王先桂，姚玉霖，許華杰，鄭 艷，岳倩倩，余朝靜

（茅臺學(xué)院 實習(xí)實訓(xùn)教學(xué)中心，貴州 仁懷 564501）

黨參（Codonopsis pilosula），又名單枝黨、條黨或者蠻黨，是桔?？泣h參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）屬植物，是川黨參（Codonopsis tangshenOliv.）的生態(tài)型品種的干燥根，因產(chǎn)地貴州遵義道真縣洛龍鎮(zhèn)而得名洛黨參，是當(dāng)?shù)靥赜械闹兴幉?，有著較早的入藥歷史[1]。洛黨參的莖和葉都可以入藥或是食用，還可作食品添加劑或是飼料添加劑，能治療多種疾病，經(jīng)常食用洛黨參會對人體健康有益[2-3]，研究表明，洛黨參脂溶性成分有顯著的腦保護作用，具有有效成分極性低，內(nèi)部成分豐富且生物活性物質(zhì)占比多的特點[4]。洛黨參的應(yīng)用除了用于臨床保健治療或是在家庭菜品中作為食療；市面上還開始逐漸出現(xiàn)了“黨參飲料”“黨參晶”“黨參酒”“洛黨參茶”“洛黨參精品口服液”“洛黨參咀嚼片”等洛黨參保健食品[5-6]。洛黨參中主要含有苷類、糖類、甾醇等，其中黨參炔苷為聚乙炔類化合物，可以作為質(zhì)量評價的指標(biāo)。關(guān)于洛黨參的研究目前集中在栽培技術(shù)[7-9]、貯藏保鮮[10]、質(zhì)量評價[11-12]和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[13]上，有關(guān)洛黨參精深加工的研究報道還較少。

葡萄（Vitis viniferaL.）是我國重要的水果之一，果實汁多味美，含有大量對人體有益物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[14]，將葡萄與富含營養(yǎng)的原材料共同發(fā)酵制備的葡萄酒成品不僅具有其原材料的營養(yǎng)保健價值，又豐富了葡萄酒風(fēng)味，為葡萄酒種類創(chuàng)新鑒定了基石。王燕榮等[15]以釀酒葡萄、黑枸杞為發(fā)酵原料，制備黑枸杞干紅葡萄酒，并優(yōu)化了其發(fā)酵條件；張?zhí)煊拥萚16]利用人參、鹿胎等原料，以葡萄酒為酒基制備人參鹿胎葡萄酒，并篩選出最佳制備方法；于亞敏等[17]利用紫皮洋蔥和赤霞珠葡萄酒為原料，制備洋蔥葡萄酒。

本研究選用經(jīng)超臨界CO2萃取獲得的洛黨參萃取物與葡萄為主要原料，經(jīng)葡萄酒酵母（Saccharomyces uvarum）BV818發(fā)酵制備洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒，采用單因素試驗及正交試驗對其發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，并分析其理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)和揮發(fā)性風(fēng)味成分，以期賦予葡萄酒一定的藥用價值與獨特的參香，增加葡萄酒的飲用口感和保健價值，為貴州地方特色洛黨參復(fù)合發(fā)酵酒的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持，同時有利于提高洛黨參產(chǎn)業(yè)附加值，拓寬應(yīng)用途徑，助力鄉(xiāng)村振興。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

巨峰葡萄：山東巨峰葡萄購銷合作社；洛黨參：貴州省遵義市道真縣洛龍鎮(zhèn)；葡萄酒酵母（Saccharomyces uvarum）BV818：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

CO2（食品級）：遵義市望江氣體有限公司；葡萄糖、焦亞硫酸鉀（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（10萬U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；無水乙醇（分析純）：重慶萬盛川東化工有限公司；甲醇（色譜級）：上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SFE-2超臨界CO2萃取系統(tǒng)：美國ASI公司；7890B-5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographic-mass spectrometry，GC-MS）儀、7890B氣相色譜儀帶氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）、VF-WAXms毛細管色譜柱（60 m×250 μm×0.5 μm）：美國Agilent公司；AT.LZP-930毛細管色譜柱（18 m×0.53 mm×1.0 μm）：中科院蘭州化學(xué)物理研究所；PDMS/DVB固相微萃取頭（65 μm）：Supelco公司；ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FW400A高速萬能粉碎機：北京科偉永興儀器有限公司；WZS80手持糖度計：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 洛黨參萃取物的制備

