張 娟,綦 艷,嚴(yán)家俊,楊純佳,佘之蘊(yùn),周臣清
(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,廣東 佛山 510670)
生物安全問題是影響世界公共衛(wèi)生安全的主要問題之一。近年來,寄生蟲、病毒、細(xì)菌等生物危害不僅嚴(yán)重影響著人類的身體健康和正常生活,也阻礙了我國畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)的有序發(fā)展。因此,如何做到對(duì)這些生物危害更為快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)成為當(dāng)務(wù)之急。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,各種新技術(shù)層出不窮,等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)作為一種新型的檢測(cè)技術(shù),與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)技術(shù)相比,憑借其恒溫?cái)U(kuò)增、操作簡便、降低成本、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[1]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)技術(shù)和重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(recombinase-aid amplification,RAA)技術(shù)是目前發(fā)展比較成熟的3種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),其中,RAA技術(shù)是目前唯一可能研究出體內(nèi)核酸擴(kuò)增技術(shù)的后備技術(shù)[2]。本文重點(diǎn)闡述了RAA技術(shù)在寄生蟲、病毒、細(xì)菌、動(dòng)物源性成分、植物病原等生物安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用,并對(duì)其未來發(fā)展前景予以展望,以期為RAA技術(shù)的應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù)。
RAA技術(shù)是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法,它的顯著特點(diǎn)在于可實(shí)現(xiàn)常溫下的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)解鏈和擴(kuò)增,且可用于定時(shí)定量分析[2-3](見圖1)。和傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,該技術(shù)無疑是一種升級(jí)換代的體外核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。除此之外,還有一種常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)—RPA,兩者的主要差別在于前者的重組酶是從細(xì)菌或真菌中獲得的,而后者是較難獲得的噬菌體重組酶[4]。RAA技術(shù)是我國自主研發(fā)的新型檢測(cè)技術(shù),相對(duì)RPA來說,其重組酶來源相對(duì)廣泛,完全滿足我國快速檢測(cè)的需求。RAA技術(shù)憑借其反應(yīng)迅速、靈敏度高、操作簡便等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),吸引了眾多生物學(xué)者的關(guān)注。傳統(tǒng)RAA技術(shù)的結(jié)果判斷需要通過凝膠電泳,隨著檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展,RAA通過與其他檢測(cè)方法相結(jié)合衍生出眾多新的檢測(cè)技術(shù),例如實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(real time-recombinase-aid amplification,real time-RAA)、重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增側(cè)向流試紙檢測(cè)(recombinase-aidamplification-lateralflowdipstic,RAA-LFD)、RAA微流控芯片檢測(cè)等,已廣泛應(yīng)用于診斷、醫(yī)療、食品安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域,體現(xiàn)出了極大的應(yīng)用價(jià)值。
圖1 重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增法的原理示意圖Fig.1 Principle schematic diagram of recombinase-mediated amplification
