高 潔，姜 嘯，崔琳琳**

(1.山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院女性生殖科，濟(jì)南 250021；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科，濟(jì)南 250012)

目前應(yīng)用于臨床的生育力保存手段主要包括：卵子冷凍保存、精子冷凍保存、胚胎冷凍保存、睪丸組織冷凍保存以及卵巢組織冷凍保存，其中配子冷凍保存(卵子、精子)和胚胎冷凍保存是輔助生殖技術(shù)(assistant reproductive technology，ART)治療過(guò)程中最常用技術(shù)之一。國(guó)際首例凍融精子、胚胎和卵子妊娠嬰兒分別出生于1983年、1984年和1986年。自此,該技術(shù)在生殖醫(yī)學(xué)臨床領(lǐng)域開(kāi)始得到廣泛應(yīng)用。2020年中華生殖醫(yī)學(xué)會(huì)調(diào)查顯示2013年凍胚移植周期占全周期的比例為34.8%[1]，至2016年凍胚移植周期比例已增至40.5%[2]。由此可見(jiàn)，凍胚移植周期大有超過(guò)新鮮周期成為ART移植主導(dǎo)的趨勢(shì)。然而無(wú)論是配子還是胚胎的凍融均屬于生命早期的非生理性暴露。有研究表明，妊娠女性凍融周期的孕產(chǎn)期結(jié)局與新鮮周期存在差異，并且根據(jù)健康與疾病的發(fā)育起源(Developmental Origins of Health and Disease)理論，這些暴露的影響還可能映射到子代的遠(yuǎn)期健康上。本文通過(guò)對(duì)冷凍復(fù)蘇技術(shù)對(duì)配子、胚胎以及基于此技術(shù)妊娠的后代的潛在影響及相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)行綜述，旨在深入探討該技術(shù)對(duì)后代的近期和遠(yuǎn)期安全性，為臨床應(yīng)用和相關(guān)管理政策提供理論依據(jù)。

1 基于冷凍技術(shù)的生育力保存

生育力保存技術(shù)是指通過(guò)特定的技術(shù)在零下溫度將細(xì)胞或組織冷凍，以降低生物代謝活動(dòng)，從而保存以備后續(xù)使用的技術(shù)，主要包括卵子冷凍、精子冷凍、胚胎冷凍以及卵巢和睪丸組織的冷凍保存。

1.1 冷凍復(fù)蘇技術(shù) 生育力保存常用的冷凍方法主要有慢速程序冷凍法和玻璃化冷凍。慢速程序冷凍法，即冷凍降溫的速度慢，它可使細(xì)胞充分脫水，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成進(jìn)而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損害。目前臨床主要應(yīng)用的是玻璃化冷凍，它可通過(guò)較快的冷凍降溫速率，使細(xì)胞內(nèi)外黏度增高固化成玻璃樣，從源頭上阻止冰晶形成，并且減少了滲透損害。玻璃化冷凍又分為開(kāi)放性和封閉性。開(kāi)放性玻璃化冷凍是指樣本直接與液氮接觸，理論上來(lái)說(shuō)，液氮中的微生物或細(xì)菌污染樣本的可能性增大。封閉性玻璃化冷凍則將樣本與液氮分開(kāi)放置，研究提示這有效地減少了上述污染風(fēng)險(xiǎn)。但與開(kāi)放性玻璃化冷凍相比，封閉性冷凍妊娠率相對(duì)低，所以臨床更傾向于使用開(kāi)放性冷凍。為了達(dá)到冷凍的標(biāo)準(zhǔn)以及消除病原體污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，近期研究提出半自動(dòng)玻璃化冷凍方法。有研究比較了半自動(dòng)玻璃化冷凍和開(kāi)放性冷凍的胚胎發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)兩種方法凍融后2PN卵母細(xì)胞的存活率以及胚胎發(fā)育并無(wú)顯著差異[3]。

冷凍保護(hù)劑主要用于在低溫保存生物樣品過(guò)程中降低細(xì)胞的冷損傷，分為滲透性和非滲透性保護(hù)劑。冷凍配子和胚胎最常用的滲透性冷凍保護(hù)劑有甘油、甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇、二甲基亞砜(DMSO)、胺等。研究表明，滲透性冷凍保護(hù)劑隨著濃度的增加，其毒性也增強(qiáng)[4]。玻璃化冷凍最常用的非滲透性的冷凍保護(hù)劑有蔗糖和海藻糖,它們可有效減少卵母細(xì)胞及胚胎對(duì)滲透休克的敏感性。此外，復(fù)溫的過(guò)程對(duì)于冷凍配子及胚胎的生存率也非常重要。它主要是通過(guò)逐步降低冷凍保護(hù)劑的濃度，讓滲透壓逐漸降到最低，進(jìn)而去除冷凍保護(hù)劑的作用，從而達(dá)到復(fù)溫的目的。

