高飛，李友英，范瀟，張衍坤，候冉冉*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院，山東青島 266109）（2.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學研究所，四川甘孜 626000）

隨著社會的飛速發(fā)展，我國已經(jīng)逐步進入老齡化社會，人口老齡化問題是我國當今亟待解決的關(guān)鍵問題。人體免疫力隨年齡增加而呈現(xiàn)降低趨勢，因此，老年病就容易趁虛入侵老年人。那么，要解決我國老齡化所帶來的問題，首先就是要降低我國老年人老年病的發(fā)病率，其中，提高老年人口機體免疫力是最重要的一環(huán)。青少年是祖國的未來，青少年時期身體快速發(fā)育，當機體免疫力出現(xiàn)問題時，身體容易受到外邪侵染，威脅機體健康，所以，不論是老年或是少年，提高機體免疫力都是預防疾病和保持身體健康的根本。現(xiàn)如今，“治未病”的健康觀念越來越被人們了解與接受，而保健食品可調(diào)節(jié)身體功能，可作為膳食調(diào)節(jié)劑，增強機體免疫力，維持身體健康[1-3]。

微量元素是動植物體不可缺少的重要成分，硒是這些微量元素中尤為重要的一種，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎等多種藥理活性[4,5]。因此，硒的缺乏會導致機體產(chǎn)生一系列的不良癥狀，如免疫系統(tǒng)損傷、心血管疾病、甲狀腺激素代謝異常甚至增加癌癥產(chǎn)生的風險。為滿足人體對硒的日常需求，補硒是必要的途徑，尤其是對于硒含量水平低的人群和缺硒地區(qū)。部分無機硒和有機硒如亞硒酸鹽、硒代蛋氨酸等可用于人體硒補充劑，然而，無機硒使用的安全窗口窄，生物轉(zhuǎn)化的天然有機硒制備耗時且產(chǎn)量低，無法滿足人民日益對硒的營養(yǎng)需求。近年來，隨著納米技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的快速發(fā)展，硒納米顆粒的制備和活性逐漸引起科研工作者的關(guān)注。與其他無機硒和有機硒化合物相比，硒納米顆粒具有更高的抗癌、抗氧化、低毒等效果，但硒納米顆粒極易聚集沉淀，很難用于臨床或作為食品添加劑[6]。作為自然界四大生命活動物質(zhì)之一的多糖，種類多、來源廣。大量研究證實，天然多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗炎癥、抗氧化等生物活性[2,3]。多糖結(jié)構(gòu)復雜，分子內(nèi)含有大量親水基團，為了克服硒納米顆粒不穩(wěn)定、易聚沉的缺陷，可利用多糖修飾硒納米顆粒形成穩(wěn)定的多糖-硒納米顆粒。由于天然多糖具有無毒性、生物相容性良好、可生物降解等特點，且制備得到的多糖硒納米顆粒穩(wěn)定性較好，使得多糖在功能化硒納米顆粒的制備中的應用越來越廣泛[7]。天然多糖-硒納米顆粒與其他無機硒或硒單質(zhì)比，具有粒徑小、生物活性更高、毒性較低的優(yōu)點[8]。本研究中所采用的藏黃連，為玄參科植物兔耳草屬多年生草本植物圓穗兔耳草Lagotis brachystachysMaxim.和全緣葉兔耳草Lagotis integraW.W.Smith.的根，別名洪連、洪輪、兔耳草等，具有清熱解毒、利濕平肝、行血調(diào)經(jīng)之功效。用于發(fā)熱煩渴、頭痛眩暈、月經(jīng)不調(diào)、藥食中毒等。本研究從藏黃連中提取分離藏黃連多糖（Coptesteeta Polysaccharide，CTP），綠色還原亞硒酸鈉合成藏黃連多糖-硒納米顆粒（CTP-SeNPs）[9]，探究其結(jié)構(gòu)表征、抗氧化活性和抗炎活性，為研發(fā)富硒中藥多糖保健食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

