郭忠會 ，鄭雪瑩 ，梁潔 ，譚勇 ，覃春萍 ，郭家成 ，李耀華 ，韋志英 ，陳奎奎 （.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧 53000；.廣西中醫(yī)藥大學教學實驗實訓中心，南寧 53000）

雞骨草系豆科植物廣州相思子Abrus cantoniensis Hance的干燥全株，壯藥名“棵骼給”，為廣西“桂十味”道地藥材之一。其性涼，味甘，具有利濕退黃、清熱解毒、疏肝止痛的功效[1]，臨床常用于治療慢性乙型肝炎等肝臟疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，雞骨草有降脂保肝、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、增強免疫、抗氧化等多種生物活性[2]?；瘜W成分是中藥多靶點、多途徑發(fā)揮協(xié)同作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，關(guān)于雞骨草化學成分的研究多集中在雞骨草全草或提取物的成分分離制備，以及基于高效液相色譜技術(shù)的指紋圖譜分析和相思子堿、下箴刺桐堿、夏佛塔苷等主成分的含量測定方面[3―4]，而對于雞骨草化學成分系統(tǒng)分析的研究鮮有報道。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（ultraperformance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率的特點，已廣泛用于中藥化學成分的分離和結(jié)構(gòu)表征[5]。全信息串聯(lián)質(zhì)譜法作為數(shù)據(jù)依賴型串聯(lián)質(zhì)譜法的一種，具有全面、準確、簡便、靈活的特點，可為成分解析提供充足、可靠的數(shù)據(jù)源。此外，UNIFI平臺功能強大，具有自動離子流提取、預測分子式、商用/自建數(shù)據(jù)庫檢索等功能，可實現(xiàn)化學成分快速、靶向分析，在質(zhì)譜數(shù)據(jù)后處理方面展現(xiàn)出了良好的應用前景?；诖?，本研究首先建立UPLC-Q-TOF/MS分析方法，基于全信息串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式，全面采集雞骨草質(zhì)譜數(shù)據(jù)；然后整理關(guān)于雞骨草化學成分的文獻報道，建立雞骨草化學成分數(shù)據(jù)庫；再利用UNIFI平臺，通過靶向與非靶向分析快速解析雞骨草的化學成分，以期為雞骨草藥效物質(zhì)的闡釋、質(zhì)量標準的提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

Acquity UPLC Ⅰ-Class型超高效液相色譜系統(tǒng)、Xevo G2-XS Q Tof型四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（配有UNIFI科學信息學系統(tǒng)V1.7和Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站）均購自美國Waters公司；Q-250A3型高速多功能粉碎機購自上海冰都電器有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

雞骨草藥材購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥學院譚勇教授鑒定為豆科植物廣州相思子A. cantoniensis Hance的干燥地上部分。下箴刺桐堿、牡荊素、異牡荊素、木犀草素4種對照品（批號分別為RFS-X06801909002、RFS-M02302002022、RFS-Y11602-107028、RFS-M00702004028，純度均大于98%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；葫蘆巴堿、芒柄花素、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、維采寧-Ⅱ5種對照品（批號分別為AF21062651、AF20052952、AF21061501、AF21062602、AF20112508，純度均大于98%）均購自成都埃法生物科技有限公司；質(zhì)譜級乙腈、甲醇、甲酸均購自美國Fisher公司；亮氨酸-腦啡肽（批號為ST158449，純度大于98%）購自美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取雞骨草適量，粉碎，過2號篩，精密稱取雞骨草粉末50 mg，加入10 mL 80%甲醇，渦旋2 min，超聲（功率150 W，頻率50 kHz）溶解30 min，靜置放冷，過濾，收集濾液，以12 000 r/min 離心 15 min，取上清液，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取9個對照品粉末各適量，分別用少量二甲基亞砜助溶，以80%甲醇為溶劑，配制成單個對照品貯備液（1 mg/mL）及混合對照品溶液（10 μg/mL），4 ℃避光保存，備用。

