李瑩瑩，李晉虎，劉曉東

0 引言

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，約80%的病例表現(xiàn)為膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma,GBM），其浸潤性強、惡性程度高、預后差，患者的平均生存期僅為15個月[1-2]。目前標準治療方案是手術聯(lián)合放療（radiotherapy,RT）和化療，但患者的總體生存率改善有限。隨著免疫治療在其他腫瘤治療中取得了突破性進展，在GBM中利用免疫治療同樣引起了學者們的興趣。然而由于GBM的高異質(zhì)性、低突變負荷、強大的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）及中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的天然防御系統(tǒng)——血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）使免疫治療在GBM的研究中仍處于起步階段[3-4]。已有證據(jù)表明，RT可誘導抗腫瘤免疫反應，為免疫治療提供新的靶點，在抗腫瘤治療中，可與免疫檢查點抑制劑發(fā)揮協(xié)同效應[5]。鑒于此，本文將著重描述放療對腫瘤微環(huán)境的影響及放療聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療對GBM的作用，以期尋找更適合的治療方案。

1 放射治療與膠質(zhì)母細胞瘤

1.1 放療

RT是治療惡性腫瘤的主要手段之一。目前基本放療技術包括常規(guī)放療（conventional radiotherapy,CRT）、三維適形放療（three dimensional conformal radiotherapy,3D-CRT）、調(diào)強放療（intensity-modulated radiotherapy,IMRT）和立體定向放療（stereotactic body radiotherapy,SBRT）。相關研究表明常規(guī)分割雖然可以達到治療效果，但也會帶來很多不良反應，而3D-CRT和IMRT相較于常規(guī)RT都可以提高生存率，減少不良反應，且IMRT比3D-CRT顯示出更好的目標覆蓋率[6]。SBRT通常被用于復發(fā)性GBM的治療，可減少治療體積并控制腫瘤生長以提高腫瘤患者的總體生存率[7]。

1.2 放療與免疫微環(huán)境

當腫瘤細胞暴露于RT的射線時，靶組織表型及周圍環(huán)境發(fā)生改變，使腫瘤細胞更易受到免疫反應的影響。首先，輻射可上調(diào)腫瘤細胞表面的MHCⅠ類分子、鈣網(wǎng)蛋白及FAS表面分子表達及高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）的釋放，同時可誘導CD8+細胞毒性T細胞識別并殺死腫瘤細胞，激活樹突細胞（dendritic cell,DC）并促進其對腫瘤細胞的吞噬作用，而FAS的表達則會進一步誘導細胞凋亡[8-9]；其次，輻射誘導腫瘤細胞死亡，可釋放抗原及一系列共刺激分子激活DC（輻射誘導釋放的抗原足以達到交叉呈遞所需的閾值）促進抗原交叉呈遞[10]?；罨腄C遷移到淋巴結，通過細胞溶質(zhì)和液泡途徑將抗原進行加工后加載到MHCⅠ類分子上[11]，進而交叉呈遞給CD8+T細胞。此外，由于抗原特異性免疫反應的誘導并不足以消滅腫瘤，需要克服外周耐受（主要為物理屏障）使適應性免疫細胞能夠浸潤至腫瘤。RT可通過三種不同的作用機制影響免疫細胞浸潤：黏附分子表達增加、趨化因子分泌及血管結構的改變[12-13]。第一種作用機制，RT通過誘導炎性細胞因子如白介素-1β、腫瘤壞死因子以及Ⅰ型和Ⅱ型干擾素，影響腫瘤內(nèi)皮上的血管細胞黏附分子1（intercellular adhesion molecules 1,ICAM-1）或自然殺傷細胞活化性受體（natural killer cell group 2D,NKG2D）配體的上調(diào)[14]。第二種作用機制，RT上調(diào)腫瘤細胞中的趨化因子（CXC基序）配體9（CXCL9）、-10和-16以促進T細胞募集到受照射的腫瘤中[12]。第三種作用機制，RT還可以改變血管表型，腫瘤通常表現(xiàn)出無組織的脈管系統(tǒng)，低劑量的RT可以使血管正常化，也可刺激血管生成，進而促進T細胞浸潤[15-16]。GBM相較于其他腫瘤，還有BBB的存在。相關研究表明RT可改變BBB，誘導其通透性增加，允許外周T細胞浸潤或進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，這對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療起到關鍵作用[17]。

