崔航，曹冬梅,3,4*，王冀菲，婁雨豪，楊建，張東杰,4,5

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）（2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）（3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）（4.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）（5.北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級(jí)培育協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江大慶 163319）

大麥不僅營養(yǎng)成分豐富，也是制作啤酒的主要原料[1]。有研究表明，大麥營養(yǎng)含量最高的階段是成長到幼苗期的大麥。將大麥幼苗加工成麥苗粉后進(jìn)行沖服，其中含有的礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及人體所需各種微量元素較為豐富，長期飲用大麥幼苗粉（青汁）可以改善酸性體質(zhì)，提高機(jī)體抵抗力、免疫力和新陳代謝力[2]；同時(shí)具有抗菌，鎮(zhèn)痛和抗氧化的作用。大麥還具有“三高兩低”的特點(diǎn)[3]，制作成大麥苗飲后，具有良好的保健功效?，F(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)大麥苗還具有抗癌的作用。我國作為發(fā)展中大國，人類活動(dòng)向大氣釋放的有害氣體導(dǎo)致大氣沉降、工業(yè)活動(dòng)產(chǎn)生的工業(yè)廢水和日常生活中生污排放，在進(jìn)行農(nóng)業(yè)活動(dòng)中使用的一些農(nóng)用物資，諸如農(nóng)藥、化肥里含有的重金屬成分以及農(nóng)業(yè)地膜的長期不合理使用，均會(huì)導(dǎo)致土壤鉛等重金屬含量超標(biāo)[4]。

代謝組學(xué)（Metabolomics）是考察生物細(xì)胞、組織、器官或者生物體在不同狀態(tài)下代謝物種類、數(shù)量及其小分子物質(zhì)變化規(guī)律的科學(xué)[5]。植物代謝組學(xué)指當(dāng)植物受到外界干擾或刺激后，通過代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)其產(chǎn)生的代謝物進(jìn)行非靶定性或靶向定性定量分析，以此探究植物代謝網(wǎng)絡(luò)以及相關(guān)基因功能的科學(xué)技術(shù)[6]。目前，廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)分析的技術(shù)有1H,13C-NMR 技術(shù)、GC-MS 技術(shù)、LC-MS 技術(shù)、CE-MS 技術(shù)以及DIMS技術(shù)等，其中由于LC-MS 具有較高的靈敏度和分辨率，較寬的動(dòng)態(tài)范圍，適合通過非靶向技術(shù)手段對(duì)標(biāo)本中未知代謝物進(jìn)行探索研究，被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中[7,8]。近年來代謝組學(xué)在植物研究中也獲得了極大地進(jìn)展，在農(nóng)作物營養(yǎng)成分及質(zhì)量評(píng)價(jià)等幾個(gè)方面的均有著極大的研究進(jìn)展[9]。本研究預(yù)通過分析Pb 脅迫下大麥苗粉中代謝物的變化，并找出其中的標(biāo)志性代謝物，從而推導(dǎo)Pb 脅迫的代謝機(jī)理，并從食品安全的角度出發(fā)，對(duì)大麥產(chǎn)地的Pb 污染防治有重要指導(dǎo)性意義。本研究將對(duì)大麥?zhǔn)称钒踩按篼溵r(nóng)業(yè)產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

色譜級(jí)甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水，CNM Technologies 試劑有限公司；硝酸鉛，鄭州中天泓達(dá)化工科技有限公司；超純水；Vanquish 超高效液相、Q Exactive HFX 高分辨率質(zhì)譜、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）液相色譜柱、Heraeus Frescol17 離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific 公司；FOSS-KN295 組織研磨儀，丹麥福斯儀器公司。

1.2 LC-MS 檢測

本實(shí)驗(yàn)使用Vanquish（Thermo Fisher Scientific）超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A 相為水相，含5 mmol/L 乙酸銨和5 mmol/L 乙酸，B 相為乙腈。樣品盤溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：3 μL。

