王 英，張 會，劉小莉，施亞萍，夏秀東，周劍忠

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京市脆而爽蔬菜食品有限公司，江蘇 南京 211225）

豇豆適應(yīng)性廣，是廣泛栽培的大眾化蔬菜之一，其產(chǎn)量高達22 500～45 000 kg/hm2。對鮮食期短的豇豆進行加工可提高豇豆種植產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。豇豆的加工方式主要包括腌制、脫水和制備飲料，經(jīng)過腌制的豇豆具有多種營養(yǎng)和保健作用[1-2]。傳統(tǒng)腌制蔬菜一般是利用高含量（＞10%）食鹽腌制，再經(jīng)脫鹽、脫水、調(diào)味等一系列工序制成。但是，高食鹽含量給食用者的心臟、腎臟等帶來負面影響，易引起心臟病、高血壓等心腦血管疾病，不利于人體的健康[3-5]。為順應(yīng)飲食低鹽化需求，利用淺漬發(fā)酵法（鹽含量＜10%，發(fā)酵時間＜10 d）制備的發(fā)酵蔬菜[6]，既能一定程度上保留蔬菜的新鮮度，又具備經(jīng)發(fā)酵等生化反應(yīng)產(chǎn)生的與新鮮蔬菜不同的特殊風(fēng)味，同時不會因高鹽攝入而有害健康。

發(fā)酵劑對發(fā)酵食品口感和風(fēng)味有著重要的影響。王玉瑋等[7]對雪蓮菌發(fā)酵豇豆的工藝及其揮發(fā)性風(fēng)味進行分析，結(jié)果表明，接種雪蓮菌發(fā)酵豇豆能夠增加揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量，且感官評分也增加。陳鳳等[8]對不同發(fā)酵方式對泡豇豆品質(zhì)影響的研究結(jié)果表明，自然發(fā)酵及直投式發(fā)酵三種發(fā)酵方式對豇豆品質(zhì)影響不同，其中直投式發(fā)酵劑發(fā)酵豇豆的品質(zhì)較好。李雨萌等[9]對老壇水和兩種接種發(fā)酵方式對豇豆的揮發(fā)性成分進行研究，結(jié)果表明，兩種發(fā)酵劑中的菌組成不同，其發(fā)酵豇豆中的風(fēng)味物質(zhì)種類和組成存在明顯差異。蔬菜、奶、肉等發(fā)酵制品因其特殊的發(fā)酵風(fēng)味和營養(yǎng)受到消費者的喜愛，發(fā)酵劑對風(fēng)味的影響也是研究熱點，固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術(shù)是檢測發(fā)酵食品揮發(fā)性成分的主要分析方法[10-12]。電子舌技術(shù)具有檢測時間短、操作簡單、靈敏度高、可靠性強等特點，被廣泛應(yīng)用于食品和飲料領(lǐng)域[13-14]，劉建林等[15]利用GC-MS結(jié)合電子舌技術(shù)分析發(fā)酵羊肉干的風(fēng)味成分，共檢測出主要貢獻物質(zhì)有27種，但不同發(fā)酵品種的主要風(fēng)味物質(zhì)組成不同。潘曉倩等[16]綜合利用GC-MS 技術(shù)和電子鼻/電子舌技術(shù)分析不同微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干香腸風(fēng)味形成及滋味的影響，結(jié)果顯示不同微生物發(fā)酵劑可以明顯區(qū)分香腸。本研究接種不同發(fā)酵劑淺漬發(fā)酵豇豆，利用GC-MS 和電子舌分析技術(shù)分析其揮發(fā)性風(fēng)味成分及滋味特征，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）解析不同發(fā)酵劑對淺漬豇豆的風(fēng)味成分和滋味的影響，為淺漬豇豆發(fā)酵制品接種發(fā)酵劑工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及原料

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SD-7、FM-LP-9凍干菌粉：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室；豇豆、泡菜鹽、八角、冰糖、花椒、辣椒：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

氯化鈣（分析純）：濰坊海之源化工有限公司；檸檬酸、抗壞血酸（均為分析純）：鄭州天潤食品添加劑有限公司；NaCl（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體（固體）培養(yǎng)基：青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1C型凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；TSQ 8000 EVO氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析儀：美國熱電公司；SA402B電子舌：日本INSENT公司；固相微萃取纖維DVB/CAR/PDMS：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 淺漬豇豆發(fā)酵工藝流程及操作要點