從以上研究我們發(fā)現(xiàn)，將RT與免疫檢查點抑制劑結合，可以產(chǎn)生協(xié)同治療作用，從而對腫瘤產(chǎn)生抑制作用。這為RT聯(lián)合免疫治療提供了新思路。

2 放療聯(lián)合免疫檢查點分子對膠質(zhì)母細胞瘤的影響

單純RT治療對于膠質(zhì)母細胞瘤患者的生存改善微乎其微，因為RT不但可以促進免疫激活，還可以誘導免疫抑制。不同劑量輻射對抗腫瘤免疫反應產(chǎn)生不同影響，現(xiàn)有研究認為RT每次劑量超過10 Gy可以有效增強抗腫瘤免疫反應并為免疫治療提供相關靶點，但低劑量輻射可以誘導免疫抑制性TME[18]。研究發(fā)現(xiàn)，RT聯(lián)合不同免疫檢查點抑制劑治療的最佳時機各不相同。在評估放療和抗PD-1治療理想時機的報告中得出，相同劑量輻射情況下，同步治療優(yōu)于序貫治療。但在放療和抗CTLA-4的治療中發(fā)現(xiàn)，在單次20 Gy劑量輻射前7天給予聯(lián)合用藥最有效，而不是同步治療或在放療后給予用藥；而在同一模型中，放療后1天給予抗OX40藥物治療效果最佳[19]。這一結論在GBM治療中是否有效，需要我們進一步驗證，但據(jù)目前臨床前及臨床數(shù)據(jù)顯示，RT聯(lián)合免疫檢查點抑制劑對GBM具有積極的抗腫瘤作用[20]。

2.1 放療與CTLA-4

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）是第一個進入臨床的免疫檢查點受體，僅在T淋巴細胞上表達，主要調(diào)節(jié)T細胞活化早期階段的幅度，限制T細胞增殖，減少細胞因子的產(chǎn)生，并下調(diào)輔助性T細胞的活性，上調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell,Treg）免疫抑制性，抗CTLA-4抗體可以通過減弱CTLA-4的抑制功能和Treg的抑制作用來減輕T細胞耗竭[17,20]。CTLA-4抑制劑對免疫原性較差的腫瘤產(chǎn)生抗腫瘤活性需要與其他干預措施相結合。RT聯(lián)合CTLA-4阻斷可誘導CXCL16的分泌，CXCL16可與TH1輔助細胞表面的CXCR6+結合并共同刺激CD8+T細胞募集到腫瘤部位，導致原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的消退[21]。