2.2 檢測條件

2.2.1 色譜條件 采用ACQUITY PRM HSS T3 FIT 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）、乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3 min，5%B；3～10 min，5%B→10%B；10～20 min，10%B→30%B；20～30 min，30%B→65%B；30～35 min，65%B→95%B；35～37 min，95%B→100%B；37～40 min，100%B）；進樣體積為2 μL；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）50～1 500。優(yōu)化的儀器參數(shù)如下：在正、負離子檢測模式下，毛細管電壓分別為3.0 kV（+）和2.5 kV（－）；錐孔電壓為40 V，錐孔氣流量為50 L/h，脫溶劑氮氣流量為600 L/h，氬氣流量為0.15 mL/min，離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣溫度為300 ℃，低能通道中碰撞能量設(shè)置為6 V，高能通道中碰撞能量設(shè)置為20～35 V。亮氨酸-腦啡肽（100 ng/L）用作Lock Spray實時校正，流速為10 μL/min。

2.3 數(shù)據(jù)后處理

（1）以“雞骨草”“Abrus cantoniensis Hance”為檢索詞，通過檢索中國知網(wǎng)、PubMed等數(shù)據(jù)庫，收集、整理雞骨草所含化學成分的信息，建立雞骨草化學成分數(shù)據(jù)庫。（2）將質(zhì)譜“原始數(shù)據(jù)”和“雞骨草化學成分數(shù)據(jù)庫”導入UNIFI V1.7平臺，進行靶向分析。參數(shù)設(shè)置：高能量強度閾值50.0，低能量強度閾值400.0；精確質(zhì)量數(shù)偏差±5.0 mDa，保留時間容差0.1 min；正離子模式下選擇[M+H]+、[M+Na]+為加合離子，負離子模式下選擇[MH]－、[M+HCOO]－為加合離子；正離子校正質(zhì)量數(shù)為556.276 6，負離子校正質(zhì)量數(shù)為554.262 0。對于UNIFI平臺靶向匹配的化合物，需通過對照品比較、質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較、文獻比較等方法進一步確證，以排除假陽性結(jié)果。（3）采用UNIFI V1.7平臺和Masslynx 4.1軟件，通過元素匹配、二級碎片分析及特征碎片、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫信息比較和對照品比較等多種方法，對未匹配的化合物進行非靶向分析。

3 結(jié)果與分析

采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI平臺對雞骨草和混合對照品進行采集和分析，得到正、負離子模式的基峰色譜圖（base peak chromatogram，BPC），見圖1。結(jié)果顯示，共鑒定出46種化合物，包括靶向分析的27種化合物和非靶向分析的19種化合物。其中，黃酮類化合物有19種，三萜類化合物有8種，生物堿類化合物有3種，有機酸類化合物有5種，其他類化合物有11種。通過與對照品比對確證了9種化合物。雞骨草中化學成分的詳細分析結(jié)果見表1。

表1 基于UPLC-Q-TOF/MS的雞骨草化學成分分析結(jié)果

續(xù)表1

圖1 正、負離子模式下雞骨草樣品和混合對照品的BPC圖

3.1 黃酮類成分鑒定

從雞骨草中鑒定出19種黃酮類化合物，主要包括黃酮碳苷類和黃酮苷元類，其中有7種化合物經(jīng)對照品比對確證。

3.1.1 黃酮碳苷類 黃酮碳苷類成分的裂解方式常以糖環(huán)的交叉環(huán)切除反應為主，五碳糖結(jié)構(gòu)常發(fā)生C3H6O3（90 Da）、C2H4O2（60 Da）等中性丟失產(chǎn)生相應的碎片離子，六碳糖結(jié)構(gòu)常發(fā)生C4H8O4（120 Da）、C3H6O3（90 Da）等中性丟失產(chǎn)生相應的碎片離子[9]。本研究以化合物F6為例詳細介紹其鑒定過程。化合物F6的準分子離子峰為m/z 563.140 9[M－H]－，推測其化學式為C26H28O14。碎片離子m/z 473.109 2[M－H－C3H6O3]－、443.099 0[MH－C4H8O4]－、383.078 4[M－H－C4H8O4－C2H4O2]－和353.068 1[M－H－C4H8O4－C3H6O3]－可由準分子離子峰發(fā)生特征中性丟失C3H6O3（90 Da）、C4H8O4（120 Da）、C6H12O6（180 Da）、C7H14O7（210 Da）產(chǎn)生。此外，碎片離子m/z 353.068 1繼續(xù)丟失1分子CO，獲得碎片離子m/z 325.073 0[M－H－C4H8O4－C3H6O3－CO]－；碎片離子m/z 545.129 4[M－H－H2O]－可由準分子離子峰丟失1分子H2O產(chǎn)生。通過與文獻[6―10]和對照品比對鑒定化合物F6為夏佛塔苷，其在負離子模式下的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖2。

