張 帥，李 梅

[山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院)，生殖內(nèi)分泌教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省生殖健康臨床醫(yī)學(xué)研究中心，國(guó)家輔助生殖與優(yōu)生工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250012]

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)嚴(yán)重影響女性的生育功能及身心健康。POI婦女的生育能力明顯降低或喪失，是由于卵巢功能衰退導(dǎo)致的嚴(yán)重排卵異常，包括原始卵泡缺乏或不足、卵泡提前耗竭、卵泡生長(zhǎng)發(fā)育異常等。研究表明，POI的自然妊娠概率約為5%～10%，即使采取助孕措施，進(jìn)行IVF-ET的臨床妊娠率仍然只有7.7%[1]。具有POI高危因素的女性，包括面臨遺傳、免疫、感染等高風(fēng)險(xiǎn)，或因某些疾病及其治療可能損傷卵巢功能，可在POI發(fā)生前或診斷的早期評(píng)估其卵巢儲(chǔ)備，并盡早采取必要的生育力保存措施,包括胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍和卵巢組織冷凍等措施[2]。

1 低溫生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍和卵巢組織冷凍已在臨床上廣泛應(yīng)用。經(jīng)過(guò)冷凍的胚胎、卵母細(xì)胞及卵巢組織，可在液氮中長(zhǎng)期保存。針對(duì)卵巢功能不全的原因以及女性的婚育狀況，生育力保存的策略有所調(diào)整。對(duì)于已達(dá)到POI標(biāo)準(zhǔn)診斷(2次FSH>25IU/L)、超聲顯示基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)1～3個(gè)的患者，仍可嘗試進(jìn)行促排卵，積累卵母細(xì)胞或胚胎。而對(duì)于青春期前的女孩，面臨POI患病風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，卵巢組織冷凍是目前唯一的選擇。

1.1 胚胎冷凍 胚胎冷凍是已婚不孕女性生育力保存的方法之一，也是目前已婚POI患者生育力保存的最有效方法。對(duì)于即將面臨POI高風(fēng)險(xiǎn)的人群，在POI發(fā)生前，應(yīng)爭(zhēng)取通過(guò)體外助孕技術(shù)獲得胚胎進(jìn)行冷凍保存。

1.2 卵母細(xì)胞冷凍 卵母細(xì)胞冷凍作為體外助孕的一項(xiàng)重要衍生技術(shù)，大大拓展了體外助孕的選擇。對(duì)于面臨POI高風(fēng)險(xiǎn)的單身女性，卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)的實(shí)施為她們提供了未來(lái)生育遺傳學(xué)后代的機(jī)會(huì)。成熟卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍是相對(duì)成熟的技術(shù)，對(duì)進(jìn)入青春期或青春期后女性，適當(dāng)?shù)拇倥怕芽色@得一定數(shù)目的成熟卵母細(xì)胞。如何既不耽誤患者疾病的治療，又能盡可能多地獲得成熟卵母細(xì)胞，是影響卵母細(xì)胞冷凍及胚胎冷凍保存效率的關(guān)鍵。

1.3 卵巢組織冷凍 卵巢組織冷凍是通過(guò)腹腔鏡或開(kāi)腹手術(shù)切除全部或部分卵巢組織進(jìn)行卵巢皮質(zhì)凍存的技術(shù)。卵巢皮質(zhì)中含有大量原始卵泡和卵巢間質(zhì)細(xì)胞，卵巢組織的凍存與移植可實(shí)現(xiàn)女性生育力與卵巢內(nèi)分泌功能的保存與恢復(fù)，從而減少與POI相關(guān)的慢性疾病[3]。卵巢組織冷凍不依賴(lài)于性成熟，不需要促排卵，操作簡(jiǎn)單并能快速獲取成千上萬(wàn)的各級(jí)卵泡。卵巢組織冷凍的效率取決于卵巢中原始卵泡的密度，通常適合卵巢組織凍存的患者年齡上限為35歲[4]。而對(duì)于已患有POI的患者，其卵巢中原始卵泡缺乏或不足，或者卵泡的過(guò)度耗竭，卵巢皮質(zhì)中卵泡密度低；同時(shí)，冷凍過(guò)程的冷凍損傷和組織移植后缺血再灌注損傷會(huì)損失掉部分卵泡，這些因素均會(huì)影響該生育力保存技術(shù)的應(yīng)用效果。盡管如此，卵巢組織冷凍是面臨POI高風(fēng)險(xiǎn)的青春期前女性和放化療無(wú)法延遲的女性進(jìn)行生育力保存的唯一選擇[5-6]。