藏黃連，購于四川甘孜，經(jīng)鑒定為藏黃連正品；透析袋，截留分子量8 000～12 000 u，上海源葉生物科技有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-苦基肼）、ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、總還原力試劑盒（FRAP），購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、DMEM、青鏈霉素（PS）、地塞米松，購自Sigma；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BC-J80s CO2培養(yǎng)箱、YXQ-LS-30S 立式壓力滅菌器，上海博訊有限公司；CKX41 倒置顯微鏡，Olympus Corporation；LGJ-18 真空冷凍干燥機，北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；TDL-4C 差速離心機，上海安亭電子儀器有限公司；MK3 酶標儀，Thermo Multiskan；Mastersizer 3000 粒度儀，Malvern Panalytical；Nicolet iS5 紅外光譜儀，Thermo Fisher；SU3800 掃描電子顯微鏡，Hitachi；ARL3000 X 射線衍射儀，760CRT Thermo Scientific紫外可見光譜儀，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藏黃連多糖的提取分離

取500 g 藏黃連，粉碎，過80 目篩，加15 倍量蒸餾水，浸泡過夜，煎煮2.5 h，重復三次，離心合并濾液。將濾液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，65 ℃濃縮至500 mL，冷卻至室溫后，加入2 L 無水乙醇，攪拌后靜置于4 ℃冰箱中，過夜。5 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥，收集藏黃連多糖[10]。

1.3.2 Sevage 法除蛋白

Sevage 法除蛋白方法參考文獻[11]。配制藏黃連多糖濃度為10 mg/mL 的溶液1 740 mL，加入60 mL Sevage 混合液（V正丁醇:V三氯甲烷=1:4）。攪拌45 min，靜置30 min 后分層，保留上層棄去下層，重復8 次。濃縮，冷凍干燥，得去蛋白藏黃連多糖（CTP）。

1.3.3 多糖得率的測定

依據(jù)參考文獻，采用苯酚-硫酸法測多糖含量，標準曲線方程為：

式中：

x——質(zhì)量濃度，μg/mL；

y——吸光度。

配制多糖溶液，檢測其吸光度，并帶入標準曲線方程計算出質(zhì)量濃度，根據(jù)文獻公式計算多糖得率[12]：

式中：

B——多糖得率，%；

c——質(zhì)量濃度，μg/mL；

n——稀釋倍數(shù)；

V——體積，mL;

m——藏黃連質(zhì)量，g。

1.3.4 藏黃連多糖-硒納米顆粒（CTP-SeNPs）的制備

1.3.4.1 藏黃連多糖濃度的篩選

分別將0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的CTP 溶液，等體積逐滴加入到20 mL 的50 mmol/L Na2SeO3溶液中，避光攪拌3 h 后，滴加50 mmol/L 的20 mL 抗壞血酸溶液，超純水補至總體積200 mL，繼續(xù)避光攪拌12 h。反應結(jié)束，將混合液裝入截留分子量為8 000～12 000 u 透析袋，4 ℃下避光蒸餾水透析72 h，取透析后的反應液測量粒徑，真空冷凍干燥得藏黃連-硒納米顆粒（CTP-SeNPs），備用。

1.3.4.2 pH 值的測定

蒸餾水配制3 份CTP-SeNPs（10 mg/mL），使用數(shù)字pH 計測定樣品溶液的pH 值。

1.3.4.3 保水能力和保油能力測定

分別將樣品粉末（500 mg）與蒸餾水（5 g）或大豆油（5 g）混合，室溫放置1 h，每隔10 min 攪拌一次，12 000 r/min 離心后除去上清液，稱量殘渣，測定WRC/ORC。按每克干樣品的水/大豆油克數(shù)計算[13]。

1.3.5 CTP-SeNPs 的結(jié)構(gòu)表征

1.3.5.1 粒徑分布

配制濃度為1 mg/mL 的CTP-SeNPs 溶液，使用納米顆粒度儀檢測其粒徑分布。

1.3.5.2 紅外光譜分析

分別稱取2 mg CTP、CTP-SeNPs、SeNPs，將適量研磨均勻、干燥的溴化鉀粉末與樣品混合，再次研磨均勻后壓片，置于紅外光譜儀中，在400～4 000 cm-1范圍進行掃描[14]。