豇豆挑選清洗→晾曬→淺漬液制備（按照配方加入泡菜鹽、辣椒等調(diào)味料）→接種發(fā)酵→殺菌→冷卻→淺漬豇豆

本實驗中,我們采集了1 200多張票據(jù)的數(shù)字圖像,進行了水印的多重加密。我們在構(gòu)造特征時,重點考慮針對灰度圖像的特征構(gòu)造,將普通的圖像進行差分特征的分析,根據(jù)縱向以及橫向的一階和二階差分特征,與原圖圖像構(gòu)成5通道的圖像輸入特征。

操作要點：1 L水加入45 g泡菜鹽、2 g 花椒、1 g八角，30 g冰糖和30 g蔗糖，煮沸后保溫10 min，降至室溫作為淺漬液，接種發(fā)酵前加入0.15%的氯化鈣作為保脆劑，同時加入0.05%的檸檬酸和0.03%的抗壞血酸作為復(fù)合護色劑。按照淺漬液和豇豆的質(zhì)量比為4∶3加入晾曬完畢的豇豆，采用單獨接種植物乳桿菌Lactobacillus plantarumSD-7、菌株FM-LP-9凍干菌粉、菌株SD-7與FM-LP-9混菌（1∶1）發(fā)酵和自然發(fā)酵4種方式，接種量為5‰，在25 ℃的條件下發(fā)酵至pH值為3.5左右時結(jié)束發(fā)酵[17]，殺菌（65 ℃、30 min）后冷卻至室溫，即得淺漬豇豆成品。

1.3.2 電子舌分析

取發(fā)酵結(jié)束的200 g豇豆和發(fā)酵液按照質(zhì)量比1∶1打漿后，漿液于5 000 r/min 條件下離心5 min，收集上清液進行電子舌分析。

ISENSO 電子舌系統(tǒng)可對酸、甜、苦、咸、鮮等基本味或復(fù)合味進行客觀測定。使用前先將檢測電極和參比電極進行活化24 h，參比溶液為氯化鉀和酒石酸的混合溶液。再用潔凈的蒸餾水清洗2～3 min，每次測樣前都需清洗，將樣品倒入電子舌的專用燒杯，定量體積為50 mL，采樣時間為180 s，為減小測量誤差，每個樣品平行測定5 次，取3次相似測數(shù)值作為一個樣本數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析[18-19]。

1.3.3 香氣成分測定方法

SPME方法：取發(fā)酵結(jié)束的100 g豇豆和發(fā)酵液按照質(zhì)量比1∶1打漿后，取10 g漿液于20 mL樣品瓶中，加入0.15 g NaCl，磁力攪拌，60 ℃恒溫水浴20 min，固相微萃取纖維DVB/CAR/PDMS萃取50 min，于230 ℃脫附3 min進樣。

GC條件：DB-5 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.1 μm），載氣為氦氣（He）（99.99%），流速1.0 mL/min。進樣口溫度230 ℃，不分流進樣。程序升溫：初溫35 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，氣相色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～550 m/z[20-21]。

定性定量方法：按上述分析條件對香氣成分進行氣相色譜-質(zhì)譜分析，將各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖利用美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）及WILEY兩個譜庫，對質(zhì)譜圖進行串連檢索，與有關(guān)文獻進行核對，并結(jié)合人工解析，綜合保留時間、質(zhì)譜、實際成分和保留指數(shù)等參數(shù)對組分進行定性。采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量。

1.3.4 主成分分析

采用Z-score 標準化法進行原始數(shù)據(jù)無量綱化處理后，利用主成分分析提取因子，計算各發(fā)酵豇豆樣品風(fēng)味物質(zhì)分類數(shù)據(jù)的特征值以及方差貢獻率。采用因子所對應(yīng)的方差貢獻率為權(quán)重，最后將因子得分和對應(yīng)的權(quán)重系數(shù)進行加權(quán)求和，計算得到各發(fā)酵豇豆樣品的綜合得分。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析和主成分分析（PCA），利用Excel 2016進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵劑淺漬發(fā)酵豇豆的揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