Thermo Q Exactive HFX 質(zhì)譜儀能夠在控制軟件（Xcalibur，版本：4.0.27，Thermo）控制下進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)如下：鞘氣流速：30 Arb，輔助氣流速：10 Arb，毛細(xì)管溫度：350 ℃，F(xiàn)ull MS分辨率：60 000，MS/MS 分辨率：7 500，碰撞能量：10/30/60（在NCE 模式下），噴涂電壓：4.0 kV（正）或-3.8 kV（負(fù)）。

1.3 大麥標(biāo)準(zhǔn)萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

選取一定量籽粒飽滿的優(yōu)質(zhì)CK15 大麥，購自黑龍江省佳木斯農(nóng)科院；使用去離子水將種子漂洗4～6 次，再經(jīng)體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫溶液消毒10 min 后用去離子水反復(fù)沖洗4～6 遍，充分晾干后備用。使用從前期萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中確定的Pb 濃度（1 600 mg/kg，以土壤質(zhì)量計(jì)）進(jìn)行土壤拌種，將硝酸鉛與土壤混合均勻后開始種植大麥。先取出適量均勻拌鉛的土壤，根據(jù)盆內(nèi)土量用適量去離子水將土充分濕潤，再把種子撒在濕潤土壤表面，種子之間保留1～3 cm 間隙，最后將事先取出的土壤均勻覆蓋在種子表面，完成種植。每4 盆為1個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次，盆栽置于室溫中明暗交替培養(yǎng)至10～15 d，大麥幼苗高度生長至10～20 cm 時(shí)取樣備用。同時(shí)做無鉛脅迫對(duì)照組。

1.4 大麥苗粉制備

將取樣后的大麥幼苗使用去離子水清洗干凈，放在室溫中通風(fēng)干燥24 h 后放入超低溫冰箱中冷凍12 h，用凍干機(jī)冷凍干燥48 h，經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后備用。

1.5 樣品處理

取樣后將樣品使用去離子水反復(fù)沖洗至無土壤殘留，經(jīng)液氮研磨后稱取20 mg 樣品，加入1 000 μL 提取液[甲醇:水=3:1（V/V）]；于50 Hz 聲波下研磨5 min，冰浴超聲6～7 min（以上操作步驟重復(fù)進(jìn)行三次）；于-40℃下靜置1 h；將樣品4 ℃，12 000 r/min 離心15 min；使用移液槍吸取靜置后上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測，剩余樣品分別吸取等量上清液混合成質(zhì)控樣品（QC）上機(jī)檢測。LC-MS 上機(jī)A 相為水相，B 相為乙腈（純度99.99%）。進(jìn)樣溫度4 ℃，樣品體積3 μL。在Thermo Q Exactive HFX 質(zhì)譜儀控制下進(jìn)行多級(jí)數(shù)據(jù)采集。

1.6 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)使用R 軟件包進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊等處理[10]，先通過PCA 對(duì)所有樣本點(diǎn)數(shù)據(jù)分布情況進(jìn)行概況預(yù)覽，然后采用OPLS-DA 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模分析，根據(jù)t檢驗(yàn)的p值＜0.05，同時(shí)VIP 值＞1，進(jìn)行差異性代謝物的篩選。篩選出的代謝物通過Biotree DB（V2.1）自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和HMDB 人類代謝組數(shù)據(jù)庫聯(lián)合篩選匹配后定性，Cutoff 值設(shè)為0.3；再將篩選出的差異代謝物進(jìn)行KEGG 注釋和通路分析，通過富集分析和拓?fù)浞治鰴z索出差異代謝物映射的關(guān)鍵代謝通路[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物定性結(jié)果

