孫之中，劉朝紅，陳其華，易 倩，羊 羨，趙 姣，林雅思，何 歡，劉均瑜

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410007)

糖尿病足潰瘍(Diabetic foot ulcer，DFU)是由于足部神經(jīng)病變以及缺氧缺血缺失感覺、缺失活力，且伴隨著感染而引發(fā)的足潰瘍，其為糖尿病常見的并發(fā)癥之一[1]。糖尿病患者一旦發(fā)生DFU很難痊愈，甚至往更嚴(yán)重的方向發(fā)展，而且具有較高的截肢及死亡風(fēng)險，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重不良影響，同時也加重了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。DFU屬中醫(yī)學(xué)“脫疽”等范疇，患者氣陰兩虛、瘀血內(nèi)阻，肢端壞疽，應(yīng)益氣養(yǎng)血、生肌斂瘡、解毒通絡(luò)[2]。《素問》記載：“發(fā)于足趾,名曰脫疽,其狀赤黑,死不治；不赤黑,不死。不衰,急斬之,不則死矣”[3]。因此，以去除壞死組織為治療DFU首要手段。然而，去除壞死組織后病足潰瘍創(chuàng)面愈合仍然是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一個棘手問題，生肌類中藥的使用對DFU愈合起著關(guān)鍵作用。象皮生肌膏作為經(jīng)典中醫(yī)外用制劑，具有清熱解毒、活血止痛、斂瘡生肌的作用[4]。多項(xiàng)臨床研究表明[5]，象皮生肌膏可促進(jìn)創(chuàng)面恢復(fù)，具有較好的糖尿病足潰瘍治療效果，但其作用機(jī)制尚未明確，仍需進(jìn)一步探討。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞經(jīng)過特定程序轉(zhuǎn)化成帶有間質(zhì)表型細(xì)胞的過程，是創(chuàng)傷修復(fù)過程的重要分化過程，亦是器官纖維化、腫瘤以及傷口愈合發(fā)生的重要基礎(chǔ)[6]?；诖耍狙芯客ㄟ^對DFU大鼠進(jìn)行象皮生肌膏治療，并從EMT方向探討象皮生肌膏促進(jìn)DFU創(chuàng)面愈合的機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司采購SPF級雄性SD大鼠40只，平均體重(272.45±5.48)g，動物許可證號：SCXK(湘)2009-0004，將大鼠安置于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級；溫度20～22 ℃，濕度50%～60%，予以標(biāo)準(zhǔn)飼料，兩天更換一次墊料及消毒籠具。所有試驗(yàn)及操作均嚴(yán)格遵守國家衛(wèi)生研究院中有關(guān)實(shí)驗(yàn)室動物倫理準(zhǔn)則及使用指南，且已通過湖南省實(shí)驗(yàn)動物管理委員會審核同意。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器：象皮生肌膏(批號20190818，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科自制，主要成分有象皮粉、龜甲、生地黃各120 g，當(dāng)歸100 g，生石膏150 g，爐甘石200 g，血余炭80 g)；醫(yī)用碘伏(批號150101，四川金山制藥有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(批號2A16010901，山東齊都藥業(yè)有限公司)；鏈脲佐菌素(批號Y161101，北京索萊寶科技用有限公司)；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(批號PH1716，天津百倫斯生物技術(shù)有限公司)；水合氯醛(批號191S09R23，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；青霉素(批號F6057301，華北制藥股份有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號CK5441Y，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)；一次性使用無菌注射器(武漢帝王冠醫(yī)療器械有限責(zé)任公司)；實(shí)時熒光定量PCR儀(型號TL988-Ⅰ型，天隆科技公司)；臺式冷凍離心機(jī)(型號AllegraX-15R，美國貝克曼庫爾特有限公司)；雙目顯微鏡(型號DM LB2型，德國LEICA公司)；微型蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號PowerPac Basic，美國Bia-Rad公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立糖尿病大鼠模型：40只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，予以普通飼料喂養(yǎng)，5 d后從中隨機(jī)選擇10只大鼠作為空白組，繼續(xù)予以普通飼料喂養(yǎng)。將余下30只作為糖尿病組，予以高脂高糖飼料繼續(xù)喂養(yǎng)1個月，引導(dǎo)大鼠發(fā)生胰島素抵抗。建模前大鼠需禁食14 h，在糖尿病組腹腔注射1% 鏈脲佐菌素，空白組大鼠予以等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。注射結(jié)束后4 h恢復(fù)正常喂養(yǎng)，72 h定時監(jiān)測血糖，如連續(xù)3次血糖均值>16.7 mmo1/L即為糖尿病模型建立成功。