以洛黨參為原料，經(jīng)粉碎至物料粒度為50目，利用SFE-2超臨界CO2萃取儀進行萃取，萃取條件為：壓強31MPa、溫度53 ℃、時間63 min，萃取完成后，得到洛黨參萃取物，備用。

1.3.2 洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒加工工藝流程及操

作要點

新鮮葡萄→挑選、除梗、破碎→添加焦亞硫酸鉀、果膠酶→成分調(diào)整→酵母活化、接種→主發(fā)酵→皮渣分離→下膠澄清后過濾除菌→洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒成品

葡萄預(yù)處理：挑選成熟新鮮且無腐爛、蟲蛀的葡萄經(jīng)除梗、手捻破碎至破皮狀態(tài)。

添加焦亞硫酸鉀、果膠酶：于破碎后的葡萄中添加120 mg/L的焦亞硫酸鉀進行處理。加入果膠酶30 mg/L進行酶解，25 ℃酶解30 min。

成分調(diào)整：采用葡萄糖調(diào)整初始糖度為25°Bx，添加洛黨參萃取物5 mg/100 mL。

酵母的活化、接種：將5 g活性干酵母添加到含5%葡萄糖的50 mL溫水中保持38 ℃活化20 min，按20 mg/100 mL接種至洛黨參萃取物-葡萄料液中。

主發(fā)酵：洛黨參萃取物-葡萄料液在28 ℃條件下發(fā)酵5～7 d至殘?zhí)腔静蛔?，主發(fā)酵結(jié)束。

皮渣分離：紗布過濾后自然沉淀，取上清液。

下膠澄清、過濾除菌：于上清液中添加蛋清粉，其添加量為100 mg/L，進行下膠澄清，澄清完成后經(jīng)0.25 μm濾膜過濾除菌，即得洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒。

1.3.3 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

（1）單因素試驗

固定基本發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間6 d，焦亞硫酸鉀添加量120 mg/L，酵母添加量20 mg/100 mL，果膠酶添加量30 mg/L，初始糖度25°Bx，洛黨參萃取物添加量5 mg/100 mL，分別考查初始糖度（16°Bx、19°Bx、22°Bx、25°Bx、28°Bx）、酵母添加量（20 mg/100 mL、25 mg/100 mL、30 mg/100 mL、35 mg/100 mL、40 mg/100 mL）、洛黨參萃取物添加量（2.0 mg/100 mL、3.5 mg/100 mL、5.0 mg/100 mL、6.5 mg/100 mL、8.0 mg/100 mL）和發(fā)酵時間（0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）4個因素對洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒感官評分、酒精度的影響。

（2）正交試驗設(shè)計[18]

根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果綜合考慮，最終確定初始糖度（A）、酵母添加量（B）、洛黨參萃取物添加量（C）3個影響因素，建立3因素3水平的正交試驗，優(yōu)化洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒發(fā)酵條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design for fermentation conditions optimization

1.3.4 分析檢測

發(fā)酵醪液糖度的測定：采用WZS80手持糖度計；還原糖、總糖、總酸的測定：參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]。酒精度采用乙醇含量計算。

乙醇含量的測定：采用氣相色譜儀。

氣相色譜條件：AT.LZP-930毛細管色譜柱（18 m×530 μm×1.0 μm）；載氣為高純氮氣（N2，14 mL/min），燃氣（H2，40 mL/min），助燃氣（空氣，400 mL/min）；進樣口溫度200 ℃，分流比10∶1；色譜柱流量1 mL/min；升溫程序為35 ℃保持8 min，以8 ℃/min升溫至120 ℃，再以12 ℃/min升溫至200 ℃保持2 min，運行時間共27.3 min；FID檢測器溫度為250 ℃[20]。

定性定量方法：保留時間定性，外標(biāo)法定量（以乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y=67.80X-415.26，相關(guān)系數(shù)R2為0.9985），代入回歸方程計算乙醇含量。

1.3.5 洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒揮發(fā)性成分分析

采用頂空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）法[21]結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定揮發(fā)性風(fēng)味成分。