近十幾年來(lái)，卵巢組織冷凍在女性生育力保存的臨床實(shí)踐中發(fā)揮了重要作用。卵巢組織冷凍的一個(gè)關(guān)注點(diǎn)是關(guān)于解凍后卵巢組織移植有重新植入腫瘤細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)，但目前尚未見(jiàn)卵巢組織移植引起腫瘤復(fù)發(fā)的報(bào)道[7]。

通過(guò)卵巢組織冷凍保存生育力，越年輕的患者越可保留更多的原始卵泡，也就意味著更高的成功率。研究發(fā)現(xiàn)，18例21歲之前冷凍卵巢組織并解凍移植回體內(nèi)的患者中，有10例獲得活產(chǎn)分娩[8]。一項(xiàng)涵蓋19個(gè)研究、309例卵巢組織移植結(jié)局的薈萃分析顯示，自體卵巢組織移植后的累積臨床妊娠率可達(dá)57.5%，內(nèi)分泌功能恢復(fù)率可達(dá)63.9%[9]。我國(guó)也獲得了首例自體卵巢組織移植后的成功妊娠和分娩[10]。

2 新技術(shù)手段的探索應(yīng)用

除了低溫生物保存技術(shù)的臨床應(yīng)用外，為了解決卵巢組織保存和使用過(guò)程的安全性及卵巢組織利用的有效性問(wèn)題，除了對(duì)未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)和原始卵泡體外培養(yǎng)的探索，研究者還進(jìn)行了類(lèi)器官、人工卵巢[11-13]、干細(xì)胞的體外分化的相關(guān)研究[14-17]，但尚未見(jiàn)臨床應(yīng)用的報(bào)道。

2.1 類(lèi)器官與人工卵巢 部分疾病對(duì)卵巢組織的侵襲具有不確定性，尚無(wú)有效評(píng)估微小殘留病(minimal residual disease,MRD)的方法，無(wú)法保證卵巢組織自體移植的安全性[18-19]。有研究人員提出將卵泡從組織中分離并構(gòu)建具有一定生理功能的類(lèi)器官，促使原始卵泡體外成熟[20]，以及分離原始卵泡并與基質(zhì)細(xì)胞一同轉(zhuǎn)移至三維支架內(nèi)，構(gòu)建用于自體移植的人工卵巢[21]。此類(lèi)研究是通過(guò)完全分離卵泡避免微小殘留灶來(lái)保護(hù)患者健康，就需要再造一個(gè)類(lèi)似于自然人類(lèi)卵巢的環(huán)境[22]。越來(lái)越多的研究聚焦于人工卵巢支架材料的選擇與形態(tài)的構(gòu)建，包括脫細(xì)胞的細(xì)胞外組織基質(zhì)、多糖水凝膠、海藻酸鹽、纖維蛋白等[23-24]，進(jìn)一步從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物功能和發(fā)育調(diào)控的角度改進(jìn)包埋卵泡的培養(yǎng)環(huán)境[25]。

得益于3D打印技術(shù)的應(yīng)用與人工卵巢的探索實(shí)踐，分離的原始卵泡、髓質(zhì)中的內(nèi)皮細(xì)胞、卵巢間質(zhì)細(xì)胞和各類(lèi)組織支架可以直接構(gòu)建成用于移植的人工器官，或用于卵泡體外成熟的類(lèi)器官，這能有效避免MRD的發(fā)生[22]。

2.2 未成熟卵母細(xì)胞體外成熟與干細(xì)胞體外分化 對(duì)于卵巢組織或原始卵泡的體外培養(yǎng)，目前較多的研究通過(guò)改良類(lèi)器官培養(yǎng)環(huán)境從而獲得直徑更大的卵母細(xì)胞[26]，通過(guò)向未成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中添加顆粒細(xì)胞、細(xì)胞因子、激素或其他改良成分，提升卵母細(xì)胞體外成熟效果[27]。

卵巢組織中含有豐富的卵原干細(xì)胞，是獲取卵細(xì)胞的另一重要途徑[14,28]。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESC)和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS)為生育力保存提供了新的方式，誘導(dǎo)產(chǎn)生的原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞不僅可用于體外成熟培養(yǎng)，也可用于人工卵巢的構(gòu)建[29]。此外，也有學(xué)者對(duì)組織內(nèi)殘存的內(nèi)源性干細(xì)胞進(jìn)行直接誘導(dǎo)，有望幫助患者重獲生育能力[30]。

3 不同原因的卵巢功能不全生育力保存的策略

3.1 原發(fā)性卵巢功能不全 原發(fā)性卵巢功能不全主要是遺傳性因素和免疫性因素導(dǎo)致的卵巢功能不全。遺傳學(xué)上的異常是POI發(fā)生的重要原因之一，遺傳性因素包括染色體異常、基因異常，Turner綜合征(Turner syndrome,TS)包括45，XO/46，XX嵌合型是患者POI發(fā)生的常見(jiàn)遺傳性因素。

