王 爍，季海蕊，曹慧瑩，趙 丹，3*

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；3.廣西民族大學(xué) 海洋與生物技術(shù)學(xué)院 廣西多糖材料與改性重點實驗室，廣西 南寧 530008）

β-1,4-D-甘露聚糖酶（以下簡稱甘露聚糖酶），是一種胞外水解酶，能水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中的1,4-D-甘露糖苷鍵[1]。甘露聚糖酶廣泛存在動物、植物和微生物中，其中微生物甘露聚糖酶因來源豐富，活性高、成本低、易提取等特點[2]，廣泛應(yīng)用于采油、鉆井、造紙以及食品領(lǐng)域的果汁澄清、動物飼料、釀造和益生元制備等行業(yè)[3-5]。產(chǎn)酶微生物包括芽孢桿菌屬（Bacillus）[6]、青霉菌屬（Penicillium）[7]和鏈霉菌屬（Streptomyces）[8]等，但受生物安全性的限制，常用產(chǎn)酶菌株已無法滿足食品領(lǐng)域?qū)Ω甙踩悦溉找嬖鲩L的需求。

目前報道能產(chǎn)酶的乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）種屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）[1，9-13]，因LAB作為公認安全性（generally regarded as safe，GRAS）菌株[9]的特性，為甘露聚糖酶在醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)的應(yīng)用提供了安全來源[14-16]。但受產(chǎn)酶水平低的限制，挖掘新的產(chǎn)酶乳酸菌并優(yōu)化提高產(chǎn)酶能力，是高生物安全性食品級甘露聚糖酶研究的熱點。

本研究鑒定了課題組先前分離的產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株3MP-5-3，結(jié)合Placket Burman（PB）設(shè)計和中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）優(yōu)化供試菌株產(chǎn)甘露聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，并探索供試菌株甘露聚糖粗酶液在果汁澄清的應(yīng)用潛力。本研究旨在豐富乳酸菌甘露聚糖酶菌株的來源，為甘露聚糖酶在安全性要求更高的食品領(lǐng)域進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株3MP-5-3：分離自東北酸菜發(fā)酵液，保藏于黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室。

魔芋粉：四川新星魔芋粉廠；角豆膠（CAS：9000-40-2）：美國Sigma Alrich公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（DP302-02）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209-02）：TIANGAN股份有限公司；API50CHL鑒定試劑條（OT-50410）：法國生物梅里埃公司。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母浸粉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸銨2 g/L，無水亞硫酸鈉0.1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 mL；pH 5.5；121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-1920UV型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；MLS-3780型蒸汽壓力滅菌鍋：日本三洋電子有限公司；BX43生物顯微鏡：奧林巴斯（深圳）工業(yè)有限公司；XTS20型連續(xù)變倍體視顯微鏡：北京福凱儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

取-80 ℃冰箱內(nèi)保藏菌種，以2%（V/V）接種量接種于100 mL/250 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min培養(yǎng)至細胞濃度為1×108個/mL的種子液。

1.3.2 菌株鑒定

利用體視鏡和顯微鏡觀察菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)[17]。

利用API 50 CHL鑒定試劑條對菌株進行糖發(fā)酵試驗的鑒定[18]。

按照姜靜等[19]的方法，利用細菌基因組DNA提取試劑盒，提取產(chǎn)甘露聚糖酶乳酸菌基因組DNA。選擇16S rDNA通用引物上游（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和下游（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR條件為95 ℃變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物完成瓊脂糖凝膠電泳1.0%后使用DNA純化回收試劑盒回收目的片段并測序。根據(jù)美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫對序列同源性進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析。利用MEGA 5.0軟件根據(jù)序列同源性選擇不同的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 酶活測定

取種子液，以2%（V/V）接種量接種于100 mL/250 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液后，8 000 r/min離心15 min，獲得粗酶液。以溶解在50 mmol/L醋酸-乙酸鈉緩沖液中，pH 4.0的5 g/L角豆膠為底物，3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定甘露聚糖酶酶活[20]。酶活性單位定義：每分鐘產(chǎn)生1 μmol甘露糖所需的酶量（U/mL）。

1.3.4 PB試驗設(shè)計

以PB試驗設(shè)計模型，優(yōu)化甘露聚糖酶的酶活。根據(jù)單因素試驗結(jié)果[21]，篩選出對甘露聚糖酶酶活有顯著影響的7個因素，分別是角豆膠、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏、檸檬酸銨、初始pH值，按照表1所示設(shè)計每個變量的水平。

