile Hemolysin，TLH）[10]。臨床分離株和環(huán)境分離株均含有tlh，又由于tlh的高度保守性，研究表明tlh可用于檢測(cè)副溶血弧菌[11]。

由于在人群和水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中過(guò)度使用抗生素[12]，許多抗生素在治療副溶血弧菌感染過(guò)程中已不再有效[13]。如包括氨芐西林在內(nèi)的第一代抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用，導(dǎo)致在治療副溶血弧菌感染過(guò)程中出現(xiàn)致病菌對(duì)氨芐西林敏感性降低，引起療效低下[14]。海產(chǎn)品是日常生活中很常見(jiàn)的食物，而研究副溶血弧菌的耐藥性趨勢(shì)，并建立適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)方案對(duì)確保海產(chǎn)品的安全至關(guān)重要。綜上所述，對(duì)海產(chǎn)品中的副溶血弧菌的毒力及耐藥性研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及菌株

26份樣品為采自食堂留樣和自采的蝦仁、花蛤、魷魚(yú)、皮皮蝦等樣品，其中食堂樣本18份，海邊自采樣本8份。菌株為上述水產(chǎn)中的10株副溶血弧菌分離株。副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Vibrio parahaemolyticus，ATCC17802）與質(zhì)量控制菌株大腸埃希菌（Escherichia coli，ATCC25922）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

硫代硫酸鹽檸檬酸膽汁蔗糖瓊脂（Thiosulfate Citrate Bile Sucrose Aga，TCBS）培養(yǎng)基、3wt%氯化鈉堿性蛋白胨水、氧化酶試紙、3wt%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面均購(gòu)自青島海博生物；DNA Marker DL2000、2×Taq MasterMix（Dye）購(gòu)自北京康為世紀(jì)；革蘭氏陰性菌藥敏鑒定復(fù)合板、PHOENIX鑒定肉湯、PHOENIX 藥敏指示劑、PHOENIX 藥敏肉湯管均購(gòu)自美國(guó)BD 公司；細(xì)菌DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-12 電泳儀、電泳槽，購(gòu)自北京六一儀器廠；PCR 儀、凝膠成像儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；臺(tái)式離心機(jī)、自動(dòng)移液槍，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒公司；自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BD 公司；濁度儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與初步鑒定

分離與純化參考《GB 4789.7-2013 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血弧菌檢驗(yàn)》，取樣品勻液1 mL 注入3wt%氯化鈉堿性蛋白胨水中，置恒溫箱內(nèi)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。對(duì)顯示生長(zhǎng)的增菌液，接種于TCBS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h 后記錄菌落顏色與形態(tài)。挑取可疑菌落（半透明、表面光滑的綠色菌落），接種于3wt%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂，37 ℃培養(yǎng)18 h。

挑取上述純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行初步鑒定，接種3wt%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，37 ℃培養(yǎng)24 h 記錄觀察結(jié)果；進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，用接種環(huán)挑取純單菌落涂抹于試驗(yàn)紙后觀察顏色變化；進(jìn)行16S rDNA 鑒定實(shí)驗(yàn)，將DNA 模板進(jìn)行PCR、產(chǎn)物電泳、測(cè)序確認(rèn)。

1.3.2 藥敏與鑒定

將經(jīng)過(guò)初步鑒定的可疑菌株使用BD 自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，在藥敏肉湯中滴加一滴藥敏指示劑，從培養(yǎng)箱中取出平板后使用無(wú)菌棉簽挑取適量菌落至鑒定肉湯管，混勻5 s 等待氣泡消失后使用比濁儀調(diào)整菌液濃度至0.5～0.6 麥?zhǔn)蠞岫?。從鑒定肉湯管中轉(zhuǎn)移25 μL 菌懸液至藥敏肉湯管中，輕柔顛倒混勻。將鑒定肉湯與藥敏肉湯分別傾倒入鑒定/藥敏復(fù)合板。使用BD 自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)與分析，革蘭氏陰性菌鑒定藥敏復(fù)合板包括18 種抗生素：氨芐西林（Ampicillin）、哌拉西林（Piperacillin）、四環(huán)素（Tetracycline）、莫西沙星（Moxifloxacin）、氯霉素（ Chloromycetin ）、甲氧芐啶（ Trimethoprim/Sulfonamides ）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）、頭孢吡肟（Cefepime）、頭孢噻肟（Cefotaxime）、慶大霉素（Gentamicin）、氨芐西林/舒巴坦（Ampicillin/sulbactam）、氨曲南（Aztreonam）、阿米卡星（Amikacin ）、阿莫西林/ 克拉維（Amoxicillin/Clavulanate）、美羅培南（Meropenem）、哌拉西林/他唑巴坦（Piperacillin/tazobactam）、頭孢他啶（Ceftazidime）、亞胺培南（Imipenem）。依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏結(jié)果。質(zhì)量控制菌株為大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922。

