南曉強(qiáng)，楊浩峰，雷 鵬

(1.陜西省人民醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安 710068；2.渭南市中心醫(yī)院，陜西 渭南 714000)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Gouty arthritis，GA)是由關(guān)節(jié)內(nèi)尿酸鈉(Monosodium urate crystals，MSU)結(jié)晶異常，沉積引起的復(fù)發(fā)性慢性炎癥性疾病，為痛風(fēng)最常見(jiàn)的首發(fā)癥狀之一，是男性和絕經(jīng)后婦女最常見(jiàn)的炎癥性關(guān)節(jié)炎[1]。攝入過(guò)多富含嘌呤的食物是GA重要的致病因素，近年來(lái)隨著人們飲食習(xí)慣的改變，GA發(fā)病率逐年上升[2]。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作雖然以自限性炎癥為特征，但發(fā)作時(shí)疼痛難忍，甚至可導(dǎo)致關(guān)節(jié)殘疾，高尿酸血癥被認(rèn)為是本病最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。MSU長(zhǎng)期沉積于滑膜或滑膜腔中可導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)損傷，伴有骨侵蝕及痛風(fēng)結(jié)節(jié)形成[3]。研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)MSU晶體的存在并不一定會(huì)導(dǎo)致炎癥發(fā)作，但人體中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等均可與MSU晶體發(fā)生相關(guān)反應(yīng)，釋放多種細(xì)胞因子，促使急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作[4-5]。富半胱氨酸蛋白61(Cysteine-rich protein 61，Cyr61)是重要的促炎因子，參與炎癥微環(huán)境和自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)[6-7]。正常情況下，Cyr61表達(dá)量較低，以維持機(jī)體生理需要，當(dāng)外界刺激(如炎癥刺激、機(jī)械張力刺激等)時(shí)，其表達(dá)增加，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[8-9]。近期研究表明，Cyr61蛋白的高表達(dá)可以誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子[10]。

