方 偉，李佳佳，耿偉濤，賈龍剛，陳鐵濤，王艷萍*

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.百施（上海）生物科技有限公司，上海 200436）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱，廣泛存在于人和動物的腸道以及傳統(tǒng)發(fā)酵制品等中[1-2]。發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CECT 5716是一株分離自健康人乳的乳酸菌，具有極高的安全性[3]。2016年國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布公告（2016年第6號），將發(fā)酵乳桿菌CECT 5716列入《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》，為該菌株在母嬰產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了依據(jù)。目前，國內(nèi)外研究學(xué)者已對發(fā)酵乳桿菌CECT 5716的益生功能開展了大量的研究工作，研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有緩解哺乳期婦女乳腺炎[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、降血壓和降血脂[6]等益生功能。

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞外的高分子質(zhì)量碳水化合物聚合物[7]。產(chǎn)EPS的乳酸菌主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Trichococcus）和鏈球菌屬（Streptococcus）等[8]。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，EPS除具有增黏性、保水性和抗剪切性等理化特性外，還具有多種生理活性，如抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道菌群和降低血清膽固醇等[9-10]。而發(fā)酵乳桿菌CECT 5716擁有的益生功能是否與其EPS相關(guān)，其作用的關(guān)鍵分子尚需進(jìn)行深入研究與揭示，但目前對其EPS的系統(tǒng)研究鮮見報道，因此迫切需要對其EPS展開研究，而較低的產(chǎn)量是其研究受限的關(guān)鍵因素。

本研究采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)EPS的培養(yǎng)基成分，并對優(yōu)化后獲得的EPS進(jìn)行抗氧化活性研究，以期為該菌株EPS的大規(guī)模制備及開發(fā)其作為天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CECT 5716：百施（上海）生物科技有限公司保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[11]：牛肉膏1.0%，酵母膏0.5%，蛋白胨1.0%，葡萄糖2.0%，磷酸氫二鉀0.2%，無水乙酸鈉0.5%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%，檸檬酸氫二胺0.2%，吐溫80 0.1%，pH值6.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。固體MRS培養(yǎng)基中添加瓊脂2%。

1.1.3 試劑

無水乙醇、三氯乙酸、硫酸、苯酚（重蒸餾）、鉬酸銨、硫酸鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、過硫酸鉀、維生素C（vitamin C，VC）（均為分析純）：江天化工技術(shù)股份有限公司；透析袋（截留分子質(zhì)量8 000 Da）：鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhy drazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-Azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-9600紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；Avanti J-E大容量冷凍離心機(jī)：美國Beckman公司；ALPHA 1-2 LD冷凍干燥機(jī)：德國CHRIST公司；Anaerobox IV型厭氧培養(yǎng)箱：美國GeneScience公司；Thermo全波長酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵乳桿菌CECT 5716的培養(yǎng)條件

將保藏于-80 ℃的發(fā)酵乳桿菌CECT 5716劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，再重復(fù)進(jìn)行2次平板劃線，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h，并傳代兩次以使菌株的活力最大化。將活化后的菌株以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。

1.3.2 發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)EPS培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

碳源種類、復(fù)配比例及其添加量的優(yōu)化：以MRS液體培養(yǎng)基（對照）為基礎(chǔ)，使用不同的碳源（麥芽糖、蔗糖、乳糖和果糖）替代MRS培養(yǎng)基中的碳源（葡萄糖），以確定最佳碳源的種類。在最佳碳源種類的基礎(chǔ)上，對麥芽糖和蔗糖進(jìn)行了復(fù)配，復(fù)配比例為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。在最佳復(fù)配比（麥芽糖∶蔗糖=2∶1）的基礎(chǔ)上進(jìn)行碳源添加量（1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%）的優(yōu)化。

氮源種類及其添加量的優(yōu)化：以MRS液體培養(yǎng)基（對照）為基礎(chǔ)，使用不同氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、胰蛋白胨、3072乳清蛋白水解物和3065乳清蛋白水解物）替代MRS培養(yǎng)基中的氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母膏），以確定最佳氮源的種類。在最佳氮源種類的基礎(chǔ)上進(jìn)行氮源添加量（2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%）的優(yōu)化。