RT與抗CTLA-4聯(lián)合治療在多種實體瘤治療中取得了良好的療效。在不同腫瘤類型中，RT都有一個最佳劑量來誘導免疫和與免疫抑制劑結合[22]。在GBM實驗中，腫瘤植入后第10天給予小鼠單次放射治療，劑量為10 Gy，于第11、17、23天給予800 μg抗CTLA-4抗體，結果顯示接受RT和CTLA-4阻斷聯(lián)合治療的小鼠的中位生存期為29天，與對照組相比其生存期明顯延長，且接受聯(lián)合治療30天后50%的小鼠依然存活，而給予抗CTLA-4抗體和局灶性RT的對照組小鼠均于腫瘤植入后30天內(nèi)死亡。實驗說明聯(lián)合治療可以提高小鼠的生存期，該實驗組同時對抗CTLA-4抗體的最佳治療時間進行了研究，發(fā)現(xiàn)在第10天首先用局部放療治療，然后在第12、14和15天用CTLA-4阻斷治療的動物中位生存期為27.5天（與未治療相比）。當CTLA-4阻斷劑在第10天與RT同時給藥，然后在第12和14天再注射時，中位生存期從21.5天延長至29天。CTLA-4阻斷劑在腫瘤植入后的第8天也就是放療前第2天開始給藥，隨后在腫瘤植入后的第10和12天再注射，其中位生存期為29.5天[23]。然而與之前研究不同的是，在此實驗中發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4抗體與RT聯(lián)合治療的時間順序?qū)τ谛∈蟮纳嫫谟绊懰坪醪⒉惶黠@，對此我們需要進行大量的臨床試驗進行驗證，從而探索聯(lián)合治療在GBM治療中的最佳方案。目前針對放療后應用抗CTLA-4藥物（Ipilimumab）和替莫唑胺的療效對比的臨床Ⅱ期試驗（ISCTN84434175）研究正在進行中[24]。

2.2 放療與PD-1/PD-L1

程序性死亡蛋白1（PD-1）是一種在活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞、Treg和自然殺傷（natural killer,NK）細胞表面上表達的跨膜蛋白質(zhì)，與程序性死亡配體1（PD-L1）的結合有效地阻斷了T細胞的增殖和細胞因子的產(chǎn)生，進而促進腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[25]。針對PD-1/PD-L1的阻斷可以有效引發(fā)抗腫瘤T細胞反應，并在晚期癌癥患者治療中產(chǎn)生較好的療效，一些研究將RT與PD-1/PD-L1抑制劑進行結合[26]。

RT除了通過誘導免疫原性細胞死亡來激活宿主免疫外，還可以通過JAK-STAT-IRF途徑誘導IFN-γ產(chǎn)生進而使PD-L1上調(diào)達到免疫抑制。但相關研究表明抗PD-1/PD-L1抗體可以抵消這種免疫抑制，這進一步闡明了RT與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合治療的重要意義[27]。在GBM小鼠的對照實驗中，于腫瘤植入后的第10天給予小鼠大腦單劑量10 Gy輻射，放射后立即注射10 mg/kg抗PD-1抗體，并于腫瘤植入后的第12天及14天再加兩次，結果顯示，與其他對照組相比，SBRT+抗PD-1組的小鼠生存期及存活率顯著提高且平均腫瘤體積生長明顯延遲[28]。相對于PD-1阻斷在GBM治療中的影響，大多數(shù)學者認為抗PD-L1更有效，在對GBM患者的外周血與腫瘤細胞進行的流式細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，PD-L1在荷瘤小鼠和GBM患者的循環(huán)單核細胞和腫瘤巨噬細胞上高表達[29]。為明確PD-L1在GBM治療中的意義，Ding等測量了60例患者中51例血漿樣本中的可溶性程序性死亡配體1（sPD-L1），發(fā)現(xiàn)RT（30±10 Gy,2 Gy/f）后的sPD-L1平均濃度顯著高于RT前的基線sPD-L1水平，并使用60例患者的腫瘤組織進行了小鼠實驗，給予小鼠RT（20 Gy）+200 μg抗PD-L1抗體，與對照實驗相比sPD-L1濃度顯著下調(diào)，且降低了小鼠腫瘤的生長[30]。臨床前實驗均表明聯(lián)合治療的有效性，RT為免疫治療提供相關表型，而免疫檢查點抑制劑通過直接激活巨噬細胞中的抗腫瘤表型和促炎表型來增強輻射誘導的遠隔反應[31]。但對于臨床應用實施，則需要更多數(shù)據(jù)指導。目前有兩項臨床試驗正在進行：一項Ⅲ期隨機開放研究，比較兩種治療（抗PD-1藥物nivolumab+RT與替莫唑胺+RT）在O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）未甲基化膠質(zhì)母細胞瘤患者中的總生存期（CheckMate-498）；另一項臨床試驗是評估低分割立體定向放療和抗PD-L1藥物（durvalumab）在復發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤（試驗編號STERIMGLI）患者中的安全性。