息痛散是本課題組經(jīng)臨床實(shí)踐應(yīng)用多年的效驗(yàn)方，該方由生石膏、忍冬藤、蒼術(shù)、黃柏、牛膝、桃仁、全蝎組成。前期實(shí)驗(yàn)證明該方可減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠足跖腫脹度，改善大鼠關(guān)節(jié)周圍組織炎癥反應(yīng)，降低Caspase-1、TNF-α、NF-κB等炎癥指標(biāo)表達(dá)[11-12]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。鑒于此，本研究通過(guò)制備尿酸鈉晶體誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，觀察息痛散是否通過(guò)調(diào)節(jié)Cyr61表達(dá)水平，抑制炎癥因子，減輕炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠50只，平均體重(250±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。各組大鼠均置于潔凈動(dòng)物房,室內(nèi)持續(xù)12 h光照后再持續(xù)12 h避光處理，飼養(yǎng)期間按此循環(huán)給光；動(dòng)物房室溫維持在22 ℃、濕度40%，自由攝水、進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：尿酸鈉(批號(hào)U2875-5G)、秋水仙堿(批號(hào)H20113208)、Cyr61-shRNA慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：全自動(dòng)研磨儀(型號(hào)F-MM400，湖南弗卡斯實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)Sorvall Legend Micro 17，賽默飛世爾科技有限公司)、垂直電泳槽(型號(hào)165-8001，美國(guó)伯樂(lè)公司)、熒光定量PCR儀(型號(hào)LightCycler 480，美國(guó)羅氏公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：采用Coderre和Wall改進(jìn)的方法建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型[13]。用1%戊巴比妥鈉皮下注射麻醉大鼠，將注射器從右踝關(guān)節(jié)外側(cè)與脛骨呈30°～45°方向插入踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注射尿酸鈉混懸液0.2 ml(2.5 g/100 ml)。如關(guān)節(jié)明顯腫脹，表明造模成功。正常組大鼠給予右踝關(guān)節(jié)注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：將50只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、息痛散組、息痛散聯(lián)合shRNA組、秋水仙堿組，每組各10只。根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算，秋水仙堿組用藥劑量為3×10-4g/(kg·d)，息痛散組為72 g/(kg·d)；正常組、模型組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液，息痛散聯(lián)合shRNA組造模成功后立即將Cyr61-shRNA干擾慢病毒0.2 ml注射入關(guān)節(jié)腔，滴度為1E+7TU/ml。秋水仙堿組造模前劑量為1×10-4g/kg，造模后為3×10-4g/kg。其余各組灌胃給藥方法同前，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)：關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的評(píng)估,在實(shí)驗(yàn)前用記號(hào)筆在大鼠右踝關(guān)節(jié)處做標(biāo)記。使用數(shù)字卡尺測(cè)量大鼠右踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，最小精度為0.01 mm。關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)=(造模后-造模前)周長(zhǎng)/造模前周長(zhǎng)。每組重復(fù)3次，取平均值。血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平使用真空采血管采集大鼠腹主動(dòng)脈血約5 ml，標(biāo)號(hào)，放置2 h后用低溫高速離心機(jī)在4 ℃條件下3000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA法測(cè)定大鼠血清中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書所提供的方法及步驟操作，檢測(cè)前將所用試劑和樣本恢復(fù)至室溫。Western blotting檢測(cè)Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白含量,取等量的大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織，每管組織加入400 μl裂解液，同時(shí)加入PMSF，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。隨后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，使用一抗稀釋液將一抗稀釋成適宜濃度[Cyr61(1∶1000)、IL-1β(1∶1000)、TNF-α(1∶1000)、IL-6(1∶1000)]；4 ℃反應(yīng)過(guò)夜；次日，用1×TBST洗膜3次；使用二抗稀釋液將HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體稀釋到1∶5000，室溫孵育膜60 min；再次用1×TBST洗膜3次，每次10 min；將膜浸入ECL發(fā)光液中，反應(yīng)1 min；根據(jù)不同的發(fā)光強(qiáng)度調(diào)整使用Tanon-5200成像系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)靶蛋白；最后用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)檢測(cè)Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA含量,取大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織，組織樣品用Trizol提取總RNA，并進(jìn)行RNA定量，用All-in-One第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析,引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)比較 見(jiàn)表2。模型組、息痛散組、秋水仙堿組在造模各時(shí)間點(diǎn)的腫脹指數(shù)均高于正常組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示各造模組大鼠右踝關(guān)節(jié)明顯腫脹，造模成功。息痛散組和秋水仙堿組踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；息痛散聯(lián)合shRNA組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠右踝關(guān)節(jié)指數(shù)比較

2.2 各組大鼠血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平比較 見(jiàn)表3。各組大鼠血清中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。息痛散組和秋水仙堿組大鼠血清中Cyr61、IL-1β、IL-6、TNF-α均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。息痛散聯(lián)合shRNA組與模型組血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6比較[pb/(n·L)]

2.3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4(圖1)。干預(yù)后，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)均高于正常組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。息痛散組和秋水仙堿組Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)均低于模型組Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。息痛散聯(lián)合shRNA組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)比較

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白電泳圖

2.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA比較 見(jiàn)表5。大鼠建模成功后，各組大鼠給予對(duì)應(yīng)的藥物處理，觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA情況。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。息痛散組和秋水仙堿組Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6 的mRNA均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。息痛散聯(lián)合shRNA組各項(xiàng)的mRNA與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA比較