圖2 負離子模式下夏佛塔苷的質(zhì)譜圖和可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.1.2 黃酮苷元類 本類黃酮成分常發(fā)生C環(huán)的逆迪爾斯阿爾德裂解（Retro Diels-Alder reaction，RDA）和CH3、CO的中性丟失[6]。本研究以化合物F17為例詳細介紹該類成分的鑒定過程?；衔颋17的準分子離子峰為m/z 267.066 6[M－H]－，推測其化學式為C16H12O4。準分子離子峰分別發(fā)生1分子CH3和1分子CO中性丟失，得到碎片離子m/z 252.047 0[M－H－CH3]－和m/z 239.172 4[M－H－CO]－；準分子離子峰在C環(huán)1，3處發(fā)生RDA裂解，得到碎片離子m/z 132.022 3[M－HC7H5O3]－。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫和對照品比對，鑒定化合物F17為芒柄花素，其在負離子模式下的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

圖3 負離子模式下芒柄花素的質(zhì)譜圖和可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.2 三萜類

在本研究中，三萜類成分的出峰順序較靠后，共鑒定出8種三萜類化合物，該類化合物的裂解規(guī)律如下：（1）易脫去糖基、H2O、CO等中性分子；（2）在B、C環(huán)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生相應的碎片峰；（3）具有?12-齊墩果烯結(jié)構(gòu)的三萜類化合物，C環(huán)易發(fā)生RDA[11]。本研究以化合物T3為例詳細介紹其鑒定過程。低能量通道質(zhì)譜圖顯示，化合物T3的加合離子峰為m/z 949.517 8[M+Na]+，推測其化學式為C48H78O17。高能量通道質(zhì)譜圖顯示，碎片離子m/z 599.389 4[M+H－Rha－Glu－H2O]+可由母離子丟失1分子鼠李糖、葡萄糖和H2O產(chǎn)生；碎片離子m/z 441.372 4[M+H－Rha－Glu－GluA]+可由母離子丟失1分子鼠李糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸產(chǎn)生；碎片離子m/z 425.377 6[M+H－Glu－Rha－OGluA]+可由糖苷結(jié)構(gòu)脫去糖鏈產(chǎn)生，其繼續(xù)丟失1分子H2O可產(chǎn)生碎片離子m/z 407.368 9，繼續(xù)發(fā)生RDA產(chǎn)生m/z 217.190 5[M+H－Glu－Rha－OGluA－H2O－C14H22]+的碎片。經(jīng)與參考文獻[11―14]和數(shù)據(jù)庫匹配，鑒定化合物T3為槐花皂苷Ⅲ，其在正離子模式下的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖4 正離子模式下槐花皂苷Ⅲ的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.3 生物堿類

在雞骨草中共鑒定出3種生物堿類化合物，其中有2種經(jīng)對照品對比確證。經(jīng)分析對照品和樣品中生物堿的質(zhì)譜裂解途徑，筆者發(fā)現(xiàn)該類生物堿支鏈易發(fā)生裂解，母核不易發(fā)生裂解。本研究以化合物A3為例詳細介紹其鑒定過程。化合物A3的準分子離子峰為m/z 247.144 3[M+H]+，推測其化學式為C14H18N2O2。在正離子模式下，準分子離子峰相繼脫去1分子三甲胺、1分子CO2、1分子亞甲基分別形成碎片離子m/z 188.071 0[M+H－C3H9N]+、m/z 143.072 9[M+H－C3H9N－CO2]+和m/z 118.065 2[M+H－C3H9N－CO2－C2H3]+。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫和對照品比對，鑒定化合物A3為下箴刺桐堿，其在正離子模式下的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖5 正離子模式下下箴刺桐堿的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.4 有機酸類