由表1可知，成苗期大麥共定性出脂質(zhì)和類脂質(zhì)代謝物、多酚類代謝物、多胺類代謝物、有機(jī)雜環(huán)代謝物、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)氧代謝物、苯丙烷和聚酮化合物、苯甲酸酯類代謝物、核苷及核苷酸類似物及少量有機(jī)氮代謝物、生物堿及其衍生物等共84 個(gè)代謝物；其中脂質(zhì)和類脂質(zhì)、多酚類、多胺類、有機(jī)酸及其衍生物的含量發(fā)生了明顯的變化。由于大麥在生長的過程中由于不斷地長出新的葉片，所需能量增加、酶活增強(qiáng)[12,13]，從而導(dǎo)致脂類物質(zhì)，有機(jī)酸、蛋白質(zhì)的含量發(fā)生變化[14,15]。有研究表明，多酚類代謝物、有機(jī)酸等是植物生長過程中主要發(fā)生變化的物質(zhì)[14]，而多酚類代謝物的變化會(huì)導(dǎo)致大麥幼苗抗氧化能力也發(fā)生改變，機(jī)體食用后會(huì)影響其自由基清除能力；大麥中存在的多胺類代謝物是農(nóng)作物中普遍存在的，多胺類代謝物作為植物細(xì)胞分裂和生長發(fā)育必需的物質(zhì)[16]，在大麥?zhǔn)艿椒巧锩{迫時(shí)能發(fā)揮重要作用[17]。

表1 代謝物定性結(jié)果Table 1 Qualitative results of metabolites

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 主成分分析（PCA）

圖1為CMQ-CMQPb 組主成分分析得分圖，擬合后方程R2X=0.662＞0.5，說明此方程擬合后穩(wěn)定性較好。由圖可知，樣本點(diǎn)均處于95%置信區(qū)間內(nèi)，經(jīng)Pb脅迫后與對(duì)照組相比，兩組樣本組間區(qū)分效果十分顯著，無任何重疊現(xiàn)象。同組樣本內(nèi)存在部分重疊的現(xiàn)象，推斷是由于品種相同的大麥內(nèi)部代謝物具有相似性造成的[18]。

圖1 CMQ-CMQPb 組PCA 得分圖Fig.1 PCA score chart of CMQ-CMQPb group

2.3 正交偏最小二乘-判別檢驗(yàn)（OPLS-DA）

PCA（主成分分析），多用于考察樣本之間相關(guān)性，而對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步精準(zhǔn)分析還需要應(yīng)用OPLS-DA（正交偏最小二乘法），這種數(shù)據(jù)分析方法可以通過正交化篩選數(shù)據(jù)信息中與類別信息無關(guān)的數(shù)據(jù)，排除與分類無關(guān)的自變量，從而更加精準(zhǔn)的篩選出各類樣本的特征變量[19]。VIP 值也叫變量投影重要度，是變量信息篩選過程中的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，能較好反映出OPLS-DA 模型對(duì)各個(gè)化合物的評(píng)分。一般認(rèn)為，當(dāng)VIP＞1 時(shí)，則表明該變量對(duì)于模型中類別的分類有著較為重要的意義[20]。

由圖2可知，通過本次OPLS-DA 判別分析共得到兩個(gè)主成分，R2X=0.526，R2Y=1，Q2=0.982；R2Y、Q2兩者均大于0.5 說明模型可靠性較好。由圖2可知，兩組樣本分列于置信區(qū)間的兩側(cè)且樣本間區(qū)分明顯，兩組樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)，稍有部分重疊；從分布形態(tài)上看，CMQ 組樣本點(diǎn)離散程度要大于CMQPb 組樣本點(diǎn)。兩組樣本點(diǎn)區(qū)分顯著，但也各自存在組內(nèi)聚集區(qū)，因使用同一品種大麥，所以內(nèi)部成分相差不大；組間不存在聚集區(qū)，可以看出Pb 脅迫對(duì)大麥內(nèi)部成分影響較大。

圖2 CMQ-CMQPb 組OPLS-DA 判別得分圖Fig.2 OPLS-DA discriminant score chart of CMQ-CMQPb group