表1 PB試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of PB tests design

1.3.5 中心組合設(shè)計

采用KAMMOUN R等[22]所述的包含每個變量的個體效應(yīng)和交叉效應(yīng)的二階多項式回歸方程擬合試驗數(shù)據(jù)，確定最優(yōu)自變量的預(yù)測。以PB設(shè)計確定影響β-甘露聚糖酶酶活（Y）的3個最顯著因子（角豆膠、酵母提取物、初始pH值）為自變量采用響應(yīng)面試驗的CCD設(shè)計進行優(yōu)化。如表2所示3個自變量在5個不同的水平（-1.68，-1，0，+1，+1.68），進行研究。利用CCD預(yù)測的最佳條件重復(fù)6次發(fā)酵試驗，比較試驗值與模型預(yù)測值，驗證模型的有效性。

表2 中心組合試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite tests design

1.3.6 果汁的出汁率及澄清度

選取蘋果、橙子、桃子、柿子和藍靛果洗凈、晾干、制成勻漿用于制備果汁。按照NADAROGLU H[12]的方法檢測粗酶液對果汁出汁率的影響。10 g水果樣品勻漿中加入2 mL酶溶液，在60 ℃、pH 7.0條件下反應(yīng)1 h，四層紗布過濾15 min，測定獲得的果汁體積，計算最終出汁率。以蒸餾水為對照，紫外-可見分光光度計在660 nm波長處測定OD660nm值，以透光率百分比（%）來表示澄清度。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗處理設(shè)置3個重復(fù)，數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”表示。采用JMP 9.0.2軟件進行方差分析和試驗數(shù)據(jù)的多重比較。統(tǒng)計學(xué)檢驗的顯著性水平設(shè)置為P＜0.01和P＜0.05，分別表示差異極顯著和顯著。采用Design Expert 8.0.5進行響應(yīng)面試驗設(shè)計和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株鑒定

菌株的菌落形態(tài)結(jié)果（圖1）表明，菌株3MP-5-3菌落為圓形，乳白色。菌體呈桿狀，大?。?.4～0.6）μm×（1.8～2.0）μm。

圖1 菌株3MP-5-3的菌落形態(tài)（10×）（a）和掃描電鏡形態(tài)（b）Fig.1 Colony morphology (10×) (a) and scanning electron microscope morphology (b) of strain 3MP-5-3

糖發(fā)酵試驗結(jié)果（表3）表明，菌株3MP-5-3可以利用D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖及D-甘露糖等，而不能利用甘露醇、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖及D-乳糖等，發(fā)酵特征與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）最為相似，為97.8%。

表3 菌株3MP-5-3的糖發(fā)酵試驗結(jié)果Table 3 Results of carbohydrate fermentation of strain 3MP-5-3

菌株3MP-5-3基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖2。部分序列長度1 457 bp，GenBank登錄號：MT658743。Blast比對結(jié)果顯示，該菌株與L.casei050（JN560851）16SrDNA部分序列相似性最高，達到99.72%。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA基因序列比對，菌株3MP-5-3鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株3MP-5-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain 3MP-5-3 based on 16S rDNA gene sequences

2.2 PB設(shè)計結(jié)果

PB試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，回歸分析結(jié)果見表5。由表5可知，模型P值為0.032 1＜0.05，表明模型對結(jié)果影響顯著，觀測值和預(yù)測值之間存在可接受的相關(guān)性。7個因素中角豆膠、酵母提取物和初始pH值3個因素P值分別為0.023 0、0.031 1和0.006 2均＜0.05，表示對酶活有顯著影響。角豆膠、酵母提取物和初始pH值3個因素的回歸分析系數(shù)為正，對酶活為正效應(yīng)。且決定系數(shù)R2=0.932 3，調(diào)整決定系數(shù)R2=0.813 9，精密度9.560 8，表明所得模型能夠較好的擬合試驗數(shù)據(jù)。根據(jù)PB試驗設(shè)計結(jié)果將角豆膠、酵母提取物、初始pH值三個影響因素用于后續(xù)試驗。

表4 PB試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of PB tests

表5 PB試驗回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of PB test regression model

2.3 中心組合試驗設(shè)計結(jié)果

CCD設(shè)計及結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。由回歸分析（表7）可知，模型的P值為0.000 2＜0.01極顯著，其中X7、X12、X32、X72對酶活影響達到極顯著水平（P＜0.01），R2為0.937 2接近1，說明預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性。以上結(jié)果表明模型擬合程度高，可信度高。

表6 中心組合設(shè)計試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of central combination design tests

表7 中心組合設(shè)計試驗回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of central combination design test regression model