3.1.1 胚胎冷凍或卵母細(xì)胞冷凍為首選 卵母細(xì)胞冷凍和胚胎冷凍的基礎(chǔ)是獲得可利用卵母細(xì)胞，染色體異常的POI患者，如45，XO完全基因型的卵巢發(fā)育不全，卵巢內(nèi)原始卵泡儲(chǔ)備通常在青春期到來(lái)前就已經(jīng)耗竭，成功的妊娠往往依賴(lài)于卵母細(xì)胞捐贈(zèng)。盡管如此，仍有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，對(duì)于核型為45，XO的患者，進(jìn)行促排卵后仍可獲得一定數(shù)量的卵母細(xì)胞[31]。而對(duì)于45,XO/46,XX嵌合體核型的患者，雖然卵巢功能不全的發(fā)生是必然的，但仍有機(jī)會(huì)獲得自己的遺傳學(xué)后代。根據(jù)嵌合程度，卵巢耗竭速度會(huì)有差別，但多數(shù)患者可有月經(jīng)初潮，成年后仍有一定數(shù)量的卵泡儲(chǔ)備。對(duì)于這些女性來(lái)說(shuō)，盡可能早地進(jìn)行生育力保存至關(guān)重要。

促排卵進(jìn)行卵母細(xì)胞冷凍是TS患者生育力保存的最佳方式。陳子江團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析955例POI患者的臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在找到卵巢的情況下，有38.36%的患者可發(fā)現(xiàn)卵泡[32]。Oktay等為年齡在13～15歲，青春期后的TS嵌合型女孩成功進(jìn)行了卵母細(xì)胞冷凍[33]。對(duì)于青春期女孩，由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能尚未完全成熟，在促排卵方案方面應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

盡管TS患者可冷凍一定數(shù)量的卵母細(xì)胞，但尚無(wú)成功率的報(bào)道，其生育力保存的效率尚不確定[34]。由于TS患者特殊的基因型，其產(chǎn)生正常卵母細(xì)胞的機(jī)率仍然堪憂(yōu)，部分卵母細(xì)胞缺乏X染色體，由此可能帶來(lái)一定的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，需配合使用胚胎種植前的遺傳學(xué)篩查技術(shù)，以保證生育健康后代。

對(duì)于未發(fā)現(xiàn)明顯的染色體或基因異常的POI，適時(shí)進(jìn)行卵母細(xì)胞冷凍也是首選的生育力保存方式；如果是已婚女性，首選IVF-ET作為及時(shí)生育的策略，具體應(yīng)根據(jù)需求進(jìn)行必要的生育力保存。

盡管卵巢儲(chǔ)備不足，POI患者仍有獲得自己遺傳學(xué)后代的機(jī)會(huì)，但無(wú)論哪種原因?qū)е碌腜OI，及時(shí)有效地獲取卵母細(xì)胞至關(guān)重要，年齡始終是影響卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量方面的關(guān)鍵因素。

未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟并冷凍保存也是POI患者生育力保存的方式之一，目前主張未成熟卵母細(xì)胞體外成熟后再行冷凍保存，以盡可能地提高卵母細(xì)胞利用率。未成熟卵母細(xì)胞的來(lái)源主要是卵巢組織冷凍過(guò)程中收集的卵母細(xì)胞，也有未成熟卵泡穿刺獲取的卵母細(xì)胞。這些衍生技術(shù)可為POI患者的生育力保存提供更多的機(jī)會(huì)。

3.1.2 卵巢組織冷凍為應(yīng)急方案 原發(fā)性卵巢功能不全患者卵巢中卵泡儲(chǔ)備不足，卵巢組織冷凍需切除盡可能多的組織進(jìn)行冷凍保存，通常會(huì)切除一側(cè)的卵巢，以備將來(lái)使用。雖然目前卵巢組織冷凍再移植已有至少130例出生嬰兒的報(bào)道[35]，但對(duì)于TS患者，目前尚缺乏卵巢組織冷凍有效性的證據(jù)。盡管如此，對(duì)于完全型TS患者，由于其卵泡耗竭發(fā)生在生命周期的前幾年，因此，卵巢組織冷凍是她們唯一的選擇。研究發(fā)現(xiàn)，兒童期的卵巢組織冷凍并不影響卵巢移植后功能的發(fā)揮。無(wú)論哪種類(lèi)型的POI高風(fēng)險(xiǎn)人群，年齡是影響卵巢組織冷凍效率的關(guān)鍵因素。