1.3.5.3 掃描電子顯微鏡分析（SEM）

分別取2 mg 干燥好的CTP、CTP-SeNPs，噴金后于掃描電鏡下分析[14]。

1.3.5.4 X 射線衍射分析（XRD）

將2 mg干燥的CTP-SeNPs置于玻片上，鋪勻壓緊，放入儀器樣品室，檢測其元素峰。

1.3.5.5 紫外可見吸收光譜

分別配制1 mg/mL CTP、CTP-SeNPs 和SeNPs 溶液，置于紫外分光光度計中，在200～800 nm 范圍內(nèi)全波長掃描[14]。

1.3.5.6 剛果紅測試

2.0 mL 剛果紅溶液（0.2 mol/L）、4.0 mL 不同濃度的NaOH 溶液（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）與2 mL CTP（2.0 mg/mL）混合，室溫避光攪拌15 min。分別取各混合溶液于紫外分光光度計中，在200～800 nm范圍內(nèi)全波長掃描，記錄最大吸收波長，記作λmax。用2.0 mg/mL 的凝膠多糖（Curdlan）替代CTP，作為對照。

1.3.6 CTP 和CTP-SeNPs 體外抗氧化活性

1.3.6.1 DPPH 自由基清除

用無水乙醇配制濃度為0.05 mmol/L DPPH 溶液備用。分別將1 mL不同濃度（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）的CTP、CTP-SeNPs 和抗壞血酸（Vc）溶液置于試管中，分別加入2 mL DPPH 溶液，使用渦旋儀混勻，置于室溫下避光靜置30 min，之后測量混合液517 nm 處吸光度，記錄吸光度值，記為A樣品；測定不同濃度CTP、CTP-SeNPs、Vc 的吸光度，記為A0；取1 mL 蒸餾水于試管中，加入2 mL DPPH 溶液，測定其吸光度，記為A1[15]。DPPH 自由基清除率（B，%）的計算：

1.3.6.2 羥自由基清除

用蒸餾水配制濃度為70 mmol/L 的FeSO4溶液、用無水乙醇配制濃度為70 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、將CTP、CTP-SeNPs 和抗壞血酸（Vc）配制成0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 的六個濃度，向試管中依次加入1 mL FeSO4溶液、1 mL 水楊酸-乙醇溶液、1 mL 樣品溶液（CTP、CTP-SeNPs、Vc），最后加入1 mL 體積分數(shù)30% H2O2溶液，使用渦旋儀混勻，在室溫條件下，靜置30 min，測量在510 nm 下吸光度。羥自由基清除能力的計算：

式中：

C——羥自由基清除率，%；

A樣品——FeSO4+水楊酸+樣品+H2O2；

以華南師范大學繼續(xù)教育學院為例，由于C語言程序設計課程一般一周4節(jié)課，學生參加全國統(tǒng)一考試時間為每年的4月份和10月份。C語言程序設計課程是實踐性比較強的課程，要求學生掌握基本的編程語句、語法規(guī)則，經(jīng)過動手編程提升學生的編程邏輯思維能力，為后續(xù)的專業(yè)課夯實基礎(chǔ)，但因?qū)嶒炚n時缺乏，造成學生動手編輯能力較差，授課效果不理想。

A0——FeSO4+水楊酸+樣品+蒸餾水(1 mL)；

A1——FeSO4+水楊酸+蒸餾水+H2O2。

1.3.6.3 ABTS+自由基清除

用蒸餾水配制濃度為2 mmol/L 的ABTS 溶液和濃度為70 mmol/L 的K2S2O8溶液。取配制的ABTS 溶液與K2S2O8溶液以1:4 的比例混合均勻，在室溫避光條件下靜置12～16 h，得到ABTS+·溶液，再使用PBS 溶液稀釋ABTS+·溶液直至該溶液在Abs=734 nm 處吸光度為（0.70±0.02）。將CTP、CTP-SeNPs 和抗壞血酸（Vc）分別配制成0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 六個濃度。

分別將10 μL 的不同濃度的CTP、CTP-SeNPs 和抗壞血酸（Vc）加入96 孔細胞板中，每個濃度重復三個孔，向每個孔加入200 μL 孵育好的ABTS+·溶液，混勻6 min 后檢測各孔在734 nm 處的吸光度（A2）；空白孔加入10 μL 的不同樣品溶液和200 μL 的PBS 溶液，混勻6 min 后檢測其在734 nm 處的吸光度（A0）；對照孔加入210 μL 的ABTS+·溶液，檢測其吸光度（A1）[16]。ABTS+·清除率（D，%）計算：

1.3.6.4 總抗體氧化能力檢測（FRAP 法）

1.3.7 CTP 和CTP-SeNPs 體外活性研究

1.3.7.1 CTP 和CTP-SeNPs 細胞增殖活性

5 000個RAW264.7 細胞（100 μL）分別加入96孔板細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃，體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后分別將用PBS 配制的1.0 mg/mL 的CTP 和CTP-SeNPs 倍比稀釋后（100 μL）加入至細胞中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h 后棄去孔中溶液，每孔加入150 μL DMSO溶液，震蕩10 min，酶標儀檢測OD570[17]。

