王清龍，李海登，劉延波，李金紅，劉洪亮，王永華，韓素娜，潘春梅，*

（1.河南牧業(yè)經濟學院 理學部，河南 鄭州 450046；2.河南牧業(yè)經濟學院食品與生物工程學院（酒業(yè)學院），河南 鄭州 450046；3.河南牧業(yè)經濟學院 河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業(yè)經濟學院 鄭州市白酒釀造微生物技術重點實驗室，河南 鄭州 450046；5.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001；6.河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后科研工作站，河南 三門峽 472400；7.河南蔡洪坊酒業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463500）

濃香型白酒是中國傳統(tǒng)白酒的典型香型之一，在釀造上采用泥窖、固態(tài)、雙邊、多微發(fā)酵[1-2]；釀造過程中涉及到的微生物主要來源于大曲和窖泥，大曲一種自然積溫轉化并風干而成的多酶多菌多物質的微生物生態(tài)制品，具有糖化發(fā)酵生香的作用[3]；大曲在制作上采用自然接種和開放式發(fā)酵，使其充分網羅制曲環(huán)境中的各種微生物，主要有細菌和真菌[4]；細菌是白酒釀造過程中一類重要的微生物[5]，是大曲中產蛋白酶和香味物質的重要菌類，對后續(xù)發(fā)酵和風味成型均具有重要影響；真菌能夠產酒、產酶、產香[6]，其中霉菌為大曲提供糖化力、液化力、蛋白質分解能力以及多種有機酸等物質[7]，酵母菌為大曲提供發(fā)酵力，不僅主導了酒精的產生，而且產生大量風味化合物[8]。而在大曲制作過程中由于制曲環(huán)境、培菌管理、后期貯存方法的不同，也使不同酒企的大曲理化性質和微生物群落組成存在差異[9]。因此，研究大曲理化性質及微生物群落的結構，是充分認識釀酒微生物資源，解析濃香型白酒發(fā)酵機理的前提和基礎。

高通量測序技術近年來被廣泛應用于釀酒微生物多樣性研究[10]，吳樹坤等[9]利用高通量測序技術分析四川不同地區(qū)濃香型大曲微生物群落結構差異；SUN W等[11]利用高通量測序技術研究不同季節(jié)濃香型白酒酒醅的微生物群落演替；李靜心等[12]采用高通量測序技術對濃香型白酒高溫大曲和中高溫大曲進行微生物差異分析比較。大曲的理化性質是反映大曲是否發(fā)酵成熟和大曲品質優(yōu)劣的直接指標[13-14]，劉延波等[15]通過測定水分、酸度、糖化力、液化力、發(fā)酵力、氨基酸態(tài)氮、淀粉含量對賒店老酒三個等級的大曲進行比較研究，制定大曲評價體系；炊偉強等[16]報道瀘州老窖大曲優(yōu)級大曲中水分、酸度高，淀粉質量分數(shù)低；優(yōu)級大曲中的液化酶、糖化酶、蛋白酶的活力均明顯高于普級大曲。邢鋼等[17]跟蹤測定3種不同溫度大曲制曲過程中理化指標的變化，結果表明由于大曲發(fā)酵溫度和制作工藝不同，造成了3種大曲之間糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力4個理化指標相差很大。微生物群落組成及理化性質直接反映了大曲的品質，對白酒的酒體和風味形成起到關鍵作用，是釀酒生產的關鍵一環(huán)。

目前研究大曲微生物群落結構的報道較多，但從大曲理化性質和微生物群落結構組成相關性方面對河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲的研究鮮見報道。為探索河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲之間的異同，本研究采用理化分析結合高通量測序技術，研究河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲理化性質和微生物群落結構差異，并通過冗余分析（redundancy analysis，RDA）對理化指標和微生物群落結構進行相關性分析，為中原地區(qū)制作濃香型白酒大曲建立質量標準體系與微生物數(shù)據庫，對大曲的制作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品均為用于白酒生產的成品曲，分別取自河南南部、東部、西部、中部四個不同地方的知名酒企，編號為YA、YB、YC和YD，每個地區(qū)樣品取3個平行樣本做理化分析，將采集的樣品進行等量混合后提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。