L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的優(yōu)化：以MRS液體培養(yǎng)基（對照）為基礎(chǔ)，考察L-半胱氨酸鹽酸鹽不同添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）對發(fā)酵乳桿菌CECT 5716 EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.3 發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)EPS培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出顯著影響EPS產(chǎn)量的3個因素復(fù)合碳源（麥芽糖∶蔗糖=2∶1）添加量（A）、酵母膏添加量（B）、L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量（C）。以EPS產(chǎn)量（Y）為考察指標(biāo)，設(shè)計3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，優(yōu)化培養(yǎng)基組成。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium optimization of exopolysaccharide production by Lactobacillus fermentum CECT 5716

1.3.4 EPS的制備及含量的測定

根據(jù)BENGOA A A等[12]方法并略作修改制備EPS。取發(fā)酵液在100 ℃加熱30 min，冷卻后離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min）。取上清，加入2倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜后，離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min）。將沉淀復(fù)溶于適量蒸餾水中，加入10%三氯乙酸，置于磁力攪拌器上冰浴4 h，離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min），取上清，將其pH值調(diào)至7.0，加2倍體積的無水乙醇進(jìn)行復(fù)醇沉，4 ℃靜置過夜后離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min），沉淀復(fù)溶于少量蒸餾水中，透析（截留分子質(zhì)量8 000 Da）2～3 d，定容，采用苯酚-硫酸法[13]測定透析液中EPS的含量，將透析液冷凍干燥得EPS。

1.3.5 EPS純度的測定

精確稱取100.00 mg EPS，用適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，混勻，得樣品溶液，采用苯酚-硫酸法[13]測定樣品中的多糖含量，計算EPS的純度，其計算公式如下：

式中：C為稀釋后樣品的多糖含量，mg/L；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液的體積，L；M為樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.6 EPS的體外抗氧化活性測定

DPPH自由基清除活性的測定：參考ZHANG Q等[14]的方法；ABTS自由基清除活性的測定：參考XU Y M等[15]的方法；總抗氧化能力的測定：參考SHANKAR T等[16]的方法；Fe3+總還原力的測定：參考WANG K等[17]的方法。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)EPS培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源種類、復(fù)配比例及添加量的優(yōu)化

碳源是微生物生長代謝過程中的必需物質(zhì)，對乳酸菌EPS的產(chǎn)量及其相對分子質(zhì)量、單糖組成和摩爾比都有較大的影響[18]。不同碳源對EPS產(chǎn)量的影響見圖1A。由圖1A可知，當(dāng)碳源為麥芽糖時，EPS的產(chǎn)量最高，為（305.67±9.71）mg/L，是對照組的1.25倍；其余依次為蔗糖、乳糖和果糖。不同碳源導(dǎo)致EPS產(chǎn)量的差異，可能是因?yàn)樵摼鷮Ω鞣N碳源的利用能力不同，導(dǎo)致菌株代謝速率等方面的差異，從側(cè)面也反映出EPS合成途徑的調(diào)節(jié)可能依賴于碳水化合物的不同[19]。

綜合考慮EPS產(chǎn)量與降低成本的因素，選擇將麥芽糖和蔗糖進(jìn)行復(fù)配作為碳源，考察其復(fù)配比例對EPS產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1B。由圖1B可知，當(dāng)麥芽糖∶蔗糖=2∶1時，EPS的產(chǎn)量最高，為（364.65±13.89）mg/L。因此，選用麥芽糖和蔗糖以2∶1的比例復(fù)配作為碳源。

碳源濃度過低或過高都不利于菌體的正常生長及其代謝產(chǎn)物的合成，故碳源添加量對EPS的產(chǎn)量也有顯著影響[20]。不同復(fù)合碳源添加量對EPS產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1C。由圖1C可知，隨著復(fù)合碳源添加量的升高，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)復(fù)合碳源添加量為3%時，EPS產(chǎn)量最高，為（421.11±6.78）mg/L。復(fù)合碳源添加量過高導(dǎo)致EPS產(chǎn)量下降，分析原因可能是由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生了“葡萄糖效應(yīng)”，導(dǎo)致菌株代謝異常，乳酸等初級代謝產(chǎn)物大量積累，次級代謝受到抑制從而影響了EPS的合成[8]。因此，確定最優(yōu)復(fù)合碳源添加量為3%。