RAA檢測(cè)技術(shù)憑借其自身的優(yōu)勢(shì),逐漸開始應(yīng)用于寄生蟲病的檢測(cè),成為推進(jìn)寄生蟲病防控和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的重要手段。丁昕等[5]建立了一種快速、靈敏、特異檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲的熒光RAA法,最低可檢測(cè)質(zhì)粒DNA 10拷貝/μL和0.1 ng/μL基因組DNA。同樣是針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲的RAA檢測(cè)方法,周鴻讓等[6]建立針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲G1的RAA檢測(cè)技術(shù),最低可檢測(cè)量為200 fg/μL,最低檢出質(zhì)??截悢?shù)為200拷貝/μL,可望用于該蟲種的鑒定以及棘球蚴病基因診斷。上述相同的檢測(cè)方法和研究對(duì)象,檢測(cè)靈敏度雖有所不同,但均展現(xiàn)出較高的靈敏度。此外,周鴻讓研究團(tuán)隊(duì)還分別建立了基于RAA技術(shù)和雙重RAA技術(shù)的多房棘球絳蟲的檢測(cè)方法,為多房棘球絳蟲鑒定與棘球蚴病診斷提供技術(shù)支撐[7-8]。張學(xué)勇等[9]則建立了RAA多重核酸檢測(cè)技術(shù),用于多房棘球絳蟲、細(xì)粒棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲的快速鑒定,基因組DNA的最低檢測(cè)限分別為2.0 pg/μL、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,為棘球蚴病病原檢測(cè)和疫病監(jiān)測(cè)提供了一種新的檢測(cè)工具。張強(qiáng)等[10]建立了一種可用于廣州管圓線蟲核酸檢測(cè)的熒光RAA法,該法最低檢出限分別為10拷貝/μL重組質(zhì)粒和100 pg/μL基因組DNA,具有較好的敏感性和特異性。同時(shí),該團(tuán)隊(duì)利用同樣的方法檢測(cè)華支睪吸蟲,重組質(zhì)粒的最低檢出限為10拷貝/μL,基因組DNA最低檢出限為3 pg/μL[11]。鄭偉等[12]建立了可檢測(cè)瘧疾的快速檢測(cè)方法,可對(duì)100個(gè)拷貝的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,并具有較好的特異性。針對(duì)血吸蟲病,眾多學(xué)者利用該技術(shù)在血吸蟲的檢測(cè)方面做出了較多研究成果。趙松等[13-14]建立了一種可用于檢測(cè)日本血吸蟲特異性基因片段的RAA方法,可特異性擴(kuò)增成蟲及蟲卵基因組DNA,最低可檢出的質(zhì)粒拷貝數(shù)為20個(gè)/μL,具有應(yīng)用于日本血吸蟲病基因診斷的價(jià)值。隨后,該研究團(tuán)隊(duì)又建立了可檢測(cè)日本血吸蟲核酸片段的實(shí)時(shí)熒光RAA方法,在5 min時(shí)即可觀察到明顯的熒光信號(hào),不同拷貝數(shù)的擴(kuò)增均可在10 min內(nèi)完成,最低可檢出的質(zhì)粒濃度為10拷貝/μL。此外,該團(tuán)隊(duì)還基于該方法建立了曼氏血吸蟲的檢測(cè)技術(shù),最低可檢出質(zhì)??截悢?shù)為10拷貝/μL和0.1 fg/μL[15]。董萱等[16]前期建立的RAA方法能辨別出包括早期感染在內(nèi)的血吸蟲感染性釘螺,檢測(cè)結(jié)果一致性高、重復(fù)性好,可用于日本血吸蟲感染性釘螺的早期檢測(cè)。此外,該研究團(tuán)隊(duì)基于熒光RAA法最低可檢測(cè)出100只陰性釘螺中混有1只感染性釘螺[17],同時(shí)也對(duì)該方法檢測(cè)日本血吸蟲感染性釘螺的效能進(jìn)行評(píng)價(jià),證明該方法具有良好檢測(cè)效能,在日本血吸蟲感染性釘螺篩查中具有一定應(yīng)用前景[18]。針對(duì)生活飲用水中比較受關(guān)注的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲,有學(xué)者也基于上述方法做了相關(guān)研究。倪碧嫻等[19-20]分別建立了可檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的熒光RAA方法,其中藍(lán)氏賈第鞭毛蟲以重組質(zhì)粒和基因組DNA為模板,檢測(cè)敏感性可達(dá)102拷貝/μL和1 pg/μL;隱孢子蟲對(duì)重組質(zhì)粒、不同濃度隱孢子蟲卵囊基因組DNA和不同數(shù)量隱孢子蟲卵囊基因組DNA的最低檢出限分別為102拷貝/μL、1 pg/μL和1個(gè)/50 μL。兩者的檢測(cè)靈敏度高且一致,特異性強(qiáng),檢測(cè)過程中無交叉反應(yīng),相比現(xiàn)有的檢測(cè)方法,適用性更強(qiáng)。