在雞骨草中共鑒定出5種有機酸類成分。該類化合物的質(zhì)譜裂解特點為易發(fā)生CO2、H2O等中性丟失[5，7]。本研究以化合物O2為例詳細介紹其鑒定過程?；衔颫2的準分子離子峰為m/z 191.020 5[M－H]－，推測其化學式為C6H8O7。準分子離子峰連續(xù)脫去1分子H2O、1分子CO2、1分子H2O分別形成碎片離子m/z 173.008 7[M－H－H2O]－、m/z 128.038 1[M－H－CO2－H2O]－和m/z 111.011 3[M－H－CO2－2H2O]－。此外，化合物O3的準分子離子峰、碎片離子峰與化合物O2相似，推測其互為同分異構(gòu)體。經(jīng)與文獻[16－17]和數(shù)據(jù)庫比對，鑒定化合物O2為異檸檬酸，化合物O3為檸檬酸（圖略）。

3.5 其他類

本研究在雞骨草中共鑒定出11種其他類成分，主要為蒽醌類、酰胺類化合物。以化合物G2為例介紹其鑒定過程。化合物G2的準分子離子峰為m/z 268.108 5[M+H]+，推測其化學式為C10H13N5O4。準分子離子峰脫去1分子核苷產(chǎn)生碎片離子m/z 136.061 8[M+HC5H8O4]+。經(jīng)與文獻[18]和數(shù)據(jù)庫比對，鑒定化合物G2為腺嘌呤核苷（圖略）。

4 討論

本研究基于UPLC-Q-TOF/MS獲得的高分辨前體離子信息和豐富的碎片離子信息可為雞骨草化學成分解析提供充足的數(shù)據(jù)支撐。結(jié)合UNIFI平臺，基于色譜峰提取、數(shù)據(jù)庫靶向篩選和碎片離子注釋等功能，可實現(xiàn)對目標化學成分的快速定性分析，大大減少質(zhì)譜數(shù)據(jù)后處理的盲目性和耗時性。但本研究也存在一些方法上的不足：（1）難以區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體。如本研究中低能量通道質(zhì)譜圖顯示，在保留時間為9.01、9.40、10.36 min的位置均出現(xiàn)了m/z 563的色譜峰，其高能量通道質(zhì)譜圖的碎片離子也相似。采用UNIFI平臺對3個色譜峰進行分析，UNIFI將3個色譜峰均匹配為夏佛塔苷，出現(xiàn)了假陽性結(jié)果。經(jīng)與文獻[8―9，20]和對照品比對，最終將這3個色譜峰依次鑒定為夏佛塔苷、維采寧-Ⅲ、異夏佛塔苷。（2）UNIFI平臺的碎片離子注釋需進一步驗證或修正。如化合物F6的碎片離子m/z 383.078 4，UNIFI平臺提供的碎片離子注釋為母核糖苷鍵斷裂丟失1分子六碳糖和五碳糖上的1分子H2O，而實際的斷裂是由于六碳糖和五碳糖發(fā)生糖環(huán)的交叉環(huán)切反應[9]。當前，UPLC-Q-TOF/MS結(jié)合UNIFI平臺的分析方法對于結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體的鑒定還需要通過與對照品、文獻數(shù)據(jù)比較及疏水常數(shù)分析等方法進一步驗證。碎片離子注釋信息對化學成分的解析提供了很大的幫助，但對于復雜的裂解，仍需要結(jié)合文獻進行分析。

綜上所述，本研究建立了UPLC-Q-TOF/MS結(jié)合UNIFI平臺的分析方法，實現(xiàn)了對雞骨草化學成分的快速鑒定。從雞骨草中鑒定出了46種化合物，包括黃酮類化合物19個、三萜類化合物8個、生物堿類化合物3個、有機酸類化合物5個、其他類化合物11，其中11種化合物在雞骨草中首次報道，9種化合物經(jīng)過對照品比對確證。本研究初步闡明了壯藥雞骨草的主要化學成分，可為雞骨草藥效物質(zhì)及作用機制的深入研究、質(zhì)量標準的提升提供數(shù)據(jù)支撐，研究方法可為其他中藥化學成分的快速分析提供參考。