圖1 碳源種類（A）、復(fù)配比例（B）及復(fù)合碳源添加量（C）對發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.1 Effects of carbon source type(A),compound proportion(B)and compound carbon source addition(C)on exopolysaccharide production by Lactobacillus fermentum CECT 5716

2.1.2 氮源種類及添加量的優(yōu)化

氮源在乳酸菌的生長及其代謝產(chǎn)物的合成中，發(fā)揮著重要的作用[21]。不同氮源對EPS產(chǎn)量的影響見圖2A。由圖2A可知，不同氮源對EPS產(chǎn)量有較大的影響，當(dāng)?shù)礊榻湍父鄷r，EPS產(chǎn)量最高，為（740.15±19.64）mg/L，是對照組的3.02倍，顯著高于其他氮源。這可能是因?yàn)榻湍父喔缓鞍踪|(zhì)、氨基酸和維生素，可被菌體更好地利用[22]。因此，確定最優(yōu)氮源為酵母膏。酵母膏添加量對發(fā)酵乳桿菌CECT 5716 EPS產(chǎn)量的影響見圖2B。由圖2B可知，酵母膏添加量對發(fā)酵乳桿菌CECT5716 EPS產(chǎn)量的影響顯著，隨著酵母膏添加量的升高，EPS產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢，這可能是由于氮源可作為能源物質(zhì)而被菌株利用，促進(jìn)其代謝并合成EPS，而氮源添加量過高，導(dǎo)致菌株產(chǎn)生過量的銨、硝態(tài)氮，從而抑制了其EPS的積累[23]。當(dāng)酵母膏添加量為3%時，EPS產(chǎn)量最高，為（1 077.68±20.67）mg/L。因此，確定酵母膏最優(yōu)添加量為3%。

圖2 氮源種類（A）及酵母膏添加量（B）對發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.2 Effects of nitrogen source type (A) and yeast extract addition(B) on exopolysaccharide production by Lactobacillus fermentum CECT 5716

2.1.3L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的優(yōu)化

L-半胱氨酸鹽酸鹽常作為一種還原劑加入培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基保持一個相對厭氧的環(huán)境[24]。L-半胱氨酸鹽酸鹽不同添加量對EPS產(chǎn)量的影響見圖3。

圖3 L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量對發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.3 Effects of L-cysteine hydrochloride addition on exopolysaccharide production by Lactobacillus fermentum CECT 5716

由圖3可知，與對照組相比，添加一定量的L-半胱氨酸鹽酸鹽可以提高EPS的產(chǎn)量，當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為0.2%時，EPS產(chǎn)量最高，為（293.81±13.79）mg/L，是對照組的1.20倍。這可能與其能夠改變培養(yǎng)基的氧化還原電位，從而更有利于發(fā)酵乳桿菌CECT 5716的生長及代謝有關(guān)[25]。因此，確定L-半胱氨酸鹽酸鹽最優(yōu)添加量為0.2%。

2.2 發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)EPS培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組成，正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。由表2可知，通過極差分析，L-半胱氨酸鹽酸鹽是影響EPS產(chǎn)量的最主要因素，麥芽糖和蔗糖添加量次之，酵母膏添加量影響最小。最佳培養(yǎng)基配方組合為A3B3C2，因?yàn)樵贏3與A2以及B3與B1水平下，EPS的產(chǎn)量相差不大，考慮到生產(chǎn)成本等因素，最終選擇A2B1C2為最佳組合，即碳源添加量3%、酵母膏2.5%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.2%。在此條件下，EPS產(chǎn)量為（1 560.15±22.64）mg/L。驗(yàn)證試驗(yàn)得EPS產(chǎn)量為（1 575±22.91）mg/L，證明該正交試驗(yàn)設(shè)計成功。

表2 發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)EPS培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium optimization of exopolysaccharide production by Lactobacillus fermentum CECT 5716