針對(duì)目前口岸傳染病巡查手段局限,主要靠測(cè)溫儀發(fā)現(xiàn)發(fā)熱病人,而引起發(fā)熱癥狀的傳染病涵蓋廣泛,主要包括蟲媒傳染病和呼吸道傳播疾病。目前對(duì)該類病毒感染的確診主要基于核酸檢測(cè),RAA技術(shù)依靠自身優(yōu)勢(shì)在輸入性傳染病排查方面顯示出明顯的優(yōu)越性。鄭偉等[21]基于RAA技術(shù)建立了黃熱病毒的口岸快速檢測(cè)方法,檢測(cè)下限可達(dá)100 copy,與登革熱病毒、西尼羅病毒等蚊媒病毒無交叉反應(yīng)。此外,針對(duì)該類蟲媒病毒,李樊等[22]采用反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增(reverse translation-recombinase-aid amplification,RT-RAA)法建立了塔希納病毒檢測(cè)方法,質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下線為100拷貝/反應(yīng),病毒培養(yǎng)物最低檢出限為10空斑形成單位/反應(yīng)。呂沁風(fēng)等[23]則建立了西尼羅病毒的RT-RAA檢測(cè)方法,檢測(cè)限可達(dá)10 copies,與其他蚊媒病毒無交叉反應(yīng)。張勤等[24]基于RT-RAA技術(shù)建立了日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)分型鑒定方法,檢測(cè)靈敏度可達(dá)100拷貝/μL,其中JEV I的靈敏度可達(dá)10拷貝/μL,適用于口岸現(xiàn)場(chǎng)JEV的快速檢測(cè)。此外,該團(tuán)隊(duì)還建立了快速鑒定登革病毒血清型的方法,檢測(cè)的靈敏度可達(dá)102copies/μL,為確定登革病毒分子流行病學(xué)趨勢(shì)提供技術(shù)支持[25]。針對(duì)新冠病毒的爆發(fā),研究學(xué)者也做出快速反應(yīng)。XUE G H等[26]建立了該病毒的RT-RAA快速檢測(cè)方法,檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)PCR結(jié)果一致,為該病毒的檢測(cè)提供了一種簡單可靠的方法。ZHENG Y Z等[27]建立了新冠病毒的反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條(RT-RAALFD)檢測(cè)方法,該方法檢出限達(dá)1 copy/μL,在檢測(cè)臨床樣本時(shí),與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果保持高度一致的特異性和靈敏度。趙凱穎等[28]為建立非洲豬瘟病毒簡便且高效的基層臨床檢測(cè)方法,基于RAA技術(shù)建立了與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des épizooties,OIE)推薦的熒光定量PCR方法靈敏度相當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法,靈敏度可達(dá)10 copies/μL。徐超等[29]建立了檢測(cè)鴨瘟病毒的普通和熒光RAA方法,其靈敏度分別為100 copies/μL和10 copies/μL,檢測(cè)結(jié)果與商業(yè)化PCR試劑盒的符合率為100%。趙康辰等[30]建立了H7N9禽流感病毒的反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增(RT-RAA)技術(shù),H7反應(yīng)體系和N9反應(yīng)體系的最低檢出限分別為10 copy/μL和100 copy/μL,為該病毒快速檢測(cè)提供了新的分子工具。陳淑丹等[31]采用反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)建立檢測(cè)人鼻病毒的快速方法,最低擴(kuò)增拷貝數(shù)為100拷貝。該研究團(tuán)隊(duì)同樣利用該技術(shù)建立了禽流感病毒H5N1的快速檢測(cè)方法,對(duì)質(zhì)粒檢測(cè)靈敏度可達(dá)10拷貝[32]。
RAA技術(shù)由于彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)和依賴溫變?cè)O(shè)備技術(shù)的不足,能在現(xiàn)場(chǎng)和非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行即時(shí)檢測(cè),所以進(jìn)一步奠定了其在細(xì)菌檢測(cè)這方面的應(yīng)用前景。首先,在食源性致病菌的檢測(cè)方面展現(xiàn)了巨大的潛力。方微微等[33]基于RAA技術(shù)建立了快速、靈敏、特異檢測(cè)哈維弧菌的方法,檢測(cè)細(xì)菌純培養(yǎng)物的最低檢測(cè)濃度為7.55×10-1copies/μL,且與其他食源性致病菌無交叉反應(yīng)。郝林慧等[34]建立了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的RAA快速檢測(cè)方法,檢出限為5.3 CFU/mL,與其他弧菌屬菌種不存在交叉反應(yīng),和傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)果高度一致。