1.2 臨床應(yīng)用 該技術(shù)最初應(yīng)用于年輕腫瘤患者。放化療和部分手術(shù)治療會(huì)導(dǎo)致患者的生育能力下降約40%[5]，因此治療前患者可通過(guò)冷凍技術(shù)保存生育能力。在ART領(lǐng)域，以胚胎冷凍為主的生育力保存起初主要用于ART治療過(guò)程中富余生育力的保存和并發(fā)癥的預(yù)防。但近年來(lái)隨著ART的廣泛應(yīng)用，由于胚胎冷凍具有提高部分特殊患者妊娠成功率、規(guī)避不良宮腔環(huán)境以及備行胚胎遺傳檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，“全胚冷凍”策略有成為ART移植主導(dǎo)選擇趨勢(shì)。

控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)是ART治療的首要環(huán)節(jié)，而卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)是COH最主要的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為血管通透性增加引起的第三腔隙積液以及高雌激素導(dǎo)致的血液高凝，相關(guān)癥狀會(huì)因妊娠而進(jìn)行性加重[6]。多中心隨機(jī)對(duì)照臨床研究表明，全胚冷凍策略可顯著降低OHSS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、減輕其癥狀嚴(yán)重程度[7]。對(duì)于多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者，全胚冷凍可以增加其ART助孕成功率和活產(chǎn)率，因而得到廣泛應(yīng)用[8]。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)(preimplantation genetic testing，PGT)主要應(yīng)用于有遺傳疾病風(fēng)險(xiǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及高齡患者，由于胚胎需要在取樣后等待遺傳檢測(cè)結(jié)果，因此全胚冷凍也是其運(yùn)行的必要條件。此外，對(duì)于如宮腔粘連、子宮內(nèi)膜息肉等宮腔病變以及其它不適于妊娠的急性疾病患者來(lái)說(shuō)，全胚冷凍也成為一個(gè)重要的緩沖方法，為重新準(zhǔn)備適合胚胎植入的宮腔環(huán)境提供更好的機(jī)會(huì)。

除胚胎冷凍外，卵子和精子的冷凍也是目前常用的生育力保存技術(shù)。前者主要用于ART過(guò)程中有卵子富余或因男方因素?zé)o可用精子的情況，也可用于無(wú)法進(jìn)行體外受精時(shí)的生育力保存(如未婚女性)，但是目前我們國(guó)家不允許未婚女性行卵子冷凍來(lái)保存生育力。后者除用于男性生育力保存外，更主要的用途是支撐精子庫(kù)。

2 冷凍復(fù)蘇對(duì)后代的潛在影響及機(jī)制

研究表明,ART子代出生缺陷及部分新生兒結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)的增加與配子及胚胎體外操作有關(guān)，尤其是冷凍損傷。冷凍對(duì)配子或胚胎損傷的評(píng)估主要是根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)、功能、遺傳變化來(lái)判斷的，其機(jī)制涉及冷凍保護(hù)劑的毒性、細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成、溶解效應(yīng)、滲透損傷等。

2.1 精子凍融 有研究發(fā)現(xiàn)，雖然冷凍對(duì)精子的DNA造成了損傷[9]，該損傷可能會(huì)影響胚胎發(fā)育，但是與新鮮精子相比，其優(yōu)胚率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與夫精人工授精(artificial insemination with husband's semen，AIH)相比，供精人工受精(artificial insemination with donor's semen,AID)的子代出生體重明顯增加，這與之前研究提出的冷凍子代巨大兒發(fā)生率高的結(jié)果相一致。還有研究報(bào)道AID妊娠的子代有印記基因障礙[11]，這提示凍精妊娠后代表觀遺傳改變可能，但個(gè)案報(bào)告證據(jù)級(jí)別有限，還需高級(jí)別證據(jù)證實(shí)。

