何瓔 ，凌勇根 ，趙洪慶 ，吳夢(mèng)瑤 ，白璐 ，陳倩 ，周昊涵 ，王宇紅 （.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙 4008；.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 4000）

功能失調(diào)性子宮出血（dysfunctional uterine bleeding，DUB）是一種常見(jiàn)的婦科疾病，癥狀表現(xiàn)為周期不規(guī)律的月經(jīng)出血[1]，患者身心健康和生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[2]。臨床上，DUB患者的主要治療手段為手術(shù)治療和藥物治療，但手術(shù)治療會(huì)對(duì)患者的生殖能力造成一定影響[3―4]，化學(xué)藥治療也有可能會(huì)出現(xiàn)頭痛、貧血和嘔吐等不良反應(yīng)[5]。目前，使用中藥和傳統(tǒng)藥物也是治療DUB的方法之一，這些藥物毒副作用小，安全性普遍高于化學(xué)藥[1]。

婦科斷紅飲膠囊由赤芍、益母草、三七、仙鶴草、地榆炭、蒲黃炭6味中藥材組成，該方在涼血止血、化瘀調(diào)經(jīng)方面均有較好作用。方中赤芍清熱涼血，活血祛瘀；益母草“行血養(yǎng)血，行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘋血，誠(chéng)為血家之圣藥也”，其功在活血調(diào)經(jīng)；三七為“止血之神藥”；仙鶴草能收斂止血；地榆炭、蒲黃炭涼血止血[6]。該產(chǎn)品在臨床上用于治療血熱內(nèi)擾證DUB安全有效[6]，但關(guān)于其作用機(jī)制的科學(xué)研究報(bào)道仍較為匱乏。表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）在子宮內(nèi)膜修復(fù)、誘導(dǎo)血管生成和止血中發(fā)揮著重要作用，其通過(guò)與細(xì)胞膜上的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合而發(fā)揮作用[7]。本研究擬通過(guò)建立大鼠DUB模型，探討婦科斷紅飲膠囊通過(guò)EGF-EGFR信號(hào)通路治療DUB的作用機(jī)制，為進(jìn)一步明確其作用機(jī)制、推廣其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：K960型梯度PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司），BioDrop μlite+/BioDrop DUO+型超微量核酸蛋白濃度檢測(cè)儀（英國(guó)BioDrop公司），T10BS25型全自動(dòng)勻漿儀（德國(guó)IKA公司），ECO型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Illumina公司），Universal Hood 11型Chemi Doc XRS+Imager化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），Axioimage A2型正置顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司），TGL-16G型普通臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），ZL9100C型全自動(dòng)凝血分析儀（北京眾馳偉業(yè)科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

婦科斷紅飲膠囊（批號(hào)20200401，規(guī)格0.4 g）由株洲千金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；醋酸氫化可的松片（批號(hào)019200302，規(guī)格200 mg）購(gòu)自上海上藥信誼藥廠(chǎng)有限公司；羥基脲片（批號(hào)112038LC，規(guī)格0.5 g）購(gòu)自齊魯制藥有限公司；米非司酮片（批號(hào)140801，規(guī)格25 mg）、米索前列醇片（批號(hào)142816，規(guī)格50 mg）均購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司；超純總RNA提取試劑盒（批號(hào)20211153）購(gòu)自杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)05250410）、RT-qPCR試劑盒（批號(hào)05238502）、鼠源 β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗（批號(hào)YM3028）購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司；兔源EGF一抗（批號(hào)PAB31668）、兔源EGFR一抗（批號(hào)PAB30732）均購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（批號(hào)S00020）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)BS13278）購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司；PCR實(shí)驗(yàn)中EGF、EGFR、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、甘油醛-3磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，雌性30只（體質(zhì)量250～300 g），雄性15只（體質(zhì)量350～400 g），均購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004，質(zhì)量合格證號(hào)為430727211100716136。購(gòu)入后，將大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)為SYXK（湘）2019-0009。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，倫理審查號(hào)為L(zhǎng)LBH-202104080001。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥

將SD大鼠按照雄雌數(shù)量1∶2的比例合籠4 d，檢查雌性大鼠陰栓與陰道涂片，有精子時(shí)記為大鼠妊娠第1天[8]。選取妊娠大鼠18只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和婦科斷紅飲膠囊組，每組6只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠從妊娠第1天起，每天8：00灌胃羥基脲片（450 mg/kg），并皮下注射氫化可的松（3.7 mg/kg），持續(xù)7 d；妊娠第8天，每天8：00和18：00分別灌胃米非司酮片（8.5 mg/kg）和米索前列醇片（0.1 mg/kg），次日用棉簽檢測(cè)陰道出血情況，棉簽上有血跡說(shuō)明DUB造模成功[9]。造模成功后第1天，婦科斷紅飲膠囊組大鼠灌胃婦科斷紅飲膠囊1.296 g/kg（臨床等效劑量的4倍劑量），空白對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠灌胃蒸餾水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)14 d。