2.4 正交偏最小二乘-判別置換檢驗(yàn)

置換檢驗(yàn)通過隨機(jī)改變分類變量Y 的排列順序，多次（次數(shù)n=200）建立對(duì)應(yīng)的OPLS-DA 模型以獲取隨機(jī)模型的R2和Q2值[21]。

圖3為CMQ 對(duì)CMQPb 組OPLS-DA 置換檢驗(yàn)，原模型R2Y=1，Q2=0.982 大于0.5 且接近于1，證明原模型可以較好解釋兩組樣本之間的差異[22]。置換檢驗(yàn)隨機(jī)模型的Q2值均小于原模型的Q2值；同時(shí)隨著置換Y 變量比例增大，隨機(jī)模型的Q2逐漸下降。同時(shí)采用200 次響應(yīng)的置換檢驗(yàn)，建立對(duì)應(yīng)的OPLS-DA 模型以隨機(jī)獲取模型的R2和Q2值，從而有效避免檢驗(yàn)?zāi)Ｐ痛嬖谶^擬合現(xiàn)象。說明原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過擬合現(xiàn)象[23]。

圖3 CMQ-CMQPb 組OPLS-DA 置換檢驗(yàn)Fig.3 OPLS-DA permutation test in CMQ-CMQPb group

2.5 差異代謝物篩選

將差異代謝物以火山圖的形式進(jìn)行可視化處理，篩選標(biāo)準(zhǔn)為正交偏最小二乘（OPLS-DA）模型VIP＞1且t檢驗(yàn)的p值＜0.05，結(jié)合保留時(shí)間等條件在Biotree DB（V2.1）自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行差異代謝物匹配，兩組樣本間差異代謝物定性結(jié)果如表2所示。

圖4為差異代謝物篩選火山圖，紅色為含量上調(diào)的代謝物，藍(lán)色為含量下調(diào)的代謝物，灰色為變化不顯著差異代謝物。根據(jù)匹配度和VIP（p-value）值共篩選出高度匹配差異代謝物60 個(gè)，如表2。

表2 差異代謝物定性結(jié)果Table 2 Differential metabolite qualitative results

續(xù)表2

圖4 CMQ-CMQPb 組差異代謝物篩選火山圖Fig.4 CMQ-CMQPb group differential metabolite screening volcano map

CMQ-CMQPb 組共篩選出了60 個(gè)差異代謝物，多數(shù)為有機(jī)酸及其衍生物、多酚類代謝物、多胺類代謝物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子以及少量的氧化物、有機(jī)化合物、生物堿和核苷酸等；其中CMQ 組對(duì)比CMQPb 組中相對(duì)含量上升的代謝物11 個(gè)，多數(shù)為多酚類物質(zhì)和多胺類物質(zhì)；CMQ 組對(duì)比CMQPb 組中相對(duì)含量下調(diào)的代謝物49 個(gè)，多數(shù)為有機(jī)酸及其衍生物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子、有機(jī)氧化合物等。

多酚類物質(zhì)是大麥中一種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，存在其各個(gè)部位中，隨著大麥的生長，多酚類物質(zhì)會(huì)發(fā)生一定的動(dòng)態(tài)變化；已有研究表明，大麥幼苗中多酚類的變化，食用后可直接影響其對(duì)機(jī)體的抗氧化能力。多胺類物質(zhì)的上升或下降，已通過轉(zhuǎn)基因研究證明，其含量的動(dòng)態(tài)變化可能作為植物提高耐脅迫能力的一種策略[24]，可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的HMs 進(jìn)行螯合或者間接的刺激增強(qiáng)植物抗氧化系統(tǒng)的防御能力、誘導(dǎo)脅迫相關(guān)基因的特異性表達(dá)、影響植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和離子的吸收和平衡[25]。同時(shí)外源施用腐胺和亞精胺類物質(zhì)也可以顯著誘導(dǎo)植物遭受脅迫后響應(yīng)基因的表達(dá)。當(dāng)Pb 不斷對(duì)植物造成脅迫時(shí)，植物根系就會(huì)分泌有機(jī)酸來與重金屬螯合，形成并分泌一種新的螯合物來保護(hù)植物根系，從而對(duì)抗重金屬的脅迫，從而導(dǎo)致有機(jī)酸含量發(fā)生動(dòng)態(tài)變化；脂類物質(zhì)含量變化的原因可能是由于大麥?zhǔn)艿絇b 脅迫后在成苗期需要能量增加，呼吸作用增強(qiáng)，故會(huì)分解消耗更多的脂類物質(zhì)來為大麥的生長提供能量。