HS-SPME條件：所用固相微萃取頭為PDMS/DVB（65 μm）。樣品量為10 mL，加NaCl 3 g，于40 ℃萃取40 min。

氣相色譜條件：VF-WAXms毛細管色譜柱（60 m×250 μm×0.5 μm）；進樣口溫度220 ℃，不分流進樣；載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；升溫程序為50 ℃保持2 min，6 ℃/min升溫至180℃，再以8 ℃/min升溫至240 ℃保持25 min，運行時間共56.2 min[22]。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS四級桿溫度150 ℃，掃描方式為SCAN，質(zhì)量掃描范圍33～350 m/z。

定性定量方法：各組分通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（nationalinstituteofstandardsandtechnology，NIST）MSSearch 2.2解譜分析進行定性，積分峰面積確定相對含量。

1.3.6 洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒的感官評價

參考GB/T 15037—2006《葡萄酒》[23]的感官要求建立洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)，分別從外觀、香氣、口感3個方面對復(fù)合發(fā)酵酒進行感官評價，滿分為100分，由5名專業(yè)葡萄酒品評人員按照評分標(biāo)準(zhǔn)對復(fù)合發(fā)酵酒進行感官品評并打分。洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory score standards of Luolong Codonopsis pilosula extracts-grape compound fermented wine

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

運用軟件IBM SPSS Statistics 25.0進行正交試驗設(shè)計，采用Origin2021軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化的單因素試驗

2.1.1 初始糖度的確定

初始糖度對洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 初始糖度對復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of compound fermented wine

由圖1可知，隨著發(fā)酵醪液初始糖度在16°Bx～28°Bx范圍內(nèi)升高，洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒酒精度逐漸升高；隨著發(fā)酵醪液初始糖度在16°Bx～25°Bx范圍內(nèi)升高，感官評分逐漸升高；當(dāng)初始糖度＞25°Bx，感官評分逐漸平穩(wěn)；初始糖度為25°Bx時，感官評分為94.6分，酒精度約為12.5%vol，酒體清澈透明、酒色純正、入口飽滿利口，感官評價良好。綜合考慮，確定最佳的初始糖度為25°Bx。

2.1.2 酵母添加量的確定

酵母添加量對洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 酵母添加量對復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effects of yeast addition on the quality of compound fermented wine

由圖2可知，隨著酵母添加量在20～30 mg/100 mL的增加，酒精度與感官評分逐漸增加；酵母添加量為30mg/100mL時，酒精度及感官評分均最高，分別為12.8%vol、95.5分；酵母添加量＞30 mg/100 mL，酒精度及感官評分逐漸下降，可能是過多的酵母接種量不利于發(fā)酵的正常進行。綜合考慮，確定最佳的酵母添加量為30 mg/100 mL。

2.1.3 洛黨參萃取物添加量的確定

洛黨參萃取物添加量對洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 洛黨參萃取物添加量對復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of Luolong Codonopsis pilosula extracts addition on the quality of compound fermented wine

由圖3可知，洛黨參萃取物添加量在2～5 mg/100 mL范圍內(nèi)的增加，酒精度及感官評分均逐漸增加；洛黨參萃取物添加量為5 mg/100 mL時，酒精度及感官評分均最高，分別為11.8%vol、94.3分；洛黨參萃取物添加量＞5 mg/100 mL時，酒精度下降、感官評分降低，其原因可能是，洛黨參萃取物對酵母產(chǎn)生了一定的抑制作用，洛黨參萃取物添加量過多導(dǎo)致參香比例升高，從而影響酒體綜合感官品質(zhì)。綜合考慮，確定最佳的洛黨參萃取物添加量為5 mg/100 mL。

2.1.4 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of compound fermented wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間在1～5 d范圍內(nèi)的增加，感官評分及酒精度均逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵時間為5 d時，酒精度為13.7%vol，感官評分為95.6分；當(dāng)發(fā)酵時間＞5 d，感官評分逐漸平穩(wěn)，但酒精度仍然呈上升趨勢。在第5天時，已達到酒體綜合較好狀態(tài)，繼續(xù)發(fā)酵導(dǎo)致酒精度繼續(xù)增加會對酵母逐漸產(chǎn)生抑制作用。綜合考慮，確定最佳的發(fā)酵時間為5 d。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