不同發(fā)酵劑淺漬發(fā)酵豇豆通過GC-MS 分析后，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和相對含量檢測結(jié)果見表1。由表1可知，4組發(fā)酵豇豆中共檢測出主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)76種，主要包括酸類5種，醛類8 種，酯類15 種，醇類26 種，酮類9種，烯類物質(zhì)2種，醚類4種和其他類7 種，淺漬豇豆中主要揮發(fā)性風(fēng)物質(zhì)為醇類、酯類、酮類、醛類和酸類物質(zhì)，其中醇類和醚類兩類風(fēng)味物質(zhì)總相對含量占總量的50%以上，在醇類物質(zhì)中，3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇為主要成分，尤其是在接種發(fā)酵的豇豆中，相對含量＞17%。醚類物質(zhì)中的對丙烯基茴香醚是主要風(fēng)味物質(zhì)，該物質(zhì)可能主要來自于淺漬液中的八角。由表1亦可知，自然發(fā)酵豇豆中檢測出44種風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類12種，醚類3種，酸類2種，酮類6種，酯類9種，烯類1種，醛類5種和其他類6種，占總風(fēng)味物質(zhì)相對含量的83.36%。接種植物乳桿菌SD-7和FM-LP-9單菌發(fā)酵的豇豆的風(fēng)味物質(zhì)均檢測出47種風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類分別為9種和10種，醛類分別為7種和6種，酮類均為6種，烯類均為2種，醇類分別為16種和17種，醚類均為3種，酸類均為1種和其他類分別為3和2種，但風(fēng)味物質(zhì)組成不同，其中，菌株SD-7發(fā)酵豇豆風(fēng)味物質(zhì)中占總風(fēng)味物質(zhì)相對含量5%以上的有以下幾種：醇類物質(zhì)、醚類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、醛類物質(zhì)和酯類物質(zhì)，占總風(fēng)味物質(zhì)相對含量的94.71%。菌株FM-LP-9發(fā)酵豇豆風(fēng)味物質(zhì)中占總風(fēng)味物質(zhì)相對含量5%以上的有以下幾種：醇類物質(zhì)、醚類物質(zhì)和烯類物質(zhì)，占總風(fēng)味物質(zhì)相對含量的84.17%。兩菌混合（1∶1）接種淺漬發(fā)酵的豇豆中檢測出59種，其中酯類13種，醛類8種，烯類1種，酮類8種，醇類19種、醚類3種、酸類4種和其他類3種，比自然發(fā)酵和單菌發(fā)酵的豇豆中風(fēng)味物質(zhì)分別增加了15和12種。組合接種發(fā)酵豇豆風(fēng)味物質(zhì)中占總風(fēng)味物質(zhì)相對含量5%以上的有以下幾種：醇類物質(zhì)、醚類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、醛類物質(zhì)、酯類物質(zhì)和烯類物質(zhì)，占總風(fēng)味物質(zhì)相對含量的98.19%。結(jié)果表明，不同發(fā)酵劑對淺漬豇豆的風(fēng)味影響不同，復(fù)合接種可以提高發(fā)酵豇豆的風(fēng)味物質(zhì)的種類。目前發(fā)酵劑主要有單一菌種和復(fù)合菌種兩種形式，其中復(fù)合菌制劑是將兩種或兩種以上的菌株混合制成，具有更加全面的發(fā)酵效果[22]。王聰?shù)萚23]利用復(fù)合菌種協(xié)同發(fā)酵制備雞肉香精，結(jié)果顯示在相同的工藝條件下，復(fù)合發(fā)酵制備的產(chǎn)品感官評分更高，且氨基酸態(tài)氮含量最大。SUN Q等[24]利用復(fù)合菌制劑發(fā)酵香腸，結(jié)果顯示復(fù)合菌制劑能夠充分利用原料，提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值、改善產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。綜上，接種不同的發(fā)酵劑，豇豆的風(fēng)味物質(zhì)組成和含量均存在不同程度的差異，且復(fù)合發(fā)酵可提高發(fā)酵豇豆中風(fēng)味物質(zhì)的種類。

續(xù)表

2.2 不同發(fā)酵劑淺漬豇豆的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

發(fā)酵食品中風(fēng)味物質(zhì)種類和含量數(shù)據(jù)繁多，利用SPSS 18.0將風(fēng)味物質(zhì)重新組合一組新的相互無關(guān)的幾個綜合變量，從中抽取幾個較少的綜合變量盡可能多地反映原來變量信息的統(tǒng)計方法，可以獲得對風(fēng)味影響的主成分及其貢獻率[25-27]。本研究中4種淺漬豇豆的風(fēng)味物質(zhì)經(jīng)SPSS 18.0軟件分析，獲得的主成分特征值及方差貢獻率，結(jié)果見表2。

表2 主成分的特征值以及方差貢獻率Table 2 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

由表2可知，第1主成分和第2主成分的特征值依次為5.180和1.911，其累計方差貢獻率達88.632%，能夠較好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息[28]。第1主成分（PC1）的方差貢獻率為64.748%，主要反映醚類、酮類、醛類、酯類、酸類和其他物質(zhì)的變異信息，第2主成分（PC2）的方差貢獻率為22.885%，主要反映醇類、醚類、酮類、醛類、酯類、烯類和酸類物質(zhì)的變異信息。