1.2.2 建立糖尿病足潰瘍大鼠模型：建立大鼠缺損性皮膚潰瘍模型，建模成功后觀察7 d，所有大鼠建立糖尿病足潰瘍模型。術(shù)前所有大鼠予以注射青霉素8 IU以防止感染，隨后注射適量水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉后每只大鼠進(jìn)行背部脫毛，最后在脫毛處涂抹碘伏或者酒精消毒。沿著大鼠脊柱正中肩胛骨下緣2 cm處切下2 cm×2 cm的全層皮膚，使?jié)冎敝两钅?，接?.9%氯化鈉溶液沖洗創(chuàng)面并包扎，術(shù)后及時復(fù)溫。

1.2.3 分組及給藥：將30只糖尿病足潰瘍模型大鼠隨機(jī)分成三組，即模型組、對照組(碘伏)、實(shí)驗(yàn)組(象皮生肌膏)。四組均使用0.9%氯化鈉溶液清理傷口，對照組、實(shí)驗(yàn)組加用對應(yīng)藥物外敷在創(chuàng)面上，空白組、模型組則用無菌0.9%氯化鈉溶液外敷。每組每隔24 h進(jìn)行創(chuàng)面換藥處理，連續(xù)用藥14 d。

1.2.4 創(chuàng)面愈合率：分別在干預(yù)后的第7、14天觀察并記錄各組大鼠創(chuàng)面情況，以標(biāo)尺定位創(chuàng)面并拍照，固定相機(jī)焦距和相機(jī)與創(chuàng)面間的距離，并用圖像分析IPP軟件分析未愈合面積，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率(%)=[(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積]×100%[7]。

1.2.5 檢測各組創(chuàng)面TGF-β1、IGF-1、FN、E-cadherin、Fibronectin蛋白及mRNA的表達(dá)：在干預(yù)后的第7、14天采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-qPCR)檢測TGF-β1、IGF-1、FN、E-cadherin、Fibronectin mRNA表達(dá)情況。

1.2.6 采用Western blotting法檢測TGF-β1、IGF-1、FN、E-cadherin、Fibronectin蛋白表達(dá)情況：取各組大鼠相同位置的創(chuàng)面組織，洗凈后剪碎，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒提取并測定蛋白濃度，采用Western blotting法檢測每組大鼠的TGF-β1、IGF-1、FN、E-cadherin、Fibronectin蛋白表達(dá)情況，一抗按照1∶1000稀釋，二抗按照1∶5000稀釋。GAPDH作為內(nèi)參照蛋白，計算出每組樣本中TGF-β1、IGF-1、FN、E-cadherin、Fibronectin蛋白的相對表達(dá)量。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7 血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)含量：切取的干預(yù)后第7、14天大鼠的創(chuàng)面組織，將標(biāo)本充分研碎制備成勻漿，以2000 r/min離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定組織中VEGF含量，檢測操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析處理應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩進(jìn)一步比較行SNK-q檢驗(yàn)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組干預(yù)第7、14天大鼠創(chuàng)面愈合率比較 空白組大鼠干預(yù)7 d后，創(chuàng)面愈合率高于對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)14 d后，空白組創(chuàng)面愈合率高于對照組、模型組，但低于實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組大鼠干預(yù)7 d后，創(chuàng)面愈合率高于對照組、模型組，低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)14 d后，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合率明顯升高，高于對照組、空白組、模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組大鼠干預(yù)7 d后，創(chuàng)面愈合率高于模型照組，低于空白組及實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)14 d后，對照組創(chuàng)面愈合率高于模型照組，低于空白組及實(shí)驗(yàn)組。模型組干預(yù)第7、14天后創(chuàng)面愈合率均低于對照組、空白組、實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組干預(yù)第7、14天大鼠創(chuàng)面愈合率比較(%)