固定發(fā)酵時間為5 d，選擇初始糖度（A）、酵母添加量（B）、洛黨參萃取物添加量（C）3個因素，以洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒感官評分為評價指標(biāo)，進行正交試驗設(shè)計，正交試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

由表3可知，3個因素對洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒感官評分影響的主次順序為A＞B＞C，即初始糖度＞酵母添加量＞洛黨參萃取物添加量，獲得發(fā)酵工藝條件的最佳方案組合為A2B2C2，即初始糖度25 °Bx、酵母添加量30 mg/100 mL、洛黨參萃取物添加量5.0 mg/100 mL，該工藝方案組合并未出現(xiàn)在正交試驗設(shè)計方案中，需要對此方案進行驗證試驗。通過3次平行驗證試驗，在該優(yōu)化工藝條件下得到的洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒酒精度為12.8%vol，感官評分為96.1分。表明該方案符合優(yōu)化結(jié)果，達到洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒工藝優(yōu)化的目的。

由表4可知，由P值可知，初始糖度對復(fù)合發(fā)酵酒感官評分影響顯著（P＜0.05），酵母添加量和洛黨參萃取物添加量的影響不顯著（P＞0.05），由F值可知，各因素對洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒的感官評分影響次序分別為初始糖度＞酵母添加量＞洛黨參萃取物添加量。

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒品質(zhì)分析

2.3.1 洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒理化指標(biāo)分析

洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒中理化指標(biāo)檢測結(jié)果見表5。由表5可知，洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒黨參炔苷含量1.24 mg/L；酒精度為12.8%vol；甲醇含量9.08 mg/L，遠低于安全限量值400 mg/L；總糖含量31.83 g/L，說明屬于半甜葡萄酒；還原糖（以葡萄糖計）25.78 g/L，還原糖和總糖含量較高柔和了發(fā)酵酒整體的口感；總酸含量（以酒石酸計）5.26 g/L，說明洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒的酸度合適，口感上較為容易接受；沙門氏菌和金黃色葡萄球菌皆未檢出。洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)符合GB 15037—2006《葡萄酒》和GB 2758—2012《發(fā)酵酒及其配制酒》[24]的要求。

表5 復(fù)合發(fā)酵酒理化及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果Table 5 Determination results of physicochemical and microbiological indexes of compound fermented wine

2.3.2 洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒揮發(fā)性成分分析

洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒樣品揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果見表6。由表6可知，洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒共鑒定出16種化合物，其中醇類8種，酯類4種，醛類2種，酸類1種，酮類1種。由其相對含量可以看出，復(fù)合發(fā)酵酒中醇類化合物相對含量為94.43%，占主要地位；其次為酯類化合物，相對含量為3.17%；醛類、酸類和酮類化合物的相對含量共為2.4%。由此可知，復(fù)合發(fā)酵酒的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于醇類，酸類、酯類、醛類、酮類化合物為輔，乙酸乙酯相對含量較高，其輔以酒體清新的青草香氣[25]，與其他微量成分共同構(gòu)成較為協(xié)調(diào)的酒體風(fēng)格。

3 結(jié)論

以葡萄與洛黨參萃取物為主要原料經(jīng)過發(fā)酵制備洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒，通過單因素試驗及正交試驗確定最佳發(fā)酵工藝條件為初始糖度25°Bx、酵母添加量30 mg/100 mL、洛黨參萃取物添加量5 mg/100 mL，在此優(yōu)化條件下，洛黨參萃取物-葡萄復(fù)合發(fā)酵酒理化和微生物指標(biāo)復(fù)合相關(guān)國標(biāo)要求要求，感官評分為96.1分，酒精度為12.8%vol，酒體清澈透明無雜物、香味清新略帶梨香和草本植物香味、入口豐甜、回味較長的半甜葡萄酒。

在鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略時代背景下，以提高農(nóng)產(chǎn)品附加值為目標(biāo)的食品研發(fā)是一條值得探索的道路，該研究可為貴州道真特色中藥材洛黨參的應(yīng)用尋找一個新的方向，為提高農(nóng)產(chǎn)品附加值提供基礎(chǔ)依據(jù)與技術(shù)支持。