2.6 差異代謝物層次聚類分析

上述分析得到的差異代謝物，由于不同的代謝物可能會(huì)具有相似的生物特性或者受到同一個(gè)代謝通路的調(diào)控，最終導(dǎo)致差異代謝物之間特征區(qū)分不明顯。層次聚類是將未明顯區(qū)分的差異代謝物進(jìn)行聚類，將具有相似生物特性的代謝物歸到一類，以此來分析同類差異代謝物在樣本間的明顯變化特征。對(duì)差異代謝物的定量值進(jìn)行計(jì)算歐式距離矩陣（Euclidean Distance Matrix），以完全連鎖方法對(duì)差異代謝物進(jìn)行聚類，并以熱力圖進(jìn)行展示[26]。結(jié)果如圖5所示。

圖5 CMQ-CMQPb 組差異代謝物層次聚類熱力圖Fig.5 CMQ-CMQPb group differential metabolite hierarchical clustering heat map

圖5為CMQ-CMQPb 組層次聚類熱力圖，熱力圖的顏色代表代謝物的豐值高低，紅色為高表達(dá)區(qū)，藍(lán)色為底表達(dá)區(qū)。紅藍(lán)區(qū)分度明顯，說明聚類效果顯著。圖左側(cè)CMQ 組前49 個(gè)差異代謝物的表達(dá)量明顯低于CMQPb 組，多數(shù)為有機(jī)酸及其衍生物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)代謝物、有機(jī)氧等代謝物；其中含有3 個(gè)數(shù)據(jù)庫中檢索不到的未知物，根據(jù)其核質(zhì)比暫命名為未知物377、未知物446、未知物795；暫對(duì)以上未知物進(jìn)行定性推斷，由于其在通路中的表達(dá)量于其余已知代謝物具有相似的高表達(dá)，故推斷該未知物的結(jié)構(gòu)也屬于有機(jī)酸類代謝物、脂質(zhì)類等代謝物。

從熱圖中可以看出經(jīng)Pb 脅迫后的大麥幼苗（CMQPb 組）中高表達(dá)代謝物明顯高于未經(jīng)Pb 脅迫的大麥幼苗（CMQ 組），證明Pb 脅迫可以增加大麥幼苗中差異代謝物的活躍度。圖右側(cè)下半部CMQ 組后11 個(gè)差異代謝物的表達(dá)量明顯高于CMQPb 組，多數(shù)為多酚類化合物、多胺類化合物等物質(zhì)；其中含有1個(gè)數(shù)據(jù)庫中檢索不到的未知物，根據(jù)其核質(zhì)比暫命名為未知物543，由于其在代謝通路中表達(dá)量和其余已知代謝物具有一定的高表達(dá)相似性，故推斷該未知物的結(jié)構(gòu)也屬于多酚類、多胺類等代謝物。研究發(fā)現(xiàn)，大麥生長過程中根系分泌的有機(jī)酸能有效降低土壤對(duì)Pb的吸附并加強(qiáng)于土壤Pb 的螯合，這一結(jié)論與徐衛(wèi)紅等[27]的研究結(jié)果相符；通過有機(jī)酸與Pb 螯合以此對(duì)抗Pb 脅迫從而減輕外界非生物脅迫對(duì)大麥的毒害，并促使Pb 從根部向地上部轉(zhuǎn)移。而多酚類物質(zhì)主要在于調(diào)控大麥幼苗的新陳代謝，促進(jìn)其生長發(fā)育，經(jīng)Pb 脅迫后，大麥幼苗生長受到抑制，新陳代謝減慢，從而刺激多酚類物質(zhì)的合成來維持大麥幼苗的正常生理活動(dòng)。通過層次聚類熱力圖分析可以看出，Pb 脅迫會(huì)對(duì)大麥幼苗內(nèi)部的不同種類代謝物具有一定的影響，而兩組間篩選出的差異代謝物是大麥苗內(nèi)部眾多代謝物中因遭受非生物脅迫而導(dǎo)致含量變化顯著的物質(zhì)，對(duì)于探究大麥幼苗在Pb 脅迫下的代謝物動(dòng)態(tài)變化和代謝途徑鑒別具有一定的參考意義，并從食品安全角度找出大麥種植區(qū)Pb 污染防治辦法。