3 討 論

中醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬為“痹癥”“歷節(jié)”范疇[14]，《素問(wèn)·痹論》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，將痹癥分為風(fēng)痹、痛痹、著痹。漢代張仲景《金匱要略》中有血痹、濕痹、歷節(jié)之名，并且創(chuàng)制了烏頭湯、桂枝芍藥知母湯。痛風(fēng)最早見(jiàn)于南朝梁時(shí)著名醫(yī)家陶弘景的《名醫(yī)別錄·上品》，主要闡明痛風(fēng)是由風(fēng)邪侵襲而致。元代朱丹溪又對(duì)痛風(fēng)的臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行具體論述，提出了多種診療方法，《格致余論·痛風(fēng)論》提出：“作痛，夜則痛甚”“治法以辛熱之劑”；《丹溪心法·痛風(fēng)附肢節(jié)痛》記載：“四肢百節(jié)走痛是也”。通過(guò)以上文獻(xiàn)的整理，筆者認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要與嗜食肥甘，飲酒無(wú)度，日久傷及脾胃，脾失運(yùn)化，濕熱痰濁蘊(yùn)積于體內(nèi)，久則衍化毒熱有關(guān)，濕、熱、毒邪相互搏結(jié)，隨經(jīng)外達(dá)筋骨關(guān)節(jié)，引發(fā)關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛等癥。因此，痰熱、濕毒壅盛為本病病機(jī)之所在，治療以祛風(fēng)除濕，清熱瀉火，通絡(luò)止痛為原則。息痛散中生石膏辛甘性寒，質(zhì)重降火；忍冬藤清熱解毒，宣泄風(fēng)熱，活血通絡(luò)，兩者共為君藥；蒼術(shù)、黃柏以二妙組成，既可增強(qiáng)生石膏、忍冬藤清熱解毒之力，又可燥濕化痰；全蝎、桃仁活血通絡(luò)以止痛，為臣藥；牛膝活血通絡(luò)，引藥下行，使藥直達(dá)病所，全方共奏祛風(fēng)除濕，清熱瀉火，通絡(luò)止痛之功。前期研究發(fā)現(xiàn)，息痛散可以減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)尿酸鹽結(jié)晶沉積，改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹度，但炎癥因子的調(diào)控機(jī)制尚不清楚[11]。

GA炎癥的發(fā)生與IL-1β、TNF-α、IL-6密切相關(guān)。中性粒細(xì)胞異常聚集是風(fēng)濕性疾病的標(biāo)志。有研究表明，中性粒細(xì)胞減少可抑制關(guān)節(jié)炎癥，因此減少中性粒細(xì)胞的募集或者激活可能有助于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療[15]。在急性痛風(fēng)發(fā)作期間，中性粒細(xì)胞是關(guān)節(jié)腔滲出液中的主要細(xì)胞群[16-17]，當(dāng)其與尿酸鈉晶體接觸時(shí)，并產(chǎn)生和釋放活性形式的IL-1β[18]，導(dǎo)致網(wǎng)狀沉淀的形成[19]。并通過(guò)釋放TNF-α、IL-6和前列腺素E進(jìn)一步激活局部炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)患者痛覺(jué)加重[20-22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)模型大鼠滑膜組織和血清中IL-1β、TNF-α、IL-6均升高，與GA炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)一致，且息痛散能明顯減少GA大鼠模型機(jī)體及組織中炎癥介質(zhì)釋放。

Cyr61目前被認(rèn)為是一種新的促炎因子[23]。Cyr61與自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，其對(duì)免疫炎癥性疾病的影響越來(lái)越受到關(guān)注[24-25]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，Cyr61在關(guān)節(jié)炎癥、骨破壞的形成過(guò)程中均發(fā)揮作用[10]。本研究運(yùn)用Coderre和Wall改進(jìn)的方法建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，同時(shí)使用特異性Cyr61干擾慢病毒注入大鼠病變關(guān)節(jié)腔，去除滑膜中Cyr61表達(dá)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)息痛散可減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)足跖腫脹度，當(dāng)Cyr61表達(dá)缺失時(shí)，息痛散抑制大鼠關(guān)節(jié)足跖腫脹度降低，同時(shí)IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)均降低。從本研究結(jié)果推測(cè)，Cyr61參與了GA的炎癥過(guò)程，能促進(jìn)IL-1β、TNF-α、IL-6分泌，是GA炎癥過(guò)程的重要參與者。息痛散能明顯抑制Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)，當(dāng)有Cyr61慢病毒干擾時(shí)，息痛散抑制Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6的能力降低，提示息痛散可能通過(guò)下調(diào)Cyr61表達(dá)來(lái)抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，息痛散治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的分子生物學(xué)機(jī)制可能與降低Cyr61高表達(dá)有關(guān)，但炎癥反應(yīng)的上游路線頗多，息痛散如何干預(yù)具體靶點(diǎn)將是本課題組下一步的主要研究方向。