1.3.7.2 CTP 和CTP-SeNPs 抗炎活性

5 000個RAW264.7 細胞（100 μL）分別加入96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃，體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每孔加入100 μL LPS 溶液（0.2 μg/mL），繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，分別將用PBS 配制的1.0 mg/mL 的CTP 和CTP-SeNPs倍比稀釋后（100 μL）加入到細胞中，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h 后棄去孔中溶液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，震蕩10 min，酶標儀檢測OD570。同樣地，藥物加入細胞中，培養(yǎng)24 h 后，取上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書測定上清中的IL-6 的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 26 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），使用GraphPad 8.0.2 與Origin 2018 進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CTP 的制備及理化性質(zhì)

藏黃連多糖的得率為11.84%，去蛋白藏黃連多糖（CTP）得率為7.72%。CTP 的pH 值為6.42±0.05，保水能力最高值為12.07 g/g，保油能力為11.28 g/g。

2.2 剛果紅試驗

如圖1所示，隨著NaOH 濃度的增大，凝膠多糖的λmax也隨之增加（紅移），凝膠多糖是可知的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖，而試驗中藏黃連多糖也表現(xiàn)出相同紅移情況[18]。因此，推測CTP 可能具有三螺旋構(gòu)象。

圖1 剛果紅檢測Fig.1 Congo red test

2.3 CTP-SeNPs 的表征

2.3.1 CTP-SeNPs 粒徑分布

各濃度藏黃連多糖合成CTP-SeNPs 納米顆粒，如圖2a 所示，當CTP 濃度為1.5 mg/mL 時，CTP-SeNPs的粒徑分布相對比較集中且較小，因此，篩選1.5 mg/mL 的CTP 作為最佳濃度。如圖2b 所示，結(jié)果分析，CTP-SeNPs 的平均粒徑為101.96 nm。在前人[5,8,16]的研究中，合成多糖-硒納米顆粒平均在60 nm～120 nm之間，CTP-SeNPs 的平均粒徑與其研究結(jié)果大致符合。

圖2 藏黃連多糖溶液制備CTP-SeNPsFig.2 Preparation of CTP-SeNPs from Coptesteeta polysaccharide solution

2.3.2 CTP-SeNPs 的紫外可見吸收光譜

如圖3顯示，CTP-SeNPs 最大吸收峰值出現(xiàn)位置小于200 nm，而SeNPs 在480 nm 處有最大吸收峰值，其位于可見光區(qū)，說明SeNPs 呈現(xiàn)橙黃色[19]。有文獻報道，當納米顆粒粒徑約200 nm 時在紫外光譜的600 nm 左右有最大吸收峰；當納米顆粒粒徑小于100 nm 左右時，其在紅外光譜的最大吸收峰低于300 nm[20,21]。本研究中經(jīng)DLS 檢測CTP-SeNPs 的平均粒徑為101.96 nm，這與文獻報道相似。研究表明，核酸紫外最大吸收峰出現(xiàn)在260 nm 處[21]，在CTP 和CTP-SeNPs 的全波長掃描圖譜中，在260 nm 處均未出現(xiàn)吸收峰，表明CTP 中核酸含量較低。蛋白質(zhì)紫外最大吸收峰出現(xiàn)在280 nm 處[22]，在CTP 的全波長掃描圖譜中，CTP 在280 nm 處未表現(xiàn)出吸收峰，說明CTP 中無蛋白存在，而CTP-SeNPs在280 nm附近出現(xiàn)吸收峰，表明SeNPs 與CTP 相互作用形成復合物CTP-SeNPs。在Wang[14]的研究中顯示，與RTFP-3（刺梨多糖）相比，RP3-SeNPs（刺梨多糖硒納米顆粒）在278 nm 處有吸收峰，推測SeNPs 與RTFP-3 相互作用形成了復合物，該結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

圖3 CTP、CTP-SeNPs 和SeNPs 的紫外全波長掃描Fig.3 Full-wavelength UV scanning of CTP,CTP-SeNPs and SeNPs