2.7 關(guān)鍵代謝通路分析

KEGG 注釋分析僅能匹配到差異代謝物參與的通路，并不能篩選出與本實(shí)驗(yàn)高度相關(guān)的關(guān)鍵代謝通路[28]。因此，想要篩選出高度匹配的關(guān)鍵代謝通路，還需利用Pathway 數(shù)據(jù)庫對(duì)上述篩選出的差異代謝物其進(jìn)行富集分析和拓?fù)浞治鯷29]，再通過KEGG、PubChem 等權(quán)威代謝物數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物進(jìn)行映射。本實(shí)驗(yàn)共映射出7 個(gè)高度匹配的差異代謝物，分別為：β-丙氨酸、二氫尿嘧啶、泛酸、尿嘧啶、酪氨酸、山奈酚、L-苯丙氨酸，且均為精確匹配。最后根據(jù)-log(p)值和Impact 值綜合分析，篩選出最為顯著的5 條代謝通路[30]，如表3所示。

表3 關(guān)鍵代謝通路分析表Table 3 Analysis of key metabolic pathways

對(duì)差異代謝物參與的代謝通路進(jìn)行分析，分別為β-丙氨酸代謝、泛酸和CoA 生物合成、異喹啉生物堿的生物合成、黃酮和黃酮生物合成、苯丙氨酸代謝。說明Pb 脅迫大麥幼苗后，其內(nèi)部代謝通路多數(shù)與氨基酸代謝有關(guān)，氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，也是人體重要營養(yǎng)素之一，在大麥幼苗受到Pb 脅迫后，氨基酸代謝可以參與調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、氣孔關(guān)閉、氮代謝等解毒過程[31]。這5 條代謝通路共映射7 個(gè)代謝物，其中β-丙氨酸、二氫尿嘧啶、泛酸和尿嘧啶都分別參與了兩條代謝通路，說明這4 個(gè)差異代謝物對(duì)關(guān)鍵代謝通路的影響較大。從關(guān)鍵代謝通路映射出的差異代謝物可以看出，氨基酸類代謝物的變化可作為研究Pb 脅迫后大麥幼苗內(nèi)部響應(yīng)的重要信號(hào)，則說明大麥幼苗在受到Pb脅迫后會(huì)對(duì)其中的氨基酸代謝產(chǎn)生一定影響。

圖6中圓形氣泡代表不同的代謝通路，氣泡大小表示該條通路影響因子的大??；氣泡所在縱坐標(biāo)和氣泡顏色表示富集分析的p值[取負(fù)自然對(duì)數(shù)，即-ln(p)]，氣泡顏色由藍(lán)到紅，顏色越深富集程度越顯著。

圖6 CMQ-CMQPb 組代謝通路分析氣泡圖Fig.6 CMQ-CMQPb group Metabolic pathway analysis bubble chart