氫氧化鈉、無水乙醇、無水葡萄糖、可溶性淀粉、碘、碘化鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸、鹽酸（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；甲醛（分析純）：天津市盛奧化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司等；FastDNA SPIN Kit for Soil（土壤基因組DNA提取試劑盒）：美國MP Biomedicals公司；DNA聚合酶AP221-02、Trans 15K DNA Marker：北京全式金生物技術公司；產物回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

FA1104分析天平（感量為0.000 1 g）：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；PHS-25精密pH計：上海雷磁儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：方科儀器（常州）有限公司；NanoDrop 2000紫外可見分光光度計、ST16R高速冷凍離心機、PICO17小型臺式離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GeneAmp9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；QuantiFluorTM-ST DNA定量儀：美國Promega公司；Illumina Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化指標測定

大曲水分、酸度、糖化力、液化力、淀粉含量、酯化力指標：依據吳樹坤等[9,15]方法進行測定。

糖化力的定義：在35℃、pH4.6條件下，1 g絕干曲1 h轉化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為一個單位（U），以mg/（g·h）表示。液化力的定義：在35 ℃、pH 4.6條件下，1 g絕干曲1 h能液化淀粉的克數(shù)為一個單位（U），以g/（g·h）表示。酯化力的定義：每50 g大曲在35 ℃，經過7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為一個單位（U），以mg/（g·h）表示。

1.3.2 高通量測序

（1）總DNA的提取

根據FastDNA SPIN Kit for Soil說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。

（2）PCR擴增和產物回收

細菌16S rDNA V3-V4區(qū)的通用引物為：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAG-3'）；806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCT-3'）。真菌18S rDNA V5-V7區(qū)的通用引物為：SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）；1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）。

PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10min。PCR擴增體系：4μL5×FastPfu緩沖液，2μL2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs），0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶，1 μL DNA模板（10ng/μL），雙蒸水（ddH2O）補至20 μL。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用DNA純化回收試劑盒進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTMST進行檢測定量。文庫的建立和高通量測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

（3）高通量測序結果分析

使用Uparse（version 7.0.1090 http：//drive5.com/uparse/）在97%序列同一性的閾值下將唯一序列分類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。采用核糖體數(shù)據庫項目（ribosomal database project,RDP）classifier（version 2.13 https：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，然后將來自每個聚類OTU的代表序列與Silva細菌16S rRNA數(shù)據庫（Re lease138 http：//www.arb-silva.de）和Greengene細菌16S rRNA數(shù)據庫（Release 13.5 http：//greengenes.secondgenome.com/）或Silva真菌18S rRNA數(shù)據庫（Release138 http：//www.arbsilva.de）進行比對，得到各樣本的群落物種組成。通過mothur（version1.30.2 https：//mothur.org/wiki/calculators/）計算α多樣性指數(shù)。

1.3.3 理化指標和微生物群落結構相關性分析

采用Origin 2021b中的redundancy analysis插件對細菌和真菌優(yōu)勢菌屬與理化指標進行冗余分析（redundancy analysis，RDA），對Pearson相關系數(shù)進行顯著性檢驗。

1.3.4 數(shù)據分析

利用Excel 2019、SPSS Statistics 21.0、SAS 9.2、Origin 2021b等統(tǒng)計繪圖軟件進行數(shù)據分析及繪圖，理化指標結果采用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 大曲理化指標分析