1.3.3 DNA 模板的制備

挑單菌落接種至5 mL 的3wt%氯化鈉堿性蛋白胨水，37 ℃搖菌過(guò)夜培養(yǎng)，使用TIANGEN 細(xì)菌DNA提取試劑盒提取DNA，提取所得DNA 使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度后，-20 ℃保存樣本DNA 模板用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 毒力基因檢測(cè)

對(duì)樣本進(jìn)行4種關(guān)鍵毒力基因的檢測(cè)，tdh、trh、tlh、toxR。其中毒力基因的引物參考文獻(xiàn)[15,16]，16S rDNA引物參考文獻(xiàn)[17]，引物合成與PCR產(chǎn)物測(cè)序委托北京天一輝遠(yuǎn)生物公司完成，引物詳情見(jiàn)表1。

表1 副溶血弧菌PCR擴(kuò)增引物信息Table 1 List of Vibrio parahaemolyticus genes and primers

1.3.5 全基因組測(cè)序及分析

提取菌株的DNA 后利用Qubit 3.0 檢測(cè)所得DNA的濃度，用超聲打斷儀將核酸打斷，對(duì)DNA進(jìn)行片段化處理，隨后進(jìn)行末端修復(fù)和3'端加Adapter，用磁珠對(duì)片段進(jìn)行篩選，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，最后對(duì)片段進(jìn)行磁珠純化，形成測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)檢合格后，利用Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。使用SPAdes（v2.04）[18]軟件進(jìn)行組裝，采用Prokka[19]進(jìn)行注釋。所采用的副溶血弧菌參考菌株來(lái)自參考文獻(xiàn)，這些菌株的基因組從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得，用于基因組分析。本研究所用到的基因組序列信息見(jiàn)表2。

表2 美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心提供的副溶血弧菌分離基因組用于系統(tǒng)基因組分析Table 2 Locally and globally diverse Vibrio parahaemolyticus isolates genomes used for phylogenomic analyses available at the National Center for Biotechnology Information

使用Snippy（v4.6.0）[20]構(gòu)建基于核心單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，副溶血弧菌RIMD2210633 作為參考菌株。即BWA MEM 1.2.0[20]將自身的基因組映射至參考菌株序列，F(xiàn)reebayes（v1.3.5）[21]識(shí)別SNPs，Gubbins（v2.4.1）[22]識(shí)別并去除同源重組，SNP-sites（v2.5.1）[23]提取核心SNP，使用IQ-tree（v2.1.4）[24]軟件構(gòu)建最大似然樹(shù)，采用一般時(shí)間可逆核酸替代模型和GAMMA 的替代模型，ITOL 網(wǎng)站（https://itol.embl.de/）美化發(fā)育樹(shù)。

使用Resistance Gene Identifier（RGI，v5.1.1）[25]與綜合抗生素耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）[26]進(jìn)行比對(duì)。使用BLAST[27]與毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)（Virulence Factor Database，VFDB）[28]進(jìn)行毒力基因比對(duì)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)與表格編輯，制作基因注釋結(jié)果的文本文件上傳至ITOL 網(wǎng)站可視化為系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離與鑒定結(jié)果

初篩結(jié)果顯示10 株分離菌在TCBS 培養(yǎng)基上呈典型副溶血弧菌特征，圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感；上述分離株還具備如下特征：在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂時(shí)反應(yīng)變黃，不產(chǎn)氣；氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性；考慮到各檢測(cè)方法的局限性，在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上再結(jié)合自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)結(jié)果與16S rDNA 鑒定綜合分析，最終確定樣本中檢出的分離株為副溶血弧菌。