2.2 各組干預(yù)第7、14天創(chuàng)面E-cadherin和Fibronectin蛋白表達(dá)比較 干預(yù)第7天，與模型組對比，空白組和實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)均降低，F(xiàn)ibronectin表達(dá)均顯著升高；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，F(xiàn)ibronectin蛋白表達(dá)顯著升高(圖1)。干預(yù)第14天，與模型組對比，空白組和實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，F(xiàn)ibronectin蛋白表達(dá)顯著升高(圖2)。

圖1 干預(yù)第7天后，創(chuàng)面E-cadherin和Fibronectin蛋白表達(dá)電泳圖

圖2 干預(yù)第14天后，創(chuàng)面E-cadherin和Fibronectin蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 各組創(chuàng)面TGF-β1、IGF-1、FN mRNA表達(dá)情況比較 干預(yù)第7天，與模型組對比，空白組和實(shí)驗(yàn)組TGF-β1、IGF-1、FN mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)，見表2。干預(yù)第14天，與模型組對比，其他三組FN mRNA表達(dá)均升高，空白組和實(shí)驗(yàn)組TGF-β1的mRNA表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；除空白組外，其他三組的IGF-1的mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 干預(yù)第7天創(chuàng)面TGF-β1、IGF-1、FN mRNA表達(dá)情況比較

表3 干預(yù)第14天創(chuàng)面TGF-β1、IGF-1、FN mRNA表達(dá)情況比較

2.4 各組大鼠皮膚潰瘍組織VEGF表達(dá)比較 空白組大鼠干預(yù)7、14 d后，VEGF表達(dá)均高于對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組大鼠干預(yù)7、14 d后，VEGF表達(dá)均高于對照組、模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組大鼠干預(yù)7、14 d后，VEGF表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠皮膚潰瘍組織VEGF表達(dá)比較(μg/g)

3 討 論

在中醫(yī)范疇中，糖尿病為“消渴”，體現(xiàn)為上中下三焦陰虛、陰損等促使臟腑陰陽失調(diào)，氣血兩虛，使得水液運(yùn)化異常，化濕成痰；血液無氣推動導(dǎo)致運(yùn)輸較慢，逐步促進(jìn)瘀血的形成[8]。另患者陰虛燥熱，長久體虛，如干熱旺盛，則積毒成膿，然而正氣虛弱無力抵抗邪氣，最終導(dǎo)致癰疽癤瘡，即為“脫疽”，為臨床的DFU，其病性屬本虛標(biāo)實(shí)，應(yīng)盡早對創(chuàng)面進(jìn)行治療。象皮生肌膏具有清熱解毒、活血止痛、斂瘡生肌的功效。臨床研究表明象皮生肌膏可通過促進(jìn)血管形成，改善血運(yùn)情況，促進(jìn)肉芽組織生成和上皮化，進(jìn)一步促使?jié)儎?chuàng)面愈合，但其加快創(chuàng)面愈合的相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍需深入探究[9]。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)第7、14天，實(shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面愈合率均最高，提示象皮生肌膏具有較好的創(chuàng)面愈合治療效果，與既往研究相似[10]。象皮生肌膏為中藥制劑，由象皮粉、當(dāng)歸、生地黃、血余炭、爐甘石、生石膏、龜甲組成。其象皮粉有斂瘡止血、清熱解毒之效，為君藥；爐甘石有解毒收濕、止癢斂瘡之效，生石膏有清熱解毒、瀉火功效，兩者為臣藥；當(dāng)歸補(bǔ)血活血、消腫除膿、止痛生肌，生地黃清熱涼血、生津滋陰，血余炭消瘀止血，龜甲滋陰潛陽、壯骨養(yǎng)血，四者均為佐藥[11]。諸藥結(jié)合既有根除外在病灶功效，又兼顧充實(shí)其本，調(diào)節(jié)體內(nèi)氣血陰陽，達(dá)到祛腐斂瘡生肌的效果，促進(jìn)傷口愈合[12]。本研究中，模型組中的E-cadherin表達(dá)上升，F(xiàn)ibronectin表達(dá)下降，提示EMT過程受到限制，影響到創(chuàng)面愈合，而象皮生肌膏能使組織內(nèi)Fibronectin表達(dá)升高，E-cadherin降低，進(jìn)一步推動EMT過程而促進(jìn)愈合。創(chuàng)面愈合是涉及炎癥反應(yīng)、血管生成、再上皮化、細(xì)胞增殖及遷移等多個階段的復(fù)雜過程，而EMT是指上皮細(xì)胞經(jīng)過特定程序轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，且已被證實(shí)包括胚胎發(fā)育、創(chuàng)面愈合、組織器官纖維化等多個病理過程，是可通過治療手段進(jìn)行干預(yù)的過程[13]。