由表1可知，四種不同地區(qū)濃香型白酒大曲樣品水分含量在9.7%～13.1%之間，液化力在（0.62～0.85）g/（g·h）之間，根據濃香型白酒大曲輕工行業(yè)標準QB/T 4259—2011《濃香大曲》，全部符合濃香型白酒大曲水分含量＜14.0%，液化力≥0.20 g/（g·h）的要求；在水分含量和液化力上YB大曲和YA、YC、YD大曲之間沒有顯著差異（P＞0.05），YC大曲和YD大曲之間沒有顯著差異（P＞0.05），但YC大曲液化力最高為0.85 g/（g·h），YA大曲和YC、YD大曲之間存在顯著差異（P＜0.05），YA大曲水分含量最高為13.1%，而液化力最低為0.62 g/（g·h）；濃香型白酒大曲的糖化力通常在（100～1 000）g/（g·h）范圍內，四種大曲在糖化力上均符合要求，四種大曲在糖化力上均兩兩差異顯著（P＜0.05），YC大曲的糖化力最高達625 g/（g·h），四個樣品中YA大曲糖化力最低為485 g/（g·h）；酯化力上均兩兩差異顯著（P＜0.05），但YD大曲僅為22g/（g·h），酯化力最高的是YC大曲為224 g/（g·h）；四種大曲淀粉含量在（51.0～59.1）g/100 g之間，符合（50.0～65.0）g/100 g的標準，其中YB大曲與YA、YC、YD大曲差異顯著（P＜0.05），其淀粉含量也最高為59.1 g/100 g，YA、YC、YD大曲兩兩之間差異不顯著（P＞0.05）；酸度指標在（0.3～1.5）mmol/10 g范圍內視為正常，YB大曲和YC、YD大曲差異不顯著（P＞0.05），YA大曲和YB大曲之間差異顯著（P＜0.05），YA、YC、YD大曲之間兩兩差異顯著（P＜0.05）。

表1 大曲樣品理化指標分析結果Table 1 Analysis results of physical and chemical indexes of Daqu samples

2.2 大曲樣品Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)是常用于衡量微生物群落多樣性，Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)常用來衡量微生物群落物種的多樣性和豐富度，以Shannon指數(shù)最為敏感，即數(shù)值越大，物種的多樣性越高。由表2可知，YA、YB、YC和YD四個大曲樣品細菌分別檢測出1 552、866、492和888個OTU，真菌分別檢測出11、14、10、15個OTU；四種大曲樣本YA、YC、YD和YB細菌的Chao1指數(shù)分別為1 569.13、504.00、918.61和872.84，與Ace指數(shù)所反映的物種豐富度結果一致，表明四種大曲樣本中YA大曲豐富度最高；YD大曲細菌Shannon指數(shù)最大為4.39、Simpson指數(shù)最小為0.045，基于兩種算法都表明該大曲樣本細菌群落多樣性最高；四種大曲樣本的細菌群落多樣性YD＞YA＞YB＞YC，物種豐富度YA＞YD＞YB＞YC。YA、YC、YD、YB真菌的Chao1、Ace指數(shù)分別為11、10、15、14，YD大曲真菌物種豐富度最高，YB大曲真菌Shannon指數(shù)最大為1.37、Simpson指數(shù)最小為0.394，基于兩種算法都表明該大曲樣本真菌群落多樣性最高，四種大曲樣本的真菌菌群落多樣性YB＞YC＞YD＞YA，物種豐富度YD＞YB＞YD＞YC；覆蓋率范圍99.7%～100.0%，反映本次測序結果代表了樣本中微生物的真實情況。

表2 大曲樣品中細菌及真菌群落Alpha多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of bacterial and fungal flora in Daqu samples

2.3 大曲樣品細菌群落組成分析

將各類OTU的代表序列與Silva細菌數(shù)據庫進行比對，根據每個OTU在不同分類水平的物種分類信息，分析不同分類水平上樣本群落結構，結果見圖1。

圖1 基于門水平的大曲樣品的細菌群落結構Fig.1 Bacterial community structure of Daqu samples at phylum level