2.2 一般狀態(tài)和臟器指數(shù)檢測(cè)

造模及給藥期間觀(guān)察各組大鼠行為狀態(tài)、毛發(fā)、二便、飲水飲食、出血等情況，稱(chēng)定大鼠體質(zhì)量。末次灌胃1 h后，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，置于含肝素鈉的血液采集管中，然后分離子宮和卵巢組織，稱(chēng)質(zhì)量。將部分組織置于多聚甲醛中保存用于病理分析，另一部分組織置于液氮中保存?zhèn)溆?。?jì)算大鼠卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)：卵巢指數(shù)（mg/g）＝卵巢質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），子宮指數(shù)（mg/g）＝子宮質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

2.3 血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下血液，使用全自動(dòng)凝血分析儀檢測(cè)全血高切相對(duì)指數(shù)、全血低切相對(duì)指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度等血液流變學(xué)指標(biāo)。

2.4 大鼠子宮和卵巢組織病理檢測(cè)

取充分固定的大鼠子宮和卵巢組織，石蠟包埋，以5 μm厚度連續(xù)切片，梯度乙醇脫水、浸蠟、水化、沖洗，采用蘇木精-伊紅（HE）進(jìn)行染色，完成后將切片固定于載玻片上，中性樹(shù)脂封片，采用顯微鏡進(jìn)行圖像采集，觀(guān)察各組大鼠子宮內(nèi)膜及卵巢組織病理形態(tài)并拍照分析。

2.5 大鼠子宮組織中EGF-EGFR信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用RT-qPCR法進(jìn)行檢測(cè)。稱(chēng)取1 g凍存的子宮組織，加入RNA提取液，冰上勻漿，提取組織中總RNA，檢測(cè)其純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法分析EGF、HIF-1α、EGFR、AKT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

2.6 大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取凍存的子宮組織適量，提取組織中總蛋白，采用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白含量。將蛋白高溫變性后上樣12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓75 V，時(shí)間130 min），然后將蛋白轉(zhuǎn)移（恒流300 mA）至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，加入相應(yīng)一抗[β-actin（稀釋度為1∶5 000）、EGF（稀釋度為1∶1 000）、EGFR（稀釋度為1∶2 000）]，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用TBST液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗（稀釋度為1∶5 000），室溫孵育4 h；TBST液洗4次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光法顯影。應(yīng)用Image J 1.51軟件分析條帶灰度值，根據(jù)目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)使用LSD-t法進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊時(shí)使用Tamhane’s T2法進(jìn)行組間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 婦科斷紅飲膠囊對(duì)模型大鼠一般狀態(tài)和臟器指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠的飲食情況均較好?？瞻讓?duì)照組大鼠行為活動(dòng)正常，墊料較干凈，陰道口無(wú)血跡；模型對(duì)照組大鼠狀態(tài)萎靡，陰道口有血跡，部分大鼠墊料上也有明顯血跡；婦科斷紅飲膠囊組大鼠行為活動(dòng)較正常，出血量少，墊料上血跡少。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，mg/g）

表2 各組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，mg/g）

a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；c：與模型對(duì)照組比較，P＜0.01

卵巢指數(shù)0.63±0.04 0.91±0.20a 0.70±0.07b組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組婦科斷紅飲膠囊組子宮指數(shù)1.78±0.24 2.24±0.15a 1.57±0.20c

3.2 婦科斷紅飲膠囊對(duì)模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠全血高切相對(duì)指數(shù)、全血低切相對(duì)指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠全血高切相對(duì)指數(shù)顯著升高（P＜0.05），紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；c：與模型對(duì)照組比較，P＜0.05

卡松黏度4.59±0.65 4.76±0.34 3.96±0.88組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組婦科斷紅飲膠囊組全血高切相對(duì)指數(shù)6.94±1.39 5.42±0.61a 6.64±1.01c全血低切相對(duì)指數(shù)88.77±32.41 66.91±3.93a 80.80±5.97紅細(xì)胞聚集指數(shù)9.42±2.02 13.90±0.89b 11.50±1.32c