本研究結(jié)果顯示，模型組中創(chuàng)面TGF-β1、IGF-1、FN mRNA表達(dá)降低，而創(chuàng)面愈合速度減慢；實(shí)驗(yàn)組使用象皮生肌膏治療后TGF-β1、IGF-1、FN mRNA表達(dá)升高，且比對照組更早的發(fā)揮EMT調(diào)控作用，加快創(chuàng)面愈合。TGF-β1是一類擁有較多功能的細(xì)胞因子，且被認(rèn)為是最強(qiáng)的致纖維化因子，可調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)新生肉芽組織形成，從而達(dá)到加快組織修復(fù)的目的[14]。TGF-β1通過依賴Smad激活細(xì)胞表面受體，結(jié)合形成Smad復(fù)合物，復(fù)合物則通過進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控EMT重要的轉(zhuǎn)錄因子，對創(chuàng)面愈合有著核心且關(guān)鍵的作用[15]。IGF-1是與胰島素同源的生長因子，其參與調(diào)控組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，在創(chuàng)面愈合的過程起到重要的生理作用[16]。李博文等[17]研究指出，合適濃度的IGF-1可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和分化。但I(xiàn)GF-1的合成及釋放受到糖尿病患者高血糖影響，因此模型組中IGF-1的mRNA表達(dá)減少。本研究中發(fā)現(xiàn)IGF-1在第7天時空白組mRNA表達(dá)較低，實(shí)驗(yàn)組顯著升高而到第14天時迅速下降，且除空白組外其余三組均無明顯差異?？紤]到因空白組無胰島素抵抗而使其處于較為平穩(wěn)的水平，而顯著升高后迅速下降也可能與負(fù)反饋機(jī)制有關(guān)，同時也提示了象皮生肌膏不能促進(jìn)IGF-1的表達(dá)，其可能是通過調(diào)控IGF受體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)來加快創(chuàng)面愈合。FN的創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制是通過促進(jìn)吞噬細(xì)胞功能及促進(jìn)細(xì)胞與纖維基質(zhì)間聯(lián)系而實(shí)現(xiàn)[18-20]。Tang等[21]研究表明，EMT過程中會分泌較多的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，而FN作為ECM重要成分沉積于腎臟，從而導(dǎo)致了纖維化過程，因此糖尿病中E-cadherin降低以及FN表達(dá)增多均與EMT有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠在干預(yù)第7、14天VEGF含量顯著高于對照組、模型組，可見象皮生肌膏可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，進(jìn)一步加速血管生長。VEGF是調(diào)控血管的主要生長因子，能引發(fā)一系列修復(fù)反應(yīng)，可有效促進(jìn)新血管生成。DFU創(chuàng)面VEGF水平不僅異常低表達(dá)，而且縮短表達(dá)高峰持續(xù)時間，是導(dǎo)致創(chuàng)面難愈合的主要原因之一[22-24]。治療組VEGF含量高于對照組、模型組，可能是與象皮生肌膏改善了內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能有關(guān)。

綜上所述，象皮生肌膏可促進(jìn)DFU大鼠模型創(chuàng)面組織的EMT過程，促進(jìn)愈合，其機(jī)制可能是通過調(diào)控TGF-β1、IGF-1、FN 等基因?qū)崿F(xiàn)。此外，TGF-β1、IGF-1、FN 途徑誘導(dǎo)的EMT過程有可能成為DFU新的治療靶點(diǎn)，但仍需進(jìn)一步探究其靶向調(diào)控關(guān)系。