精子冷凍后微細(xì)結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)能力及受精功能均有一定程度的損傷[12]。結(jié)構(gòu)改變主要表現(xiàn)為DNA損傷和質(zhì)膜改變。研究發(fā)現(xiàn)，冷凍后人類精子mtDNA的拷貝數(shù)增加，且mtDNA拷貝數(shù)與精液參數(shù)呈負(fù)相關(guān)[13]，這表明精子冷凍后，mtDNA拷貝數(shù)增加，精液質(zhì)量變差。有關(guān)精液參數(shù)的研究提示冷凍復(fù)蘇的精子活動(dòng)率下降、運(yùn)動(dòng)形態(tài)異常，特別是快速前向運(yùn)動(dòng)精子的比例明顯下降，精子頂體酶的活性降低，可能原因是冷凍復(fù)溫后精子膜的通透性增加，導(dǎo)致線粒體腫脹、功能障礙，或精子內(nèi)容物漏失，精子能量代謝降低或停止。目前研究認(rèn)為，冷凍造成精子損傷的一個(gè)重要原因是精子內(nèi)氧自由基與抗氧化劑的平衡破壞，產(chǎn)生過(guò)量的氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress response,ROS)，使膜脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞了精子的超微結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致精子的形態(tài)或功能異常[14]。上述所說(shuō)的mtDNA拷貝數(shù)增加的機(jī)制可能也與ROS有關(guān)，有研究猜測(cè)可能是ROS損壞了線粒體氧化呼吸鏈，抑制了ATP的合成，從而使mtDNA代償性增加[15]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)，冷凍精子復(fù)蘇過(guò)程中精子DNA損傷加重，可能與高活性氧水平或氧化還原失衡有關(guān)[16]。

2.2 卵子凍融 有研究表明,凍融卵子的受精率、胚胎著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率以及活產(chǎn)率與新鮮卵母細(xì)胞相當(dāng)[17]。Seshadri等[18]比較了應(yīng)用凍融卵子和新鮮卵子女性的孕產(chǎn)期結(jié)局，兩者臨床妊娠率、活產(chǎn)率及新生兒出生體重?zé)o顯著差異，產(chǎn)前出血、妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病、膽汁淤積癥和胎膜早破等并發(fā)癥的發(fā)生率也無(wú)顯著差異。但有研究提出前者妊娠期高血壓疾病發(fā)生率更高。與自然妊娠子代相比，凍融卵子妊娠子代的新生兒結(jié)局，如出生體重、身長(zhǎng)、胎齡、小于胎齡兒發(fā)生率、Apgar評(píng)分、新生兒住院率和出生缺陷也無(wú)顯著差異[18]。近期有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，凍融和新鮮卵子的子代在2歲時(shí)的人體測(cè)量參數(shù)沒(méi)有明顯差異[19]。但目前關(guān)于后代遠(yuǎn)期結(jié)局的研究尚少，仍有待進(jìn)一步研究。

影響卵子冷凍后的存活、受精及卵裂產(chǎn)生的因素可能有：卵母細(xì)胞的體積、質(zhì)量、所處的成熟階段以及其周圍包繞的顆粒細(xì)胞等。Camargos等[20]對(duì)于人類卵子冷凍前后形態(tài)的變化研究發(fā)現(xiàn)，凍融后的卵子在通過(guò)卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)受精后，未能成功受精卵子的總直徑和卵黃周圍間隙的收縮比成功受精的卵子大，這可能是由于卵子受到冷凍損傷或者滲透性休克導(dǎo)致。但研究發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍復(fù)蘇的卵子與新鮮卵子形態(tài)學(xué)參數(shù)沒(méi)有差異。冷凍對(duì)卵子造成損傷的原因可能是它導(dǎo)致了皮層顆粒過(guò)早的釋放，破壞了糖蛋白等,阻礙了紡錘體分離，改變了線粒體功能，使透明帶硬化，從而使受精能力下降[21]。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞微管微絲對(duì)正常染色體分離至關(guān)重要，已有研究表明冷凍可能破壞微管微絲的穩(wěn)定性，即卵子在非生理溫度時(shí)裂變的紡錘體形成的微管傾向于解聚其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的染色體不能正常分離，這有可能會(huì)導(dǎo)致胚胎非整倍體，甚至子代異常核型的出現(xiàn)。此外，卵子冷凍保存會(huì)導(dǎo)致皮質(zhì)顆粒內(nèi)酶的過(guò)早釋放，較早作用于透明帶的糖蛋白交聯(lián)，從而阻礙精子的穿透，影響受精；冷凍保存還會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞透明帶的物理?yè)p傷，從而導(dǎo)致多個(gè)精子進(jìn)入，因此凍融卵子受精需采用ICSI，ICSI相關(guān)的后代風(fēng)險(xiǎn)也是凍融卵子妊娠后代需要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。

