羅 燦，劉玉潔，陳劭舒，夏鳳騰，李怡成，王 征*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

靈芝（Ganoderma lucidum）別名靈芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草。靈芝在我國(guó)作為藥材使用已有2000多年的歷史。現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝多糖在抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腸道健康[1-4]等方面，均具有良好的生理功能。玉竹（Polygonatum odoratumMill）別名鈴鐺菜，地管子，尾參。為百合科黃精屬的植物，常以根莖入藥，具有滋陰潤(rùn)燥、生津止渴等功效，是我國(guó)常見中藥材，主要有效成分為甾體皂苷類，黃酮類，多糖類及揮發(fā)油類[5]。研究表明，玉竹多糖具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、延緩皮膚衰老等藥理作用[6-8]。

以具有活性成分的各種中藥材作為基質(zhì)成分，使用藥用真菌發(fā)酵中草藥，該基質(zhì)既提供真菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，又因真菌的分解（合成）而產(chǎn)生新的成分，從而使整個(gè)發(fā)酵作用具有雙向性[9]。近年來靈芝菌雙向發(fā)酵取得了一定的進(jìn)展。辛燕花等[10-11]利用靈芝菌發(fā)酵何首烏和銀杏，發(fā)現(xiàn)其活性物質(zhì)和抗氧化性均有不同程度的提高。裴智鵬等[12]利用靈芝菌發(fā)酵黃芪，發(fā)現(xiàn)黃芪促進(jìn)了靈芝菌多糖的分泌，使靈芝多糖的免疫活性和抗腫瘤活性增強(qiáng)。胡永樂等[13]利用靈芝菌發(fā)酵澤瀉，發(fā)現(xiàn)南韓靈芝發(fā)酵對(duì)菌質(zhì)中粗多糖和黃酮提取，具有明顯促進(jìn)作用。玉竹含有大量纖維素和淀粉，靈芝菌生長(zhǎng)時(shí)能分泌大量纖維素酶和淀粉酶[14-15]，因此，該研究以靈芝菌株作為出發(fā)菌株以玉竹的作為基質(zhì)，探究二者液體發(fā)酵水溶性多糖變化及其抗氧化活性。為其功能性產(chǎn)品的開發(fā)與其工業(yè)發(fā)酵提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

紫芝（Ganoderma sanensee）：受贈(zèng)于遵義醫(yī)科大學(xué)馮昆教授；玉竹（Polygonatum odoratumMill）采摘于湖南省婁底市；豆粕：市售，烘干粉碎，過80目網(wǎng)篩，備用；硫酸、苯酚、KH2PO4、MgSO4·7H2O：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/100 mL）：玉米粉2、麥麩1、酵母粉0.5、KH2PO40.2、MgSO4·7H2O 0.1、維生素B10.005，115 ℃滅菌30 min。

斜面培養(yǎng)基（g/100 mL）：馬鈴薯20、葡萄糖2、KH2PO40.2、MgSO4·7H2O 0.1、瓊脂2，115 ℃滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/100 mL）：玉竹5、酵母粉0.5、KH2PO40.2、MgSO4·7H2O 0.1、維生素B10.005，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1802G紫外分光光度計(jì)：天津冠澤科技有限公司；TYSP-400高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司；PL303電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL18W臺(tái)式高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；ZQLY-180N恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化及培養(yǎng)條件

菌種活化：無菌條件下用接種針從保存紫芝菌種的斜面培養(yǎng)基上劃取三塊0.5 cm2的菌塊接種于種子培養(yǎng)基中。30 ℃、170 r/min培養(yǎng)5 d活化。備用。

種子液制備：接種5%（V/V）活化的菌種至種子培養(yǎng)基中。30 ℃、170 r/min培養(yǎng)4 d。備用。

發(fā)酵培養(yǎng)：接種5%（V/V）的種子液至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中。30 ℃、170 r/min培養(yǎng)4 d。