2.3 胞外多糖的純度

經(jīng)測定，優(yōu)化后所得EPS的純度為（92.2±1.8）%。

2.4 胞外多糖的抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基可與自由基清除劑（如EPS、多酚和維生素E等）反應(yīng)，其溶液吸光度值的變化可用于評估自由基清除劑的抗氧化能力[26]。不同質(zhì)量濃度的EPS對DPPH自由基的清除能力見圖4。由圖4可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0～8 mg/mL時，EPS和VC對DPPH自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，但EPS對DPPH自由基的清除能力低于相同質(zhì)量濃度的VC，EPS對DPPH自由基的半抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50）值為0.24 mg/mL。當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，EPS、VC對DPPH自由基的清除率分別為（84.17±1.30）%、（89.62±1.55）%。EPS清除自由基的機(jī)制可能是由于EPS與自由基結(jié)合并形成了穩(wěn)定的分子條件，從而終止了自由基的進(jìn)一步反應(yīng)[27]。

圖4 胞外多糖對DPPH自由基的清除活性Fig.4 Scavenging activity of exopolysaccharide on DPPH radical

2.4.2 ABTS自由基清除活性

不同質(zhì)量濃度的EPS對ABTS自由基的清除能力見圖5。由圖5可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0～8 mg/mL，EPS和VC對ABTS自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，但EPS對ABTS自由基的清除能力低于相同質(zhì)量濃度的VC的清除能力，EPS對ABTS自由基的IC50值為14.81 mg/mL。當(dāng)EPS的質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，EPS對ABTS自由基的清除率為（35.37±1.24）%。EPS具有較高的ABTS自由基清除能力可能是由于其能夠?qū)⒆杂苫苫钚誀顟B(tài)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定狀態(tài)，并通過向自由基提供電子來終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[28]。

圖5 胞外多糖對ABTS自由基的清除活性Fig.5 Scavenging activity of exopolysaccharide on ABTS radical

2.4.3 總抗氧化能力

總抗氧化能力反映的是非酶促抗氧化的能力[29]，不同質(zhì)量濃度的EPS的總抗氧化能力見圖6。由圖6可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0～8 mg/mL時，EPS和VC的總抗氧化能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，且在同一質(zhì)量濃度下，EPS的總抗氧化能力低于VC，當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，溶液的吸光度值為0.31±0.004。

圖6 胞外多糖的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of exopolysaccharide

2.4.4 Fe3+總還原力

天然活性物質(zhì)的鐵還原能力可作為其電子給體活性的重要指標(biāo)，常用來評價抗氧化劑的抗氧化能力[30]。為了解EPS將Fe3+還原為其亞鐵形式的能力[31]，測定不同質(zhì)量濃度EPS的Fe3+總還原力，結(jié)果見圖7。由圖7可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0～8 mg/mL時，EPS和VC的Fe3+總還原力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，且在同一質(zhì)量濃度下，EPS的Fe3+總還原力低于VC。當(dāng)EPS的質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，EPS的Fe3+總還原力為0.55±0.01。

圖7 胞外多糖的Fe3+總還原力Fig.7 Fe3+total reducing power of exopolysaccharide

綜上結(jié)果表明，該EPS具有一定的抗氧化能力，抗氧化效果與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。但EPS在各種反應(yīng)體系中顯示出不同的抗氧化能力，可能是由于EPS的單糖組成、羥基含量以及供氫能力不同等因素導(dǎo)致的[32]。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)EPS的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：麥芽糖2.0%、蔗糖1.0%、酵母膏2.5%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.2%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、檸檬酸氫二胺0.2%、吐溫80 0.1%。在此條件下，EPS產(chǎn)量達(dá)到（1 575±22.91）mg/L，是優(yōu)化前的6.38倍。EPS的抗氧化活性與其質(zhì)量濃度成正比，當(dāng)EPS的質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為（84.17±1.30）%、對ABTS自由基的清除率為（35.37±1.24）%、總抗氧化能力為0.31±0.01和Fe3+總還原力為0.55±0.01。本研究優(yōu)化了發(fā)酵乳桿菌CECT 5716產(chǎn)EPS的培養(yǎng)基成分，并研究了該菌株產(chǎn)生的EPS的抗氧化特性，為進(jìn)一步揭示發(fā)酵乳桿菌CECT 5716抗氧化的功能及作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，也為發(fā)酵乳桿菌CECT 5716的大規(guī)模制備及其結(jié)構(gòu)的研究提供了理論依據(jù)。