所得數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，變量為編碼水平時，擬合得二次方程為：

式中二次項系數(shù)均為負，可知該方程擬合的曲面開口朝下，方程有極大值。因此當各因素X1、X3和X7編碼水平分別為-0.102、-0.595和0.566時，即角豆膠、酵母提取物和初始pH值分別為5.69 g/L、5.22 g/L和6.10時，方程有極大值，酶活為75.59 U/mL。

2.4 響應(yīng)面交互作用分析

角豆膠、酵母提取物、初始pH值3個影響因素之間的交互作用對酶活的影響的響應(yīng)面及等高線見圖3。其中在角豆膠（4～8）g/L、酵母提取物（4～10）g/L和初始pH值6左右的條件下，甘露聚糖酶活性不斷增加。當角豆膠、酵母提取物和初始pH值分別為5.69 g/L、5.22 g/L和6.10時，最大酶活預(yù)測值為75.59 g/L。根據(jù)模型優(yōu)化結(jié)果和實際條件結(jié)合，設(shè)置初始pH值6.1，角豆膠5.70 g/L和酵母提取物5.20 g/L。在此條件下做驗證試驗，重復(fù)6次，甘露聚糖酶酶活的平均實際值為（75.83±0.31）U/mL，與預(yù)測值較吻合，結(jié)果與優(yōu)化前相比提高了1.17倍。

圖3 各因素間交互作用對干酪乳桿菌3MP-5-3甘露聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.3 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on mannanase activity of Lactobacillus casei 3MP-5-3

2.5 L.casei 3MP-5-3甘露聚糖酶對果汁澄清的影響

因為果汁具有較高的黏度和渾濁度，生產(chǎn)果汁是一個非常復(fù)雜的過程且需要很高的成本[23]。利用酶制劑處理果汁原料以提高果汁澄清度已得到業(yè)界的認可并得到廣泛應(yīng)用。甘露聚糖酶水解果汁中的甘露聚糖降低黏度的同時提高產(chǎn)量[24]。將L.casei3MP-5-3產(chǎn)的甘露聚糖酶應(yīng)用于蘋果、橙子、桃子、柿子和藍靛果的果汁生產(chǎn)，試驗結(jié)果見表8。

表8 干酪乳桿菌3MP-5-3甘露聚糖酶對果汁澄清的影響Table 8 Effect of mannanase produced by Lactobacillus casei 3MP-5-3 on fruit juice clarification

由表8可知，甘露聚糖酶對果汁澄清效果和出汁率均有促進作用，其中與離心組相比，柿子汁澄清效果最好，提高了20.8%，其次是蘋果汁，提高了14.3%。而五種水果出汁率中，蘋果出汁效果最好，提高35.6%，橙子次之。此外，L.casei3MP-5-3甘露聚糖酶對蘋果、橙子和桃子果汁出汁率的提高明顯優(yōu)于綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens）LB37[11]。并且L.casei3MP-5-3甘露聚糖酶對于柿子、蘋果和桃子果汁的澄清度酶處理組比對照組分別提高了19.9%、20.5%和18.9%，而陳偉等[25]發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶使得柿子、蘋果和桃子果汁澄清度分別提高了31.8%、7.0%和4.0%。因此除柿子汁外，L.casei3MP-5-3甘露聚糖酶蘋果和桃子果汁澄清度的提高程度要大于通過嗜熱甘露聚糖酶畢赤酵母工程菌表達的甘露聚糖酶。重要的是，利用LAB具有生物安全性的優(yōu)勢，本研究無需對L.casei3MP-5-3進行異源表達，獲得粗酶操作更簡單，成本更低。

3 結(jié)論

本研究鑒定出一株產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株3MP-5-3為L.casei。通過響應(yīng)面法優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件為角豆膠5.69 g/L、酵母提取物5.22 g/L、葡萄糖8.00 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、檸檬酸銨3.0 g/L、1 mL吐溫80和初始pH值6.1。在此優(yōu)化條件下，甘露聚糖酶酶活為（75.83±0.31）U/mL，是優(yōu)化前的1.17倍。此外，粗酶液對蘋果、橙子、桃子、柿子和藍靛果5種水果的果汁出汁率和澄清度的提高均高于離心組，與其他5種乳酸菌結(jié)果相似，且對蘋果桃子的出汁率影響為最優(yōu)。該結(jié)果表明L.casei3MP-5-3粗甘露聚糖酶在果汁澄清具有經(jīng)濟、簡便的應(yīng)用潛力，也為乳酸菌甘露聚糖酶在其他食品級領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的理論指導(dǎo)。