1.3.2 靈芝菌發(fā)酵玉竹工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

設(shè)定不同有機(jī)氮源種類（胰蛋白胨、豆粕、牛肉膏、酵母粉）、氮源添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、玉竹添加量（3%、4%、5%、6%、7%）、KH2PO4添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、MgSO4·7H2O添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），接種量5%，發(fā)酵溫度30 ℃、170 r/min培養(yǎng)4 d，以發(fā)酵液多糖提高率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察發(fā)酵培養(yǎng)基成分對(duì)發(fā)酵后多糖提高率影響。設(shè)定玉竹添加量6%，豆粕添加量2%，KH2PO4添加量0.15%，MgSO4·7H2O添加量0.15%，不同接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃），以發(fā)酵液多糖提高率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵后多糖提高率影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

（1）Packett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的玉竹添加量（X1）、豆粕添加量（X2）、KH2PO4添加量（X3）、MgSO4·7H2O添加量（X4）、接種量（X5）、培養(yǎng)時(shí)間（X6）、發(fā)酵溫度（X7）進(jìn)行Packett-Burman試驗(yàn)，篩選出對(duì)多糖提高率影響顯著的因子。利用Minitab 17.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（2）最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Packett-Burman試驗(yàn)篩選對(duì)多糖提高率影響顯著的因子，參考Packett-Burman試驗(yàn)顯著因子的正負(fù)效應(yīng)和單因素試驗(yàn)效應(yīng)來設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)出最陡爬坡試驗(yàn)最佳路徑。

（3）Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在Packett-Burman試驗(yàn)結(jié)果確定的因素基礎(chǔ)上，在最陡爬坡試驗(yàn)所確定的區(qū)域內(nèi)，以多糖提高率（Y）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。利用Design-Expert 12.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 分析檢測(cè)

（1）發(fā)酵后水溶性多糖測(cè)定

將發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，搖勻，4 ℃冰箱靜置過夜。將溶液10 000 r/min離心10 min，棄上清液，用熱水溶解沉淀，定容到100 mL容量瓶中，備用。按硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量，并計(jì)算多糖提高率[16]。

（2）生物量測(cè)定和多糖提取物制備

將搖瓶中的發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，收集沉淀過60目網(wǎng)篩。60 ℃烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量得生物量。

根據(jù)工藝進(jìn)行發(fā)酵，分別將沒有接種的對(duì)照組與接種發(fā)酵的試驗(yàn)組離心（10 000 r/min、10 min）收集上清液，減壓濃縮至200 mL，以4∶1的體積比加入Sevage（氯仿∶正丁醇=4∶1）試劑，振蕩30 min，離心（4 000 r/min、10 min），收集上清液，重復(fù)5次至沒有白色沉淀析出。脫蛋白后的多糖溶液加入經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹脂進(jìn)行脫色處理，振蕩2 h，抽濾，收集樣液。樣液濃縮至150 mL后加入3倍無水乙醇，放于4 ℃冰箱過夜，離心（10 000 r/min、10 min），沉淀用熱水溶解。使用截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da透析袋透析48 h，12 h換水一次。將對(duì)照組和試驗(yàn)組透析液冷凍干燥得未發(fā)酵多糖（polysaccharides before fermentation，PBF）、發(fā)酵后多糖（polysaccharide after fermentation，PAF）含量。

（3）抗氧化能力測(cè)定

用自由基的清除率表征多糖的抗氧化能力，羥基自由基（OH·）清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]，DPPH自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]，ABTS自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

上述試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果利用SPSS25.0軟件進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異P＜0.05。利用GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 氮源種類的確定

靈芝菌對(duì)無機(jī)氮源利用率較低[20]，故選用常見的有機(jī)氮源進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖1。由圖1可看出，當(dāng)牛肉膏和酵母粉作氮源時(shí)，多糖提高率較低，其中酵母粉作氮源有利于生物量的積累。當(dāng)豆粕作為氮源時(shí)發(fā)酵后多糖提高率最高達(dá)（30.1±2.02）%，當(dāng)?shù)鞍纂俗鞯磿r(shí)發(fā)酵后多糖提高率達(dá)（24.8±3.25）%，但兩種氮源的多糖提高率沒有顯著性差異（P＞0.05），因此從經(jīng)濟(jì)效應(yīng)考慮，選擇豆粕作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖1 不同氮源對(duì)多糖提高率的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources on the increase rate of polysaccharide