3.3 婦科斷紅飲膠囊對(duì)模型大鼠子宮和卵巢組織病理形態(tài)的影響

3.3.1 子宮HE染色結(jié)果 空白對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜上皮完整，間質(zhì)內(nèi)各結(jié)構(gòu)清楚、形態(tài)正常；模型對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜上皮完整，間質(zhì)內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮內(nèi)膜上皮完整，間質(zhì)內(nèi)有少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)觀(guān)察結(jié)果（HE染色，×100）

3.3.2 卵巢HE染色結(jié)果 空白對(duì)照組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)清楚、形態(tài)正常，實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)各卵泡及黃體發(fā)育正常；模型對(duì)照組大鼠卵巢組織實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)各卵泡及黃體發(fā)育正常，靜脈增多并大量淤血，卵巢門(mén)部可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；婦科斷紅飲膠囊組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)清楚、形態(tài)正常，實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)各卵泡及黃體發(fā)育正常，僅有少量靜脈擴(kuò)張及淤血。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)觀(guān)察結(jié)果（HE染色，×100）

3.4 婦科斷紅飲膠囊對(duì)模型大鼠EGF-EGFR信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠子宮組織中EGF、HIF-1α、AKT1、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮組織中EGF、HIF-1α、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01）；AKT1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平有所上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠子宮組織EGF-EGFR通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表4 各組大鼠子宮組織EGF-EGFR通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型對(duì)照組比較，P＜0.05；c：與模型對(duì)照組比較，P＜0.01

EGFR mRNA 1.14±0.54 0.70±0.15a 1.20±0.08c組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組婦科斷紅飲膠囊組EGF mRNA 1.01±0.71 0.71±0.06a 1.08±0.31b HIF-1α mRNA 1.30±0.46 0.49±0.25a 4.24±0.87c AKT1 mRNA 1.03±0.29 0.74±0.08a 0.83±0.11

3.5 婦科斷紅飲膠囊對(duì)模型大鼠EGF、EGFR蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖3、表5。

圖3 各組大鼠子宮組織中 EGF、EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)檢測(cè)的電泳圖

表5 各組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表5 各組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與模型對(duì)照組比較，P＜0.01

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組婦科斷紅飲膠囊組EGF/β-actin 0.45±0.01 0.30±0.08a 0.63±0.11b EGFR/β-actin 0.66±0.19 0.23±0.14a 0.53±0.03b

4 討論

大量研究表明，子宮和卵巢功能紊亂與DUB密切相關(guān)[10]。有研究證明，更年期女性卵巢功能不穩(wěn)定，因此在更年期DUB的發(fā)病率更高，而通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜萎縮變薄，可減少子宮出血，改善更年期女性的DUB[11]。有研究指出，EGF-EGFR信號(hào)通路及其相關(guān)靶點(diǎn)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、AKT、HIF-1α與DUB的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[12]。EGF與子宮內(nèi)膜的微環(huán)境之間有著密切聯(lián)系，對(duì)子宮內(nèi)膜血管的再生有促進(jìn)作用，同時(shí)其可促進(jìn)子宮創(chuàng)面修復(fù)，起到止血的作用[13]。HIF-1α是EGF的上游靶點(diǎn)，HIF-1α和EGF的表達(dá)水平呈正相關(guān)[14]。EGF對(duì)EGFR的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用，EGF與EGFR結(jié)合后，可以有效地抑制卵巢組織中卵泡細(xì)胞凋亡，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[15]。EGFR可激活PI3K，進(jìn)一步促進(jìn)AKT磷酸化，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖及抑制子宮出血[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，婦科斷紅飲膠囊可以調(diào)控DUB模型大鼠異常的血液流變學(xué)指標(biāo)，改善其子宮和卵巢腫大，降低其子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)，減輕其子宮中大量淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及卵巢靜脈增多等病理變化。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠子宮組織中EGF、EGFR、HIF-1α、AKT1 mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著下調(diào)，婦科斷紅飲膠囊組大鼠EGF、EGFR、HIF-1α、AKT1 mRNA的表達(dá)較模型對(duì)照組均不同程度上調(diào)。根據(jù)Western blot檢測(cè)結(jié)果可知，模型對(duì)照組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組顯著下調(diào)，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白表達(dá)較模型對(duì)照組顯著上調(diào)。研究結(jié)果提示，婦科斷紅飲膠囊給藥后激活了EGF-EGFR信號(hào)通路。

綜上所述，婦科斷紅飲膠囊對(duì)DUB模型大鼠具有一定的改善作用，其機(jī)制可能與激活EGF-EGFR信號(hào)通路有關(guān)，但其更多的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。