POI患者卵巢組織冷凍除了可以用于將來(lái)的移植，也可以進(jìn)行卵泡體外激活(in-vitro activation,IVA)。2013年，Kawamura與Hsueh研究團(tuán)隊(duì)利用IVA技術(shù)，將POI患者的卵巢組織在體外切割成小塊，通過(guò)破壞Hippo信號(hào)通路與激活A(yù)kt信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)卵泡體外激活，首次報(bào)道1例POI患者妊娠分娩[36]。IVA的效果是基于POI患者卵巢內(nèi)所存留原始卵泡數(shù)量，因此術(shù)前應(yīng)充分評(píng)估POI患者可能的原始卵泡數(shù)量。

對(duì)于POI患者的生育力保存，卵巢組織冷凍仍處于實(shí)驗(yàn)階段，但其是目前青春期前患者的唯一選擇。

3.2 繼發(fā)性卵巢功能不全 繼發(fā)性卵巢功能不全多為醫(yī)源性因素導(dǎo)致，常見(jiàn)包括手術(shù)、化療和放療[37]。手術(shù)創(chuàng)傷可直接對(duì)卵巢功能造成損害，盆腔放療對(duì)卵巢組織有致命性損傷，骨髓移植前的大劑量全身放化療可直接導(dǎo)致卵巢功能的衰竭。任何劑量的卵巢放療和≥8000mg/m2有效環(huán)磷酰胺當(dāng)量劑量的化療都是POI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[38]。隨著乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)病年齡的提前，治愈率的升高，生存期的延長(zhǎng)，越來(lái)越多的腫瘤康復(fù)患者成為POI的主要人群，癌癥治療前為患者提供生育力保存的咨詢(xún)服務(wù)已日漸成為國(guó)內(nèi)外腫瘤治療的共識(shí)。

3.2.1 促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑的應(yīng)用 近年來(lái)，促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(gonadotropin-releasing hormone agonists,GnRHa)在腫瘤化療過(guò)程中被廣泛應(yīng)用，但由于其保護(hù)卵巢功能的作用尚缺乏充足的證據(jù)，一直備受爭(zhēng)議[39]。對(duì)于早期乳腺癌患者，化療期間使用GnRHa對(duì)降低POI發(fā)生率、提高絕經(jīng)前女性的受孕率是安全有效的[40]。

3.2.2 緊急促排卵行卵母細(xì)胞冷凍或胚胎冷凍 通過(guò)輔助生殖技術(shù)實(shí)施緊急促排卵以便在手術(shù)、化療及放療前獲得盡可能多的卵母細(xì)胞進(jìn)行生育力保存，適用于青春期后且相應(yīng)治療可被延遲2～3周左右的患者。

緊急促排卵的患者基本都是惡性腫瘤準(zhǔn)備放化療的患者，她們與單純不孕患者有很大不同，由于腫瘤會(huì)影響全身多種組織，可能誘發(fā)在促排卵過(guò)程中的各種并發(fā)癥，還要考慮減少時(shí)間的約束，因此確定腫瘤患者的促排卵方案和用藥劑量更需個(gè)性化的評(píng)估。

3.2.3 卵巢組織冷凍是最后防線(xiàn) 針對(duì)不適合冷凍胚胎和卵母細(xì)胞進(jìn)行生育力保存的患者，冷凍卵巢組織成為保存生育力的唯一希望，未成熟卵母細(xì)胞的獲取和體外培養(yǎng)可能成為無(wú)法獲取體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的補(bǔ)償辦法。原始卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)的完善和人工卵巢等新技術(shù)手段的探索，有望成為卵巢組織利用的新的重要途徑。因此，在面臨繼發(fā)性POI高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，通過(guò)綜合評(píng)估患者年齡、婚育狀況、腫瘤預(yù)后等影響因素，采用必要的生育力保存措施是預(yù)防POI不孕風(fēng)險(xiǎn)的有效途徑。卵巢功能不全患者的生育力保存，防大于治，從原發(fā)性POI到醫(yī)源性POI，如何通過(guò)優(yōu)生優(yōu)育降低遺傳因素的POI患者的出生，如何在發(fā)生醫(yī)源性POI之前，保護(hù)好卵巢功能，這是POI患者生育力保存的重要內(nèi)容。而一旦發(fā)生了POI，盡早獲取優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞及胚胎，是成功妊娠的關(guān)鍵，也是生育力保存的主要目的。輔助生殖技術(shù)的探索與發(fā)展，為POI患者生育力的保存提供了更多策略，為POI患者成功孕育子代提供了更多的機(jī)會(huì)和保障。