2.1.2 豆粕添加量的確定

選定豆粕作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源后，改變發(fā)酵培養(yǎng)基豆粕的添加量，考察不同的豆粕添加量對(duì)多糖提高率及生物量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，生物量隨豆粕添加量的增大而增大，添加量達(dá)到2.0%后趨于平穩(wěn)。當(dāng)豆粕添加量為2.0%時(shí)，發(fā)酵后的多糖提高率最大，為（32.80±1.69）%。故選擇發(fā)酵培養(yǎng)基豆粕添加量為2.0%。

圖2 豆粕添加量對(duì)多糖提高率的影響Fig.2 Effect of soybean meal addition on the increase rate of polysaccharide

2.1.3 玉竹添加量的確定

改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的玉竹添加量，考察不同玉竹添加量對(duì)發(fā)酵后多糖提高率及生物量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)玉竹添加量為3%～6%時(shí)，多糖提高率和生物量隨玉竹添加量的增大而增大，添加量為6%時(shí)，發(fā)酵后的多糖提高率和生物量均最大，其中多糖提高率為（42.95±0.96）%。當(dāng)玉竹添加量超過6%時(shí)，多糖提高率和生物量均顯著下降，其原因可能是玉竹添加量過高，黃酮類、生物堿等生物活性物質(zhì)含量增高，減緩和抑制靈芝菌生長(zhǎng)[11]，導(dǎo)致靈芝菌不足以酶解更多的淀粉和纖維素。故選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的玉竹添加量為6%。

圖3 玉竹添加量對(duì)多糖提高率的影響Fig.3 Effect of Polygonatum odoratum addition on the increase rate of polysaccharide

2.1.4 KH2PO4添加量的確定

KH2PO4中的K+是果糖激酶、磷酸丙酮酸轉(zhuǎn)磷酸酶等酶的輔因子；磷酸根主要作用是維持電位差、滲透壓平衡及緩沖pH值[21]。改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基的KH2PO4的添加量，考察不同KH2PO4添加量對(duì)發(fā)酵后多糖提高率及生物量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著KH2PO4添加量的增加，生物量的變化不大，當(dāng)添加量為0.15%時(shí)多糖提高率達(dá)到最大為（45.52±3.34）%。說明當(dāng)KH2PO4添加量達(dá)到0.15%后，靈芝菌就不能再利用多余的KH2PO4，因此選擇KH2PO4的添加量為0.15%。

圖4 KH2PO4添加量對(duì)多糖提高率影響Fig.4 Effect of KH2PO4 addition on the increase rate of polysaccharide

2.1.5 MgSO4·7H2O添加量的確定

Mg2+是糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑的重要激活劑，存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中，參與菌體生長(zhǎng)，含量太少會(huì)影響碳源的氧化[22]。改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基的MgSO4·7H2O的添加量，考察不同MgSO4·7H2O添加量對(duì)發(fā)酵后多糖提高率及生物量的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著MgSO4·7H2O添加量的增多，多糖提高率和生物量呈先上升后下降的趨勢(shì)。說明一定濃度的硫酸鎂能促進(jìn)靈芝菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)多糖，添加量0.15%時(shí)多糖提高率最大，為（42.07±2.48）%，此時(shí)生物量也最大。因此選擇MgSO4·7H2O添加量為0.15%。

圖5 MgSO4·7H2O添加量對(duì)多糖提高率影響Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O addition on the increase rate of polysaccharide

2.1.6 接種量的確定

改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同接種量，考察不同接種量對(duì)發(fā)酵后多糖提高率及生物量的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，多糖提高率和生物量都隨接種量的增大而先升高后降低。其原因可能和菌絲球大小和數(shù)目有關(guān)。接種量小時(shí)菌絲球較大，菌絲球菌球直徑小，數(shù)量多，更易產(chǎn)生絲狀體，有利于胞外多糖的形成[23]。其后多糖提高率降低其原因可能是接種量過大培養(yǎng)基消耗加快，菌體快速進(jìn)入穩(wěn)定和衰亡期[24]。其中，生物量在接種量4%時(shí)最大，繼續(xù)增加接種量，生物量稍有下降但是不明顯，多糖提高率在接種量8%時(shí)最大為（70.75±2.53）%。以多糖提高率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇最佳接種量為8%。