樣本分離鑒定情況見(jiàn)表3，對(duì)餐飲以及海產(chǎn)品采樣的26 份樣本中，其中10 份樣本分離鑒定出副溶血弧菌，檢出率為38.46%?；ǜ驑颖局袡z出最多，采樣6份，分離出5 株副溶血弧菌。分離株檢出情況受采樣地點(diǎn)、樣品類型和檢測(cè)方法影響較大。Xie 等[29]在對(duì)511 份中國(guó)即食食品的研究中分離鑒定出了39 株副溶血弧菌，檢出率為7.63%。Ying 等[30]在來(lái)自中國(guó)11 個(gè)省的504 份海鮮樣本中檢出98 株副溶血弧菌，檢出率為19.44%。受條件所限，本研究中的樣本采集數(shù)量較少，分離檢出率高于其它研究，特別是在花蛤樣本中，而花蛤是北戴河地區(qū)最常見(jiàn)的食用海產(chǎn)品。

表3 海產(chǎn)品樣本中副溶血弧菌的檢出情況Table 3 Detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表4所示，用鑒定藥敏復(fù)合板對(duì)10 株副溶血弧菌進(jìn)行了18 種抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素氨曲南耐藥率為100.00%，氨芐西林中介耐藥率為100.00%，對(duì)其余16 種抗生素敏感。隨著亞洲水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)步擴(kuò)張，為了增加產(chǎn)量，水產(chǎn)養(yǎng)殖者使用不同的抗生素來(lái)預(yù)防和治療水產(chǎn)品中的致病菌感染[31]。既往的研究中，不同國(guó)家來(lái)源的副溶血弧菌的耐藥性模式存在差異。與本文結(jié)果相似，Pazhani 等[32]報(bào)導(dǎo)了鏈霉素和氨芐西林耐藥副溶血弧菌。Elmahdi 等[12]發(fā)現(xiàn)一些菌株對(duì)氯霉素、四環(huán)素或環(huán)丙沙星表現(xiàn)出耐藥性，其中部分為臨床治療中使用的一線藥物。

表4 10 株副溶血弧菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Antimicrobial resistance of 10 Vibrio parahaemolyticus isolates

2.3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

10 株副溶血弧菌的毒力基因分布情況見(jiàn)表5。由表4可知，tlh基因攜帶率為100.00%、toxR基因攜帶率為100.00%，所有分離副溶血弧菌均不攜帶tdh基因或trh基因。與本文相似，Xie 等[29]調(diào)查了中國(guó)511 份即食食品樣品，發(fā)現(xiàn)所有分離株均不攜帶tdh和trh。Li 等[33]調(diào)查了我國(guó)15 個(gè)省份的905 份食品（含即食食品、魚(yú)類和蝦類）樣本，分離株中tdh、trh或兩者均為陽(yáng)性的菌株分別為9.90%、19.80%和3.96%；Ying 等[30]報(bào)道華南海產(chǎn)品分離株中tdh和trh基因的攜帶率分別為8.16%和12.24%；于紀(jì)棉等[34]報(bào)道寧波口岸進(jìn)口水產(chǎn)品中副溶血弧菌的tdh和trh攜帶率分別為0.78%和0%。但亦有研究報(bào)道，大約10.00%的臨床菌株不含tdh和/或trh[32]，而環(huán)境分離的不攜帶tdh和/或trh的副溶血弧菌也能對(duì)人類胃腸道細(xì)胞產(chǎn)生高度的細(xì)胞毒性[35-37]。早期研究發(fā)現(xiàn)toxR作為霍亂毒素操縱子的調(diào)控基因[38]，其在副溶血弧菌的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)TDH、TRH的產(chǎn)生[39-41]。Li 等[33]報(bào)道了檢出的202 株副溶血弧菌，toxR攜帶率為100.00%，這與本研究結(jié)果一致。

表5 10 株副溶血弧菌的4 種毒力基因鑒定結(jié)果Table 5 Identification results of 4 virulence genes of 10 Vibrio parahaemolyticus