由圖6可知，β-丙氨酸代謝處的氣泡顏色為深紅色、氣泡相對(duì)較大。丙氨酸代謝的應(yīng)激反應(yīng)主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境pH 的調(diào)節(jié)，植物在生長過程中遭受到重金屬脅迫后，蛋白質(zhì)合成速率降低和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)減緩引起的。說明Pb 脅迫對(duì)大麥幼苗中的丙氨酸代謝影響較大。泛酸和CoA 生物合成的顏色較淺，氣泡稍小、說明此途徑對(duì)Pb 在大麥幼苗中的代謝影響也較大。CoA 在大麥萌發(fā)過程中提供90%的能量。主要參與糖基代謝、蛋白質(zhì)代謝以及能量代謝，這與楊延輝等[32]的研究結(jié)果相符。其次是異喹啉生物堿的生物合成，異喹啉類生物堿具有多種生物活性，存在于動(dòng)植物細(xì)胞中可以抵抗生物或非生物脅迫；異喹啉類生物堿的生物合成途徑是從2 種酪氨酸衍生物的縮合開始[33]，緊接著是一系列的反應(yīng)形成反式心果堿[34]（是大部分喹啉生物堿的中間或前體物質(zhì)），生物堿和其它次生代謝物是通過ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來轉(zhuǎn)運(yùn)和聚集的[35]，其在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上體現(xiàn)了重要的運(yùn)輸功能。最后是黃酮和黃酮生物合成和苯丙氨酸代謝；黃酮化合物是植物的次生代謝物，它能使植物適應(yīng)環(huán)境壓力，包括生物壓力和非生物壓力[36]，其在植物的根、莖、葉中都有分布。植物所處溫度、光照、水分和外源脅迫都可以調(diào)控植物中的黃酮生物合成。而苯丙氨酸解氨酶是本代謝途徑中重要的酶基因啟動(dòng)因子，其只存在于植物和微生物中，能夠應(yīng)答生物和非生物脅迫。由此可見，苯丙氨酸代謝途徑可以增強(qiáng)大麥遭受Pb 脅迫時(shí)的耐受力。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用大麥為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行模擬大麥種植區(qū)鉛污染盆栽實(shí)驗(yàn)，經(jīng)Pb 脅迫生長到成苗期（三葉幼苗）后將其制成大麥苗粉，應(yīng)用LC-MS 代謝組學(xué)技術(shù)來探究大麥幼苗遭受Pb 脅迫后的代謝機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大麥幼苗（CMQ）和Pb 脅迫大麥幼苗（CMQPb）樣本進(jìn)行檢測，通過主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，共篩選出60 個(gè)差異代謝物，主要為有機(jī)酸及其衍生物、多酚類和多胺類代謝物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子和少量的氧化物、有機(jī)化合物、生物堿和核苷酸等；層次聚類熱力圖結(jié)果表明，CMQPb 組有49 個(gè)差異代謝物表達(dá)量明顯高于CMQ 組，多數(shù)為有機(jī)酸及其衍生物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子；CMQPb 組有11 個(gè)差異代謝物表達(dá)量明顯低于CMQ 組，多數(shù)為多酚類物質(zhì)和多胺類物質(zhì)。證明Pb 脅迫會(huì)導(dǎo)致大麥幼苗中多酚類物質(zhì)、多胺類物質(zhì)、有機(jī)酸及其衍生物和脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子的含量發(fā)生顯著變化。通過KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，Pb 脅迫會(huì)對(duì)大麥幼苗中氨基酸代謝有顯著影響，β-丙氨酸、二氫尿嘧啶、泛酸和尿嘧啶是影響代謝通路的關(guān)鍵差異代謝物。本研究使用LC-MS 代謝組學(xué)技術(shù)探究Pb 脅迫對(duì)大麥苗粉代謝產(chǎn)物的影響切實(shí)可行，從食品安全的角度對(duì)大麥種植和Pb 污染防治具有一定指導(dǎo)性意義。