圖6 接種量對(duì)多糖提高率的影響Fig.6 Effect of inoculum on the increase rate of polysaccharide

2.1.7 發(fā)酵時(shí)間的確定

一般來說，菌體的生長(zhǎng)包括延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期及衰老期四個(gè)階段。改變發(fā)酵時(shí)間，考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵后多糖提高率及生物量的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，多糖提高率和生物量先升高后降低。生物量和多糖提高率在第4天達(dá)到最大，說明菌體在對(duì)數(shù)期結(jié)束時(shí)產(chǎn)糖最高，后開始逐步降低。發(fā)酵到第4天時(shí)多糖提高率最大達(dá)（64.56±2.25）%，之后開始逐步降低，其原因可能為前4天菌體產(chǎn)生的多糖大于菌體生長(zhǎng)所消耗的多糖；4 d后，多糖消耗速率大于生產(chǎn)速率，多糖提高率開始逐步降低，因此選擇發(fā)酵時(shí)間為4 d。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖提高率的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the increase rate of polysaccharide

2.1.8 發(fā)酵溫度的確定

適合的發(fā)酵溫度是保證靈芝菌的生長(zhǎng)活性和產(chǎn)酶的必要條件。發(fā)酵溫度過高或過低都會(huì)抑制靈芝菌的生長(zhǎng)活性和產(chǎn)酶，設(shè)置不同發(fā)酵溫度，考察不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵后多糖提高率及生物量的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，靈芝菌適合生長(zhǎng)發(fā)酵溫度是28～30 ℃，在此溫度范圍內(nèi)多糖提高率逐漸升高，生物量趨于平緩，超過30 ℃后靈芝菌生物量和多糖增長(zhǎng)率顯著降低[25]。且在30 ℃時(shí)靈芝菌多糖提高率最高達(dá)（64.56±2.55）%，故選擇30 ℃作為發(fā)酵溫度。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)多糖提高率的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on the increase rate of polysaccharide

2.2 Packett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

該試驗(yàn)考慮到用多糖提高率做指標(biāo)能更好的反應(yīng)靈芝菌利用玉竹釋放多糖的效果，故PB試驗(yàn)以多糖提高率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果顯著性分析Table 4 Significance analysis of Plackett-Burman experiment results

根據(jù)表4所列的顯著性分析結(jié)果可知，7個(gè)影響因子的顯著性排序?yàn)閄7（發(fā)酵時(shí)間）＞X5（接種量）＞X1（玉竹添加量）＞X2（豆粕添加量）＞X6（發(fā)酵溫度）＞X3（KH2PO4添加量）＞X4（MgSO4·7H2O添加量）。且X7（發(fā)酵時(shí)間）、X1（玉竹添加量）、X5（接種量）3個(gè)因子在7個(gè)因子中對(duì)多糖提高率影響顯著（P＜0.05）。因此確定接種量、玉竹添加量、發(fā)酵時(shí)間這3個(gè)因子進(jìn)行下一步的最陡爬坡試驗(yàn)。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

據(jù)表4的Packett-Burman試驗(yàn)結(jié)果篩選得出接種量、發(fā)酵時(shí)間、玉竹添加量為3個(gè)對(duì)多糖提高率影響顯著的因子，參考表4的3個(gè)因子的效應(yīng)值可知，3個(gè)因素的效應(yīng)均為負(fù)值。因此在最陡爬坡試驗(yàn)中3個(gè)因素都從1水平開始逐步降低。其余4個(gè)影響不顯著的因素根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行設(shè)置。最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，試驗(yàn)2多糖提高率最高，即接種量為8%、玉竹添加量為6%、發(fā)酵時(shí)間為4 d，因此選擇第2組試驗(yàn)作為Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiment

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果

在Packett-Burman試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，在最陡爬坡試驗(yàn)所確定的區(qū)域內(nèi)，以多糖提高率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析，結(jié)果如表6、表7所示。

運(yùn)用Design-Expert 12.0軟件對(duì)表6各因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合后，得到響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模擬方程：Y=77.73-4.62A+2.74B-8.86C-17.28AB-2.69AC-10.18BC-36.56A2-14.99B2-23.90C2。