由圖1可知，在細菌門水平上，四個樣品中共檢測出9個細菌門，相對豐度較高（＞1%）的細菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）；由于厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱和梭菌綱等微生物組成，能很好的適應環(huán)境，能夠在外界條件極差的條件下保持生長代謝[18]；放線菌門菌群廣泛分布于土壤、海洋、植物體及其他極端自然生態(tài)環(huán)境中，與厚壁菌門相似，也具有極強的耐受性[19]。在對不同溫度大曲、不同產區(qū)大曲和釀造環(huán)境的高通量測序研究中均發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、變形桿菌門、放線菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門[9，20-23]，本實驗對濃香型白酒大曲中微生物多樣性的研究結果與前人研究結果一致。

四種不同大曲之間的門水平上細菌群落組成存在差異；YA、YC和YD大曲的第一優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（47.59%、59.18%和52.59%），第二優(yōu)勢菌門為變形菌門（24.40%、28.09%和30.20%）；YB大曲的第一優(yōu)勢菌門則是變形菌門（40.34%），第二優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（23.78%），其藍細菌門（12.24%）、放線菌門（9.94%）和擬桿菌門（7.37%）相對豐度明顯高于其他三種大曲；YD大曲綠彎菌門（4.67%）豐度最高；四種大曲中養(yǎng)菌門、熱袍菌門和酸桿菌門在各大曲中豐度不同，但都處于較低水平。

大曲中的細菌四個大曲樣本與細菌屬物種之間的對應關系見圖2。由圖2可知，在屬水平上，四個樣本中共檢測到28個細菌屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、青枯菌屬（Ralstonia）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、阪崎腸桿菌（Cronobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、Microcystis_PCC-7914、魏斯氏菌屬（Weissella）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、norank_f__norank_o__Chloroplast、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、unclassified_p__Proteobacteria、喬治菌屬（Georgenia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、梭形桿菌屬（Lysinibacillus）、norank_of__Muribaculaceae、norank_of__Mitochondria、norank_of__norank_o__OPB56、norank_of__norank_o__SBR1031、unclassified_c__Anaerolineae、假單胞菌屬（Pseudomonas）、紫桿菌屬（Porphyrobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、Mesotoga、Mariniradius。

圖2 基于屬水平的大曲樣品的細菌群落結構Fig.2 Bacterial community structure of Daqu samples at genus level

在四種大曲中相對豐度較高（＞1%）的細菌屬有芽孢桿菌屬、青枯菌屬、高溫放線菌屬、Kroppenstedtia、紅球菌屬、阪崎腸桿菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、Microcystis_PCC-7914、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬；其中芽孢桿菌產多種水解酶[24]，可以分解淀粉和蛋白質等大分子物質，提高大曲原料利用率，還可以豐富大曲及濃香型白酒的風味成分，是重要的吡嗪類化合物合成菌[25-26]；青枯菌屬具有天然的CO2固定能力，能高效的完成從CO2到有機物的生物合成[27]；高溫放線菌屬菌株能夠產生發(fā)達的菌絲體，疏松大曲內部結構，維持大曲骨架[28]；Kroppenstedtia多分離自芝麻香型白酒大曲，可能具有產纖維素酶、淀粉酶、幾丁質酶的能力[29]；紅球菌屬參與了氨基酸如L-亮氨酸和L-苯丙氨酸的生產以及固醇類的轉化[30]；阪崎腸桿菌屬代謝的揮發(fā)性產物主要有異戊醛、乙醇、異戊醇、3-羥基-2-丁酮、乙酸、正十五烷、正十六烷、正十七烷、1-癸醇，增加風味物質[31]；乳酸桿菌為傳統(tǒng)白酒厭氧發(fā)酵重要的功能菌種之一，與濃香型白酒四大酯類之乳酸乙酯的形成具有密切關系，能減弱酵母菌的好氧代謝速度，延長前發(fā)酵期，有利于發(fā)酵有益菌的生長，對于白酒香味物質增加有利，同時也是與有機酸相關性較強的功能細菌[32-33]；此外大曲中的片球菌屬也是釀造體系中廣泛存在的乳酸菌，對于維持釀造過程的食品安全性具有重要意義[34]；魏斯氏菌屬可以將原料中的糖類轉化生成乳酸等有機酸，進而與乙醇反應生成乙酸乙酯和乳酸乙酯，賦予濃香型白酒濃厚的醇香[35]；葡萄球菌屬在空氣、水、灰塵中均能發(fā)現(xiàn)，因此開放式發(fā)酵的大曲制曲過程中會富集到此類細菌[36]。本實驗中檢測到的菌屬與前人研究結果一致[37-41]，除上述所報道的菌屬被檢出，還檢出大量其他優(yōu)勢菌屬。此外，相比較而言，川派濃香型白酒大曲主要細菌屬葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬、高溫放線菌屬、乳桿菌屬和Kroppenstedtia，河南濃香型白酒大曲中雖未發(fā)現(xiàn)糖多孢菌屬，但檢出較多的片球菌屬和青枯菌屬類細菌，這可能是因為環(huán)境差異和大曲制作方法的不同。