2.3 胚胎凍融 關(guān)于凍融胚胎和新鮮胚胎移植的結(jié)局有較多研究報(bào)道，多認(rèn)為前者大于胎齡兒(large for gestational age，LGA)發(fā)生率、母親妊娠期高血壓、圍產(chǎn)期疾病(胎盤相關(guān)疾病)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高，并且胎兒染色體異常、胎兒畸形的幾率增加[22]。有研究報(bào)道，凍融周期的巨大兒發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比新鮮周期增加約1.5倍，與自然妊娠相比，增加約1.3倍[23]，可見(jiàn)移植凍融胚胎也增加了剖宮產(chǎn)的幾率。但也有研究提出,凍融胚胎移植的母親出現(xiàn)產(chǎn)后出血、胎盤早剝、前置胎盤相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)較低，早產(chǎn)兒、小于胎齡兒、低體重兒及圍產(chǎn)期死亡的發(fā)生率較低。目前關(guān)于其后代遠(yuǎn)期健康的研究較少且結(jié)果存有爭(zhēng)議，Hattori等[24]觀察到移植凍融胚胎會(huì)增加一些罕見(jiàn)印記基因的疾病的發(fā)生率，如安吉爾曼綜合征等，可能會(huì)影響子代的遠(yuǎn)期健康。研究發(fā)現(xiàn)，凍融胚胎子代巨大兒發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加可能會(huì)導(dǎo)致子代發(fā)生肥胖的概率增加，甚至容易患上代謝異常的疾病[25]，但Ainsworth等研究了移植凍胚與鮮胚的新生兒和兒童期體重及發(fā)育軌跡的變化，發(fā)現(xiàn)凍融胚胎移植的新生兒出生體重和兒童的生長(zhǎng)軌跡與新鮮周期沒(méi)有明顯不同[26]。

冷凍對(duì)胚胎造成損傷的因素主要有冰晶形成造成的機(jī)械性損傷，冷凍保護(hù)劑的滲透性損傷以及降溫導(dǎo)致的冷休克損傷等。研究表明，冷凍保存技術(shù)可能導(dǎo)致卵裂球損傷以及凍融胚胎發(fā)育停滯，而且冷凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能會(huì)對(duì)基因的穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎DNA碎片的增加、線粒體DNA的突變等改變[27]。但最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，冷凍時(shí)間長(zhǎng)短與妊娠相關(guān)的并發(fā)癥，如妊娠期糖尿病、高血壓等的發(fā)生沒(méi)有明顯的相關(guān)性[28]。另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，冷凍帶來(lái)的損傷可能會(huì)導(dǎo)致胚胎表觀遺傳學(xué)改變，如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等。多組學(xué)研究表明，這種改變多發(fā)生在與神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及糖脂代謝相關(guān)的過(guò)程中[29]，這提示冷凍所導(dǎo)致的胚胎表觀遺傳學(xué)變化，可能會(huì)影響子代遠(yuǎn)期健康。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，冷凍對(duì)胚胎造成的損傷可能通過(guò)降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1表達(dá)來(lái)影響胚胎發(fā)育，該結(jié)論仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，近期一項(xiàng)研究構(gòu)建了一種特殊的小鼠模型用于研究胚胎冷凍和超排卵環(huán)境的獨(dú)立影響，發(fā)現(xiàn)不是冷凍過(guò)程，而是超排卵環(huán)境會(huì)影響胎盤血管生成，改變胎兒生長(zhǎng)[30]。

綜上所述，盡管冷凍復(fù)蘇技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生殖臨床，但其對(duì)配子和胚胎的結(jié)構(gòu)和功能的影響仍不可忽視。凍融配子和胚胎誕生的子代其新生兒結(jié)局與新鮮周期相比存在一定差異，其機(jī)制涉及物理?yè)p傷、氧化應(yīng)激損傷和表觀遺傳修飾等。但更重要的是這些影響并非“全”或“無(wú)”的，而是可能通過(guò)某些機(jī)制(如表觀遺傳)成為鐫刻在后代生命中的標(biāo)簽，對(duì)其遠(yuǎn)期健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。目前對(duì)于后代近遠(yuǎn)期健康的研究仍較少，而且對(duì)于需同時(shí)經(jīng)歷配子和胚胎多次凍融過(guò)程的后代是否存在疊加效應(yīng)均需進(jìn)一步研究證實(shí)。對(duì)于凍融影響配子和胚胎的具體機(jī)制也需深入探索，以進(jìn)一步評(píng)估和提升該技術(shù)的安全性。