載荷值可以反映各變量與主成分之間的相關(guān)系數(shù)[29]，第1和第2主成分的特征向量與載荷矩陣見表3。

表3 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 3 Eigenvectors and loading matrices of principal components

由表3可知，第1主成分與酮類、醛類和醇類呈現(xiàn)正相關(guān)，與醚類、酯類、酸類和其他類呈負相關(guān)。第2主成分與醇類、醚類、烯類物質(zhì)呈正相關(guān)，與酮類、醛類、酯類、酸類和其他物質(zhì)呈負相關(guān)。

根據(jù)淺漬豇豆中的8類特征風(fēng)味成分在PC1、PC2中的得分和載荷，繪制主成分因子得分圖和載荷圖見圖1。由圖1A可知，PC1方差貢獻率大于PC2，說明4種淺漬豇豆的風(fēng)味在PC1 成分上反映明顯。PC1主成分中4種發(fā)酵方式分成2組，接種發(fā)酵和自然發(fā)酵可以完全區(qū)分開，并且接種SD-7發(fā)酵和接種SD-7和FM-LP-9混菌發(fā)酵在PC1和PC2都完全聚為一類，表明兩者的發(fā)酵風(fēng)味特征類似，另外也表明發(fā)酵劑SD-7對豇豆的發(fā)酵風(fēng)味特征起主導(dǎo)作用。由圖1B可知，PC1中的8 類風(fēng)味成分在得分投影圖中聚為4 簇，酯類、酸類和其他類聚為一簇；醚類和烯類物質(zhì)聚為一簇；酮類和醛類聚為1簇；說明PC1的8類風(fēng)味成分對淺漬豇豆的整體風(fēng)味品質(zhì)的影響作用可分為4 種，并且酯類、酸類、其他類物質(zhì)和醇類物質(zhì)對風(fēng)味貢獻大。PC2中的8 類風(fēng)味成分對淺漬豇豆的整體風(fēng)味品質(zhì)也存在3 種影響，酯類、酸類和其他類物質(zhì)聚為一類，酮類和醛類物質(zhì)聚為一類，醚類一類，且醚類、酮類和醛類物質(zhì)對風(fēng)味貢獻較大。

圖1 不同發(fā)酵劑淺漬發(fā)酵豇豆風(fēng)味物質(zhì)主成分分析因子得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.1 Factor score diagram (A) and loading diagram (B) of principal component analysis of flavor substances of low-salt curing cowpea fermented with different starters

2.3 不同發(fā)酵劑淺漬豇豆滋味的電子舌分析

根據(jù)4 組淺漬豇豆在電子舌的5個（酸味、鮮味、咸味、苦味和澀味）傳感器上的響應(yīng)值繪制出雷達圖2。由圖2可知，咸味傳感器對各組發(fā)酵豇豆樣品的響應(yīng)值最大，鮮味、豐富度（鮮的回味）、澀味和澀回味傳感器的響應(yīng)值基本一致。在酸味、澀味、苦味和苦回味的響應(yīng)值上存在差異，自然發(fā)酵豇豆的酸味、澀味和苦味響應(yīng)值較接種發(fā)酵的響應(yīng)值大。綜上，接種發(fā)酵可以降低豇豆發(fā)酵產(chǎn)品的苦味、澀味和澀回味，最終提升發(fā)酵豇豆的滋味。

圖2 不同發(fā)酵劑淺漬發(fā)酵豇豆滋味電子舌分析雷達圖Fig.2 Radar map of taste of low-salt curing cowpea fermented with different starters by electronic tongue analysis

3 結(jié)論

本研究以豇豆為原料，采用單獨接種植物乳桿菌SD-7和FM-LP-9、兩菌按1∶1比例混合接種和自然發(fā)酵4種方式在相同發(fā)酵條件下發(fā)酵豇豆，分析不同發(fā)酵劑對淺漬豇豆風(fēng)味物質(zhì)和滋味的影響。GC-MS共檢測出淺漬豇豆風(fēng)味貢獻物質(zhì)76種，且各種風(fēng)味物質(zhì)的相對含量存在很大差異，其中混合接種發(fā)酵豇豆中檢測出59種，單獨接種2株菌的豇豆都檢測出47中，而自然發(fā)酵豇豆中檢測出44種，表明混合接種可以提高豇豆的風(fēng)味物質(zhì)種類。電子舌分析結(jié)果顯示，自然發(fā)酵豇豆的酸味、苦味和澀味影響值高于接種發(fā)酵，混菌發(fā)酵可提升豇豆滋味。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵可以增加豇豆的風(fēng)味物質(zhì)組成并且能夠改善滋味，可為混菌接種淺漬發(fā)酵豇豆工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。