表6 發(fā)酵產(chǎn)多糖條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of polysaccharide production

由表7方差分析結(jié)果可知，模型P＜0.000 1，說明模型差異性極顯著，其中，C、AB、A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.000 1），BC對(duì)響應(yīng)值的影響較顯著（P＜0.01），A、B對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05），其余因素均不顯著（P＞0.05）模型的決定系數(shù)R2=0.995 6，說明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好；校正決定系數(shù)R2adj=0.989 8，說明該模型能解釋98.98%響應(yīng)值的變化。模型失擬項(xiàng)P=0.056 9＞0.05，不顯著，表明模型符合實(shí)際情況，綜合以上結(jié)果表明可以用此模型對(duì)多糖提高率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表7 回歸模型方差分析結(jié)果Table 7 Variance analysis results of regression model

2.4.2 各因素之間的交互作用結(jié)果分析

通過Design-Expert 12軟件得到接種量、發(fā)酵時(shí)間和玉竹添加量3個(gè)因子之間的模型響應(yīng)曲面圖如圖9所示。由圖9可知，所有響應(yīng)面圖形坡面陡峭，方程的拋物線圖形開口向下，說明存在最大值，響應(yīng)面覆蓋最大值所在區(qū)域。玉竹添加量，接種量，發(fā)酵時(shí)間交互作用強(qiáng)弱的順序?yàn)锳B＞BC＞AC。

圖9 各因素交互作用對(duì)多糖提高率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the increase rate of polysaccharide

2.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化及模型驗(yàn)證

回歸模型預(yù)測(cè)的最佳結(jié)果為：玉竹添加量5.884%，接種量8.7%，發(fā)酵時(shí)間4.261 d，此條件下多糖提高率理論值為72.5%。為方便實(shí)際操作對(duì)發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行修正，修改發(fā)酵工藝為：玉竹添加量6%，接種量8.7%，發(fā)酵時(shí)間4 d。重復(fù)3次試驗(yàn)，取平均值，此條件下多糖提高率實(shí)際值為73.48%。實(shí)際值與理論值無顯著性差異，表明該模型可靠有良好的準(zhǔn)確性。

2.5 靈芝菌發(fā)酵玉竹液的體外抗氧化能力

測(cè)定DPPH自由基，羥基自由基和ABTS自由基的清除率，以VC為陽性對(duì)照，表征發(fā)酵前后多糖的抗氧化能力，結(jié)果見圖10。從圖10可以看出，清除DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基能力均隨著多糖含量的增加而增加。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，對(duì)自由基的清除率最大。其中VC的自由基清除率最強(qiáng)。PBF對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基和羥基自由基和清除率分別為（25.97±0.93）%、（45.21±1.13）%、（77.39±1.93）%，PAF對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為（34.13±0.88）%、（52.77±3.14）%、（89.40±0.52）%，PAF對(duì)DPPH和羥基自由基的半抑制濃度（IC50）為分別為2.77 mg/mL，0.54 mg/mL，PBF對(duì)DPPH和羥基自由基的半抑制濃度（IC50）為分別為7.94 mg/mL，1.57 mg/mL其結(jié)果表明PAF的抗氧化能力顯著強(qiáng)于PBF，其原因可能是，玉竹中的玉竹多糖經(jīng)靈芝菌發(fā)酵可能形成了多種分子質(zhì)量較小的多糖。

圖10 發(fā)酵前后多糖的體外抗氧化活性Fig.10 Antioxidant activities in vitro of polysaccharide before and after fermentation

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)靈芝菌發(fā)酵玉竹產(chǎn)多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳工藝為：玉竹6%，豆粕2%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，接種量8.7%，發(fā)酵時(shí)間4 d，發(fā)酵溫度30 ℃。在此條件下，多糖含量達(dá)到5.91 mg/mL，較未發(fā)酵的培養(yǎng)基3.41 mg/mL提高了73.48%?？寡趸囼?yàn)表明，在相同濃度下，發(fā)酵后多糖的ABTS+·、DPPH·、OH·清除率均有所提高。該研究為玉竹功能性產(chǎn)品的開發(fā)與其工業(yè)發(fā)酵提供一定參考。