2.3.3 紅外光譜分析

CTP、SeNPs 和CTP-SeNPs 紅外光譜見圖4。CTP在3 446 cm-1、1 653 cm-1處的振動吸收峰分別為-OH、-C=O 的振動吸收峰，3 016 cm-1的吸收峰是由于CH2基團的C-H 伸縮和彎曲振動所形成的，以上表明CTP中有多糖的特征吸收峰的存在。CTP-SeNPs 中-OH 拉伸震動形成的吸收峰和-C=O 吸收峰分別為3 430 cm-1、1 631 cm-1，表明CTP-SeNPs 中有多糖的存在。CTP-SeNPs 在2 858 cm-1附近的吸收峰與SeNPs 在2 854 cm-1附近的吸收峰類似，表明合成的CTP-SeNPs中有SeNPs 的存在。與CTP 相比，CTP-SeNPs 的-OH吸收峰從3 446 cm-1移至3 430 cm-1，C=O 吸收峰從1 653 cm-1移至1 631 cm-1，C-O-C 吸收峰從1 253 cm-1移至1 251 cm-1，均發(fā)生小幅度藍移，推測SeNPs 的Se 原子與CTP 的O 原子相結(jié)合[14]。穆靜靜等[5]的研究中，普洱茶多糖-納米硒的譜圖中無新吸收峰產(chǎn)生，推測以天然多糖為模板制備多糖硒納米顆粒時，天然粗多糖的多糖部分和蛋白質(zhì)部分的-OH、-C=O 等基團通過非共價鍵的形式與硒原子結(jié)合，形成穩(wěn)定的多糖-硒納米顆粒復合物。前期[23,24]也有相似的研究報道。

圖4 FT-IR 圖譜分析Fig.4 FT-IR spectrum analysis

2.3.4 SEM-EDS 分析

掃描電鏡觀察CTP/CTP-SeNPs 的表觀形態(tài)。圖5a、5b 為藏黃連多糖在300 倍與1 200 倍下的掃描圖，結(jié)果顯示藏黃連多糖表面為片狀，邊緣呈針狀；圖5d、5e 為CTP-SeNPs 在300 倍和1 200 倍下的掃描圖，結(jié)果顯示Se 納米顆粒子覆蓋在CTP 表面，片狀加厚，邊緣圓潤。CTP 和CTP-SeNPs 能譜結(jié)果，如圖5c 和5f 所示，藏黃連多糖-硒納米顆粒中Se 在五種元素（C、O、Se、S、Ca）中的質(zhì)量百分數(shù)為11.66%。Xiao 等[25]報道冬蟲夏草多糖-硒納米顆粒中Se 的質(zhì)量百分數(shù)僅為9.86%，Zhu 等[26]研究多糖-硒納米顆粒中Se 的質(zhì)量百分數(shù)為78.4%，而Chen 等[27]研究中的多糖-硒納米顆粒中Se 的質(zhì)量百分數(shù)為高達90.96%，由此，不同多糖-硒納米顆粒中Se 的質(zhì)量百分數(shù)不等，究其原因可能是多糖-硒納米顆粒的制備方法以及多糖與硒納米間的結(jié)合方式有關(guān)。本研究中藏黃連多糖-硒納米顆粒的硒含量相對文獻報道偏低，這有助于在應用藏黃連多糖-硒納米顆粒時對硒含量的控制，避免過多的硒產(chǎn)生毒性作用而影響其生物活性。

圖5 CTP 和CTP-SeNPs 的SEM-EDS 圖譜Fig.5 SEM-EDS spectra of CTP and CTP-SeNPs

2.3.5 XRD 分析

如圖6所示，CTP-SeNPs 的XRD 結(jié)果與標準Se比色卡（PDF：32-0992）對比，標準硒的2θ在24°和31°處有兩個強烈的反射峰，表明硒的存在。CTP-SeNPs顯示出與標準Se 有相似的反射峰，在前人的研究[25,28]結(jié)果中，多糖-硒納米顆粒都表現(xiàn)出與Se 比色卡相似的強烈反射峰，表明CTP-SeNPs 中有Se 存在，CTP-SeNPs被合成成功。