2.4 全基因組分析結(jié)果

2.4.1 遺傳特征分析

分離株的序列類型（Sequence Type，ST）結(jié)果如表6所示，副溶血弧菌是一個(gè)高度多樣化的微生物[42]，共鑒別出9 種不同的ST 型（ST413、ST1073、ST890、ST490、ST385、ST2481、ST472、ST1520、ST177）。如圖1所示的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合樣本來(lái)源進(jìn)行分析，10 株分離株除了BDH2021-11 與BDH2021-02，其余菌株聚成一簇；BDH2021-23 為海邊自采樣品分離出的菌株，與一部分的副溶血弧菌親緣關(guān)系較近，這些菌株基本上來(lái)源于鄰近國(guó)家的臨床樣本，如：日本、印度、孟加拉國(guó)；兩食堂餐飲樣本分離株BDH2021-12、BDH2021-13 為相同的ST1073，基因序列相似程度高，親緣關(guān)系較近并與海邊自采樣本分離株BDH2021-22聚成一簇。

表6 副溶血弧菌的多位點(diǎn)序列分析結(jié)果Table 6 The multilocus sequence analysis result of Vibrio parahaemolyticus

2.4.2 耐藥基因分析

如圖1中耐藥基因分布，本研究的10 株副溶血弧菌分離株都含有β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CARB-18，都不含CARB-20、CARB-21，而參與比對(duì)的大部分美國(guó)菌株含有CARB-21；參與比對(duì)的大部分菌株含有四環(huán)素類抗生素耐藥基因TXR；1 株分離菌（BDH2021-04）含有抗生素外排相關(guān)基因mexE，其它菌株不含有，在副溶血弧菌相關(guān)研究中也少有報(bào)導(dǎo)。對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行18 種抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)，全部分離株表現(xiàn)為對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素氨曲南耐藥，對(duì)氨芐西林中敏。分離株都含有耐藥基因CARB-18，其編碼能使抗生素失活的β-內(nèi)酰胺酶。與本文相似，F(xiàn)elipe 等[43]從巴西里約熱內(nèi)盧的一個(gè)熱帶河口分離出1 株多重耐藥副溶血弧菌中檢測(cè)到CARB-18。NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)提示，關(guān)于CARB-18的報(bào)道主要是關(guān)于副溶血弧菌，在其它類型菌株的基因組中較少被報(bào)道。結(jié)合上文所述耐藥表型推測(cè)，此基因可能是導(dǎo)致本研究所檢出副溶血弧菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性增強(qiáng)的重要基因。

分離株BDH2021-04 不同于被分析的其它副溶血弧菌，其基因組中含有抗生素外排相關(guān)基因mexE，其在副溶血弧菌中報(bào)道較少。抗生素外排可導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)多藥耐藥表型，被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)菌早期適應(yīng)感染部位抗生素的重要因素，例如酶抗性或靶突變[44]。mexE在銅綠假單胞菌相關(guān)研究中被報(bào)道較多，膜融合蛋白mexE為銅綠假單胞菌多重耐藥外排系統(tǒng)的主要組分之一[45]。其在分離的耐藥副溶血弧菌中被檢出，需引起關(guān)注。

2.4.3 毒力基因分析

如圖1中毒力基因分布，本研究分離株不含tdh、trh，這與毒力基因的PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。即使在沒(méi)有這些溶血素的情況下，副溶血弧菌仍然具有致病性，表明存在其他毒力因素。不同菌株可能采用不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)致病性[46]。Mahoney 等[47]報(bào)道了缺乏tdh和/或trh的副溶血弧菌環(huán)境分離株產(chǎn)生了其它毒性因素，如細(xì)胞外蛋白酶、生物膜、鐵載體，并對(duì)人類細(xì)胞具有高度的細(xì)胞毒性。所以除了被報(bào)道較多的tdh、trh毒力基因，通過(guò)基因組分析毒力基因，關(guān)注了其它可能導(dǎo)致副溶血弧菌致病的毒力基因。本研究分離株與參比的國(guó)外副溶血弧菌相比，差異主要表現(xiàn)在甘露糖敏感的血凝素（Mannose-sensitive Hemagglutinin，MSHA）菌毛相關(guān)基因，分離株BDH2021-11 同時(shí)含有mshB、mshC、mshD；親緣關(guān)系較近的BDH2021-12、BDH2021-13、BDH2021-22 同時(shí)含有mshC、mshD；大部分菌株還含有較多鞭毛相關(guān)基因（flgA、flgN、flgM、flgB、motA、motB、motY、lafB、lafE等）、亞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)毒力基因（vctD、vctP、vctF）和其它毒力基因。研究報(bào)道副溶血弧菌MSHA 菌毛具有凝集素功能，能激活三型分泌系統(tǒng)（Type Three Secretion System，TTSS）介導(dǎo)的致病性，MSHA 菌毛在細(xì)菌-宿主細(xì)胞粘附和隨后對(duì)Caco-2人腸上皮細(xì)胞的致病中起重要作用[48]。所以缺乏毒力基因tdh或trh的副溶血弧菌的高檢出率也給飲食健康帶來(lái)安全隱患，日后需加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