同樣是對(duì)于副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的檢測(cè),孫曉紅等[35]則將RAA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條結(jié)合,建立可準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的方法,靈敏度比常規(guī)PCR高出十倍數(shù)量級(jí),細(xì)菌純培養(yǎng)物最低檢測(cè)限可達(dá)1.89×10 copies/μL。同樣基于RAA與側(cè)流層析試紙條結(jié)合技術(shù),后來旺等[36]則建立了金黃色葡萄球菌(Staphy-lococcus aureus)的可視化快速檢測(cè)方法,檢出限分別為4 fg/μL DNA與183 CFU/mL純菌液,為牛奶中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的檢測(cè)提供新的發(fā)展方向。魏瑩等[37]利用RAA技術(shù)建立快速檢測(cè)A族乙型溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolytic-β)的方法,在39 ℃,20 min內(nèi)即可完成檢測(cè),靈敏度為10 拷貝/μL。張小平等[38]基于該技術(shù)建立了沙門氏菌(Salmonella)的快速檢測(cè)方法,檢測(cè)下限為102拷貝/μL,與大腸桿菌(Escherichia coli)、志賀氏菌(Shigella)無交叉反應(yīng),特異性良好。同樣是基于對(duì)沙門氏菌(Salmonella)的檢測(cè),周冬根等[39]建立的方法對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物的靈敏度為19 CFU/mL,對(duì)模擬樣品的靈敏度為190 CFU/mL,該方法在食源性疫情現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查以及監(jiān)測(cè)中將發(fā)揮重要作用。崔榮飛等[40]基于該技術(shù)建立了食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的快速檢測(cè)方法,最低可檢出的質(zhì)粒拷貝數(shù)為10拷貝/反應(yīng)。王金鳳等[41]建立了一種快速檢測(cè)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)方法,對(duì)基因組DNA的檢出限為3.0×103fg/μL,對(duì)純培養(yǎng)物的檢出限為1.0×103CFU/μL。成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein,CRISPR/Cas)系統(tǒng)是原核生物用來抵御外來遺傳物質(zhì)入侵的免疫防御系統(tǒng),現(xiàn)已被改造成一種高效的基因編輯工具[42]。葛以躍等[43]將該檢測(cè)系統(tǒng)與RAA技術(shù)相結(jié)合,建立了快速檢測(cè)副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的RAA-Cas13a檢測(cè)方法,靈敏度為10拷貝DNA分子/反應(yīng),與實(shí)時(shí)PCR對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果一致性較高。其次,在環(huán)境病原微生物的檢測(cè)方面也頗具競爭力。郭雨等[44]建立一種快速、靈敏檢測(cè)土壤沙門氏菌(Salmonella)的實(shí)時(shí)重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-RAA)方法,最低檢測(cè)質(zhì)??截悢?shù)為10拷貝/反應(yīng)。此外,朱立葦?shù)萚45]則采用該技術(shù)監(jiān)測(cè)血站采供血過程中的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和溶血性鏈球菌(Streptococcus pyogens),對(duì)兩種致病菌的最低檢出限均為102CFU/mL,檢測(cè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)-生化法相同,為血站采供血過程中致病菌的檢測(cè)提供一種快捷的檢測(cè)方法,提高了臨床用血安全。綜上所述,RAA技術(shù)可以替代PCR技術(shù)作為新型恒溫核酸檢測(cè)技術(shù)用于食源性致病菌檢測(cè)。