圖6 CTP-SeNPs 的XRD 分析Fig.6 XRD analysis of CTP-SeNPs

2.4 CTP 和CTP-SeNPs 體外抗氧化活性

2.4.1 ABTS+自由基清除實驗

由圖7a 可知，隨CTP、CTP-SeNPs 濃度的升高，其對ABTS+自由基清除能力逐漸提高，且在10 mg/mL時達到最高為76.52%，而CTP 對ABTS+自由基清除能力與CTP-SeNPs 相比較弱，最高為54.98%，表明硒納米顆粒子可以增強CTP 對ABTS+自由清除能力?？箟难幔╒c）為天然抗氧化劑、食品添加劑，常常作為抗氧化實驗中的陽性對照；如圖7a 結(jié)果所示，在同濃度下 Vc 清除 ABTS+自由基能力高于 CTP 和CTP-SeNPs。在Cai 等[29]的研究中，LRP-SeNPs（犀木多糖硒納米顆粒子）的ABTS+自由基能力最大可達80%以上；Zhai 等[30]的研究中，CS-SeNPs（殼聚糖硒納米顆粒子）的ABTS+自由基能力最大可達87.45%，均表現(xiàn)出較高的ABTS+自由基清除能力。

2.4.2 DPPH 自由基清除

由圖7b 可知，當濃度為2～10 mg/mL 時，CTP-SeNPs 清除DPPH 自由基能力隨著濃度的升高逐漸增加，且在10 mg/mL 時達到最高為66.85%，而CTP對DPPH 自由基清除能力與CTP-SeNPs 相比較弱，最高達到47.35%；如圖7b 結(jié)果所示，在同濃度下Vc 清除DPPH 自由基能力高于CTP 和CTP-SeNPs。在Cai等[29]的研究中，LRP-SeNPs（犀木多糖硒納米顆粒子）的DPPH 自由基能力最大可達50%以上；Zhai 等[30]的研究中，CS-SeNPs（殼聚糖硒納米顆粒子）的DPPH自由基能力最大可達40%以上，硒可中斷自由基鏈式反應以增強抗氧化活性，與CTP-SeNPs 的結(jié)果基本一致，表明硒納米顆粒子可以增強CTP 對DPPH 自由清除能力。

2.4.3 羥自由基清除

由圖7c 可知，各濃度CTP-SeNPs 均有清除羥自由基能力，隨著濃度的升高，其對羥自由基清除能力逐漸增加，且在10 mg/mL 時達到最高為84.92%，而CTP對羥自由基清除能力與CTP-SeNPs 相比較弱，最高可達到62.29%；如圖7c 結(jié)果所示，在同濃度下Vc 清除羥自由基能力高于CTP 和CTP-SeNPs。同樣地，Mao等[31]研究表明硒納米顆粒子可以增強灰樹花菌多糖（GP）對羥自由基清除能力。

2.4.4 總還原能力

由圖7d 可知，當濃度為6.0～10.0 mg/mL 時，CTP-SeNPs 總還原能力達到1 級以上，隨著濃度的升高，總還原能力逐漸提高，且在10 mg/mL 時達到最高接近于2 級，而CTP 總還原能力弱于CTP-SeNPs，最高僅能達到1 級；Vc 同樣表現(xiàn)出較高的抗氧化能力。Wu 等[32]的研究報告，果膠包封的SeNPs@Cur（包裹黃姜素的果膠硒納米顆粒）可使果膠的總還原能力增強，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為SeNPs 可以有效減少空間位阻，并改善姜黃素與二價鐵絡合物的反應，從而在結(jié)果中顯示出最高的還原能力，該結(jié)果與CTP-SeNPs 一致，表明硒納米顆粒子可以增強CTP 的還原性。

圖7 CTP 和CTP-SeNPs 體外抗氧化Fig.7 CTP and CTP-SeNPs antioxidant activity in vitro

2.5 藏黃連多糖和CTP-SeNPs 體外試驗

2.5.1 CTP 和CTP-SeNPs 細胞毒性

如圖8所示，CTP 在500～1 000 μg/mL、CTP-SeNPs在250～500 μg/mL 濃度范圍內(nèi)均能顯著促進RAW264.7的增殖；CTP-SeNPs 在1 000 μg/mL 濃度時，對RAW264.7 細胞的增殖作用顯著下降，但并未表現(xiàn)出抑制作用，其原因是其中的硒納米顆粒濃度也隨之增大，表現(xiàn)出對多糖的促細胞增殖活性的抑制，但并未表現(xiàn)出毒性效果。Tamiru 等[33]研究報道，納米形態(tài)的SeNPs不會影響硒的生物利用度，無機硒和SeNPs 均能升高硒誘導的谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性和GPx1 轉(zhuǎn)錄水平，但無機硒（亞硒酸鈉）的毒性可以通過其被還原為硒納米顆粒子（SeNPs）來減輕。結(jié)合本研究數(shù)據(jù)，我們推測納米態(tài)硒在一定濃度范圍內(nèi)對正常細胞具有促增殖效果，但當其濃度超過一定限度時，其可抑制與之結(jié)合的多糖的促細胞增殖活性，此時多糖與SeNPs 的已無協(xié)同作用。