圖1 不同國(guó)家來(lái)源副溶血弧菌進(jìn)化樹(shù)與耐藥因子、毒力因子分布熱圖Fig.1 Phylogenetic tree and distribution of drug resistance and virulence factors of Vibrio parahaemolyticus from different countries

3 結(jié)論

對(duì)10 株副溶血弧菌分離株進(jìn)行18 種抗生素耐藥分析，分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性增強(qiáng)，抗生素氨曲南耐藥率為100.00%，氨芐西林中介耐藥率為100.00%；對(duì)分離株基因組進(jìn)行耐藥基因分析，分離株都含有β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CARB-18，都不含CARB-20、CARB-21，這與耐藥表型相對(duì)應(yīng)，推測(cè)此基因是導(dǎo)致本研究所檢出副溶血弧菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性增強(qiáng)的重要基因；與之不同的是，國(guó)外分離株攜帶的主要基因型為CARB-20、CARB-21；發(fā)現(xiàn)一株含有抗生素外排相關(guān)基因mexE副溶血弧菌，此基因在同類研究中較少報(bào)道，在銅綠假單胞菌相關(guān)研究中報(bào)道較多。

對(duì)10 株副溶血弧菌分離株進(jìn)行4 種主要毒力基因檢測(cè)，分離株都不攜帶tdh和trh，tlh基因攜帶率為100.00%，toxR基因攜帶率為100.00%；對(duì)分離株基因組進(jìn)行毒力基因分析，大部分菌株含有較多鞭毛相關(guān)基因（flgA、flgN、flgM、flgB、motA、motB、motY、lafB、lafE等）、亞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)毒力基因（vctD、vctP、vctF）和其它毒力基因；一株分離株同時(shí)含有MSHA菌毛相關(guān)基因mshB、mshC、mshD。

食堂樣本、自采樣本副溶血弧菌分離株的耐藥表型和毒力基因擴(kuò)增結(jié)果都未出現(xiàn)差異，差異主要體現(xiàn)在菌株間的遺傳多樣性，對(duì)10 株副溶血弧菌共鑒定出9 個(gè)ST 型。

對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行遺傳特征分析，其中食堂分離的部分菌株與當(dāng)?shù)睾Ｑ笊锓蛛x株同源性較高，部分菌株與納入分析的國(guó)外菌株同源性較高，提示當(dāng)?shù)馗比苎【鷣?lái)源比較復(fù)雜。同時(shí)，我們?cè)趯?duì)周邊海鮮市場(chǎng)調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著人們生活水平的提高，北戴河市售海產(chǎn)品種類豐富、來(lái)源廣泛，其中還存在有大量進(jìn)口商品。這為外來(lái)海產(chǎn)品攜帶副溶血弧菌進(jìn)入北戴河海鮮市場(chǎng)創(chuàng)造了條件。需警惕可能存在國(guó)外副溶血弧菌污染源，加強(qiáng)對(duì)進(jìn)口海產(chǎn)品中副溶血弧菌的監(jiān)測(cè)。

4 展望

食源性病原菌副溶血弧菌引起的腹瀉是一個(gè)長(zhǎng)期存在的公共衛(wèi)生問(wèn)題。北戴河地區(qū)海產(chǎn)品中副溶血弧菌的檢出率高，這引起了我們的重視，但因時(shí)間和條件所限，未進(jìn)行大規(guī)模采樣。副溶血弧菌的相關(guān)研究仍然有很多工作需要進(jìn)一步深入，例如：毒力基因缺乏株與致病性之間的聯(lián)系及致病機(jī)制；對(duì)即食食品中副溶血弧菌流行情況的監(jiān)測(cè)相對(duì)缺乏；多耐藥株的流行分布規(guī)律及其耐藥機(jī)制的研究，以期為今后副溶血弧菌感染的治療和防控提供科學(xué)依據(jù)。