屬水平細菌屬組成及豐度存在差異，芽孢桿菌屬是YA和YC大曲的絕對優(yōu)勢菌屬，青枯菌屬、乳桿菌屬分別是YB、YD大曲的絕對優(yōu)勢菌屬；高溫放線菌屬僅在YC大曲中占比為20.48%，阪崎腸桿菌僅在YA大曲中占比為12.99%，Microcystis_PCC-7914僅在YB大曲中占比為9.77%；魏斯氏菌屬是YD大曲的絕對優(yōu)勢菌屬占比達16.23%，在YA大曲中占比為1.82%，在YC和YB大曲中豐度較低；片球菌屬和葡萄球菌屬在YA大曲分別占8.43%和1.55%、在YD大曲中分別占2.36%和2.36%；乳桿菌屬在YD大曲中占比（10.57%），高于YA大曲（2.54%）和YB大曲（2.38%）；紅球菌屬在YB、YC和YD大曲中的占比分別為5.52%、3.94%和3.11%；Kroppenstedtia在YC大曲中占比為11.16%高于在YD大曲中的1.41%。四個地區(qū)的大曲樣品中細菌群落組成豐富，不同地區(qū)大曲細菌群落組成雖然有一定相似，但是豐度仍存在差異。

2.4 大曲細菌群落與理化性質冗余分析

選擇四個地方大曲理化指標作為環(huán)境因子與大曲中屬水平上細菌豐度前10的微生物進行冗余分析，結果見圖3，相關性結果顯著性檢驗分析見表3。由圖3可知，冗余分析（RDA）前兩個排序軸的累計方差貢獻率為83.63%，其中RDA1為58.84%，RDA2為26.79%；YA大曲和水分相關性最大，YB大曲和酸度、淀粉含量及液化力相關性最大，YC大曲和糖化力、液化力及酯化力相關性最大，YD大曲和酸度、淀粉含量相關性最大；Bacillus、Thermoactinomyces、Kroppenstedtia、Rhodococcus、Ralstonia與糖化力、液化力、酯化力變化呈正相關，Microcystis_PCC-7914與酸度、淀粉含量、液化力變化呈正相關，Cronobacter、Pediococcus、Weissella、Lactobacillus與水分和酸度變化呈正相關。

圖3 大曲樣品細菌群落與理化性質冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of bacterial community and physicochemical properties of Daqu samples

表3 大曲樣品細菌群落與理化性質相關性顯著性檢驗Table 3 Significance test of correlation between bacterial community and physicochemical properties of Daqu samples