圖8 CTP 和CTP-SeNPs 體外刺激RAW264.7 細胞增殖Fig.8 CTP and CTP-SeNPs stimulate RAW264.7 cell proliferation in vitro

2.5.2 CTP 和CTP-SeNPs 抗炎活性

IL-6 是一種多效性細胞因子，可影響多種免疫和生理過程，如急性期蛋白生成、炎癥、抗原特異性免疫反應[34]。在正常細胞中，IL-6 濃度非常低，在炎癥條件下，IL-6 的濃度會急劇上升，而LPS 刺激下的細胞表現(xiàn)出IL-6 分泌升高，呈現(xiàn)炎癥狀態(tài)[35]。如圖9a，與LPS 組相比，CTP 在濃度為1 000 μg/mL 時，顯著緩解RAW264.7 細胞IL-6 的釋放，表現(xiàn)出抗炎效果；而CTP-SeNPs 在250～1 000 μg/mL 范圍內(nèi)，均具有顯著緩解炎癥效果。同時，在250～1 000 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，同一濃度時CTP-SeNPs 抗炎效果顯著高于CTP，表明硒納米顆?？娠@著增強CTP 的抗炎效果。如圖9b所示，CTP 在1 000 μg/mL 濃度時、CTP-SeNPs 在250～1 000 μg/mL 范圍內(nèi)均能顯著促進LPS 刺激下的RAW264.7 細胞的增殖。由上可知，當細胞受到外源物質(zhì)如LPS 刺激后，一定濃度的CTP-SeNPs 可誘導并啟動細胞增殖和活性的恢復，從而緩解LPS 的刺激損傷，減少炎性因子IL-6 的釋放，表現(xiàn)出較好的抗炎活性。

圖9 CTP 和CTP-SeNPs 的抗炎活性Fig.9 The anti-inflammatory activities of CTP and CTP-SeNPs

3 結(jié)論

硒是人體和動物體必需的微量元素，然而其在機體中的有效劑量和中毒劑量十分接近，因此較難把握有效劑量，單質(zhì)硒以納米態(tài)存在時毒性較無機硒和天然有機硒有所降低，而生物活性較無機硒和天然有機硒有所提高。由于納米硒尺寸小，表面能大，較易聚集成大顆粒，它的促細胞增殖作用和抗炎活性隨著粒徑的增加而逐漸降低，因此需要在納米硒表面加以修飾，以阻止納米顆粒子的聚集。多糖具有高度復雜的分支結(jié)構(gòu)和活潑的羥基基團，能吸附和包裹還原反應中形成的納米硒，進而阻止納米硒顆粒的團聚，多糖亦具有良好的生物活性，是制備納米硒的良好調(diào)控劑。

本研究從藏黃連中提取藏黃連多糖，用于合成藏黃連多糖-硒納米顆粒，通過粒徑分析、紫外光譜、紅外光譜、SEM-EDS、XRD 試驗對其進行了表征，結(jié)果表明藏黃連多糖可成功合成藏黃連多糖-硒納米顆粒；通過DPPH 自由基清除、ABTS+自由基清除、羥自由基清除能力、總還原力試驗測定了CTP 與CTP-SeNPs的體外抗氧化效果，結(jié)果表明，CTP-SeNPs 的體外抗氧化效果優(yōu)于CTP，可能是硒納米顆粒增強了藏黃連多糖的抗氧化能力。體外細胞毒性試驗和抗炎試驗表明，與CTP 相比，CTP-SeNPs 在250～500 μg/mL 范圍內(nèi)有顯著的促細胞增殖作用，在250～1 000 μg/mL 范圍內(nèi)有顯著的抗炎效果，硒納米顆粒增強了藏黃連多糖的促細胞增殖和抗炎的效果，其抗炎效果的分子機制需待進一步研究。CTP-SeNPs 具有抗氧化、抗炎、低毒生物活性，可作為一種新型的富硒中藥多糖保健品。