肉制品摻雜摻假是食品安全問題的一個(gè)重要方面,不僅侵犯了消費(fèi)者的權(quán)益,甚至?xí)绊懶竽翗I(yè)的健康發(fā)展和進(jìn)出口貿(mào)易的有序進(jìn)行。隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展,目前應(yīng)用于動(dòng)物源性成分檢測(cè)的主流技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光PCR。RAA作為一種新興的檢測(cè)技術(shù),憑借其自身的優(yōu)勢(shì)為肉源性成分的快速檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向。苗麗等[46]為了快速準(zhǔn)確檢測(cè)出肉制品中的雞源性成分,建立了實(shí)時(shí)熒光RAA方法,可穩(wěn)定檢出最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的雞源性成分,與豬肉、牛肉、羊肉均沒有交叉反應(yīng)。沈泓等[47]以水牛角鑒別為例建立中藥RAA快速鑒別方法,用于水牛角及其混偽品牦牛角的鑒別,在中藥現(xiàn)場(chǎng)鑒定、藥檢抽查等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。周新麗等[48]將離心式微流控芯片和RAA技術(shù)相結(jié)合,用于牛、羊、豬、鴨和雞源性成分的快速檢測(cè),檢出的最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、1.0%、0.1%、0.1%、1.0%,檢測(cè)的特異性良好,無交叉反應(yīng)。新方法的建立為有快速檢測(cè)需求的食品安全監(jiān)管部門提供了有效的技術(shù)支撐。
RAA技術(shù)在植物病原檢測(cè)方面開始嶄露頭角,尤其在農(nóng)作物病害田間早期診斷、種子病害以及貯藏期病害快速檢測(cè)等方面。玉米細(xì)菌性枯萎病菌是我國進(jìn)境植物檢疫性病原物之一,單長林等[49]基于熒光RAA技術(shù)建立了該病菌的快速檢測(cè)技術(shù),靈敏度達(dá)280 fg/μL,可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。新菠蘿灰粉蚧是我國進(jìn)境植物檢疫性害蟲,能傳播鳳梨凋萎病毒,唐慧驥等[50]利用RAA技術(shù)建立了該害蟲的快速鑒定方法,檢測(cè)DNA質(zhì)量濃度限值為1.6×103μg/mL,可大大提高一線口岸截獲粉蚧的鑒定效率。褐飛虱是亞洲稻區(qū)最嚴(yán)重的水稻害蟲之一,還可以傳播病毒,因此,準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)蟲情是防治的關(guān)鍵。羅舉等[51]建立了褐飛虱的RAA-LFD鑒定技術(shù)可用于其與近似種的快速區(qū)分,為植保領(lǐng)域的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供了新的契機(jī)。RAA技術(shù)的應(yīng)用研究成果見表1。
表1 重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增法的應(yīng)用研究成果Table 1 Application research results of the recombinase-mediated amplification
綜上所述,RAA技術(shù)在各研究領(lǐng)域的應(yīng)用都展現(xiàn)出較高的靈敏度。雖然對(duì)于相同的研究對(duì)象,不同的研究學(xué)者得出的靈敏度略有不同,但基本與現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)表現(xiàn)出較為一致的靈敏度。在保證較高靈敏度的前提下,RAA檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)將進(jìn)一步凸顯,為其更廣闊的發(fā)展領(lǐng)域奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
傳統(tǒng)PCR技術(shù)自研發(fā)之初,一直飽受儀器設(shè)備、人員能力、空間、電力等諸多因素的限制?;诖?,常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢(shì)顯而易見,其中RPA和RAA作為該技術(shù)的典型代表,主要區(qū)別在于重組酶的獲取來源不同。RPA技術(shù)已經(jīng)被英國TwistDx公司申請(qǐng)專利,基于該技術(shù)的相關(guān)研究都需要依托TwistDx研發(fā)的系列試劑盒[52]。RAA技術(shù)目前已經(jīng)在國內(nèi)申報(bào)了專利,技術(shù)的便攜性能充分?jǐn)U大核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域,使其有望在很大程度上突破傳統(tǒng)PCR技術(shù)的使用限制。RAA技術(shù)雖然還處于前期階段,但作為一種基礎(chǔ)的研究手段,取得的成績已不俗。RAA技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展促進(jìn)了分子生物學(xué)的研究,在未來有可能進(jìn)一步促進(jìn)功能基因組學(xué)和植物分子生物學(xué)獲得突破性進(jìn)展。同時(shí),隨著該技術(shù)的進(jìn)一步深化、完善,其檢測(cè)對(duì)象可以從核酸擴(kuò)大到蛋白質(zhì)、糖類及其他大分子化合物,并可能開發(fā)出系列快速診斷產(chǎn)品,定時(shí)定量檢測(cè)特定疾病。以RAA技術(shù)為基礎(chǔ)的各類核酸快速擴(kuò)增技術(shù)或產(chǎn)品,將為人類健康和動(dòng)植物疫病的防治提供及時(shí)的診斷。