由表3可知，淀粉含量相關顯著性檢驗（相關系數(shù)R2=0.947，P=0.008）對細菌群落結構相關極顯著，酯化力（相關系數(shù)R2=0.779，P=0.036）和水分含量（相關系數(shù)R2=0.566，P=0.047）相關顯著。結果表明，大曲的理化性質對細菌群落結構具有相關性。但不同大曲與不同理化性質之間的相關性有一定差異，這勢必與制曲環(huán)境、氣候等自然條件的差異有關。

2.5 大曲樣品真菌群落組成分析

由圖4可知，在門水平上，四個大曲樣品中共檢測出3個真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔子菌門（Basidiomycota）。子囊菌門相對豐度高且在YA、YB、YC、YD大曲樣品中均為絕對優(yōu)勢真菌門；毛霉門在四種大曲中也屬于優(yōu)勢菌門，在YD、YC、YB大曲中占6.05%～7.90%，在YA大曲中占比較少僅1.06%；擔子菌門在YC大曲中占比最高達10.15%；而YA大曲中擔子菌門僅占0.03%，屬于非優(yōu)勢菌門。子囊菌門、毛霉亞門、擔子菌門是大曲的主要真菌門與之前的報道一致[9，42]。四種樣品之間真菌群落存在著差異，其中YA大曲的真菌多樣性與其他三種大曲差異最大。

圖4 基于門水平的大曲樣品的真菌群落結構Fig.4 Fungi community structure of Daqu samples at phylum level

由圖5可知，四個樣本中共檢測到8個真菌屬，分別為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、unclassified-o-Eurotiales、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、norank_p_Mucoromycota、Cutaneotrichosporon、畢赤酵母屬（Pichia）、馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）、織球殼菌屬（Plectosphaerella）。HUANG Y等[43]借助PCR-變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術分析了不同大曲中微生物組成的差異，結果表明，Saccharomycopsis和Pichia是大曲中主要的酵母屬，與本實驗所得出的酵母屬結果類似；而有研究表明嗜熱子囊菌屬、根毛霉屬為中高溫酒曲的優(yōu)勢真菌群[44]，本研究與其研究的結果有一定差異，猜測是由于地區(qū)的差異、制曲工藝不同等因素造成不同大曲間真菌多樣性不同。

圖5 基于屬水平大曲樣品真菌群落結構Fig.5 Fungi community structure of Daqu samples at genus level

不同的真菌種類以及占比會賦予大曲各自不同的功能，從而對白酒生產起著至關重要的作用。有關研究表明，嗜熱子囊菌屬可以產生多種酶（包括過氧化氫酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、幾丁質酶等），它在白酒發(fā)酵過程中產生的作用不可忽視[44-45]。此外，本實驗中嗜熱子囊菌屬在四種樣品中含量有一定差異，以YA和YD兩種大曲樣品的差異最大，研究表明嗜熱子囊菌屬在大曲中的占比與制曲溫度是有著密切聯(lián)系的。在溫度較高的大曲中此類真菌群落組成單一，其主要原因可能在于其高溫制曲的工藝中，大部分不耐熱的微生物會被除掉，因此會形成以嗜熱或耐熱微生物為主的特殊菌群[46-47]。由此可以發(fā)現(xiàn)制曲工藝中選擇和控制好適宜的溫度會對大曲形成的微生物群落結構具有重要的作用。未分類的散囊菌目（unclassified-o-Eurotiales）具有重要的新陳代謝作用，可以利用各種底物來生產工業(yè)上重要的產品，如脂質、殼聚糖、幾丁質、多磷酸鹽、醇和有機酸等[48-49]。復膜孢酵母屬在自然界中存在廣泛，具有分泌α-淀粉酶[50]、蛋白酶在內多種水解酶的能力，研究證明該菌屬在發(fā)酵行業(yè)中具有十分重要的作用[4，51]。復膜孢酵母屬不僅具有在窖池中發(fā)酵產生酒精的能力，還可以提高大曲酒中多種醇、酯的含量，從而可以有效的提高原酒品質[52]。Cutaneotrichosporon在其他大曲樣品中未檢測到，但此類菌屬具有同化多種糖類和甘油的作用，并且能夠發(fā)酵甘蔗秸稈生產生物乳化劑[53]。畢赤酵母屬在白酒堆發(fā)酵過程中，是耐熱真菌和強大的競爭者，且畢赤酵母屬對于自然發(fā)酵過程中的質量控制和管理具有重要意義，可以構建白酒發(fā)酵微生物群落[54]。

通過對不同樣品屬水平上的真菌群落結構比較發(fā)現(xiàn)，YB、YC、YD三種大曲中嗜熱子囊菌屬為絕對優(yōu)勢真菌屬；YA大曲的絕對優(yōu)勢真菌屬為未分類的散囊菌目（unclassified-o-Eurotiales），而該菌屬在YB、YC大曲中占比較少；復膜孢酵母屬在YB、YC大曲中的含量又遠高于YA、YD大曲；Cutaneotrichosporon在三種大曲中占比大小排序分別為YC＞YB＞YA，在YD大曲中未檢出；畢赤酵母屬在YC、YD中含有一定比例，前者大于后者?？傮w來說，YB、YD大曲的物種豐富度要高于YA和YC大曲，由此可見，原因可能是由于區(qū)域內環(huán)境中存在的微生物種類不同而導致，同時也會受到各自大曲制作工藝的控制。

2.6 大曲真菌群落與理化性質冗余分析

由圖6可知，RDA前兩個排序軸的累計方差貢獻率為98.65%，其中RDA1為85.19%，RDA2為13.46%；YA大曲和水分相關性最大，YB大曲糖化力、淀粉含量及液化力相關性最大，YC大曲和酯化力相關性最大，YD大曲和酸度相關性最大；Thermoascus、Malassezia與水分變化呈正相關，unclassified-o-Eurotiale、norank_p_Mucoromycota、Plectosphaerella與酸度、淀粉含量、液化力、糖化力變化呈正相關，Saccharomycopsis、Cutaneotrichosporon、Pichia與 酯 化 力、糖化力、淀粉含量、液化力變化呈正相關。由表4可知，酸度（R2=0.987 9，P=0.012）、酯化力（R2=0.936 4，P=0.033）、水分（R2=0.881 1，P=0.045）對真菌群落結構相關顯著。

圖6 大曲樣品真菌群落與理化性質冗余分析結果Fig.6 Redundant analysis results of fungal community and physicochemical properties of Daqu samples

表4 大曲樣品真菌群落與理化性質相關性顯著性檢驗Table 4 Significance test of correlation between fungal community and physicochemical properties of Daqu samples

3 結論

該研究采用理化分析結合高通量測序技術，分析河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲理化性質和微生物群落結構差異；理化性質表明，四個不同地區(qū)的大曲在糖化力、酸度和酯化力上存在顯著差異；高通量測序分析表明，從四種大曲中共檢出9個細菌門和28個細菌屬、3個真菌門和8個真菌屬；YA、YC和YD大曲中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，其次為變形菌門，YB大曲則相反；YA和YC大曲的絕對優(yōu)勢菌屬是芽孢桿菌屬，而YB大曲中是青枯菌屬，YD大曲中是乳桿菌屬。不同大曲中子囊菌門和毛霉門占優(yōu)勢，但毛霉門在YA大曲中占比較??；真菌屬水平上，YB、YC、YD大曲中嗜熱子囊菌屬占絕對優(yōu)勢，而YA大曲的絕對優(yōu)勢真菌屬為unclassified-o-Eurotiales。冗余分析表明淀粉含量、酯化力和水分對細菌群落結構顯著相關（P＜0.05），酸度、酯化力、水分對真菌群落結構顯著相關（P＜0.05）。