2.3 放療與Tim-3

T 淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）是一種跨膜蛋白，也是免疫細胞上的抑制性受體，主要在分泌干擾素γ的CD4+T輔助細胞1和CD8+T細胞毒性細胞上選擇性表達，也可在單核/巨噬細胞、DC、Treg、腫瘤浸潤淋巴細胞上表達，其主要作用是誘導T細胞衰竭[32-33]。Tim-3在膠質(zhì)瘤患者外周血及腫瘤的T細胞上過表達，與低級別膠質(zhì)瘤相比，高級別膠質(zhì)瘤上Tim-3表達顯著上調(diào)[34-35]。

Tim-3在GBM治療中具有重要地位，在對RT+抗PD-L1耐藥機制研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)RT+抗PD-L1治療后早期和晚期采集的腫瘤標本中，表達Tim-3的CD4+細胞的比例分別增加了1.83和2.40倍。Tim-3在CD8+T細胞上的平均熒光強度在早期和晚期腫瘤中分別增加了2.19和2.80倍，且在對腫瘤進行RNA測序后發(fā)現(xiàn)，其他T細胞共抑制受體未表達[36]。與之相同的是，體內(nèi)小鼠模型實驗在抗PD-1治療之前給予SBRT（10 Gy）以誘導炎性反應為隨后的免疫治療提供腫瘤微環(huán)境，于腫瘤植入后的第10、12、14天給予每只動物200 μg抗PD-1抗體，第7、11、15天給予每只動物250 μg抗Tim-3抗體，結果顯示與單獨治療組相比，RT+抗PD-1抗體+抗Tim-3抗體組中CD4+和CD8+T細胞頻率顯著增加，且小鼠生存期明顯提高[37]。實驗發(fā)現(xiàn)，Tim-3阻斷可作為PD-1/PD-L1耐藥的一種替代治療，但聯(lián)合治療需確定RT的劑量、順序及時間，有學者針對IMRT和SBRT對Tim-3表達的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)患者在接受IMRT（2 Gy）或SBRT（7.25 Gy）治療后6 h內(nèi)，IMRT誘導的Tim-3表達高于SBRT，其余試驗時間段Tim-3在SBRT中的表達更高，但總體研究顯示RT誘導Tim-3呈緩慢持續(xù)性增加狀態(tài)[38]。

2.4 放療與TIGIT

T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT）是一種抑制性免疫球蛋白受體，在活化的T細胞和NK細胞上表達，主要抑制活化的T細胞和NK細胞并促進Treg功能恢復。目前研究發(fā)現(xiàn)TIGIT在人GBM中高表達，成為癌癥免疫治療的新候選靶點[39-40]。對于該靶點進行的小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，單獨使用抗TIGIT治療對控制腫瘤生長產(chǎn)生較小影響，且小鼠的長期生存率為0[41]。放療可以增加T細胞活化，促進抗腫瘤免疫反應。在CT26結腸腫瘤的小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，在RT（3×8 Gy）方案下TIGIT的表達增加，而在RT（18×2 Gy）方案下TIGIT的表達顯著降低。當在抗PD-L1和RT（3×8 Gy）聯(lián)合治療時，抗TIGIT才會產(chǎn)生顯著的抗腫瘤作用。而當與RT（18×2 Gy）或RT（18×2 Gy）和抗PD-L1聯(lián)合治療時，抗TIGIT沒有顯著的抗腫瘤作用[42]。

RT和抗TIGIT聯(lián)合治療對于GBM治療的影響，目前仍缺乏相關臨床前及臨床試驗。

2.5 放療與其他免疫檢查點分子

除了以上幾種免疫檢查點，臨床前研究在使用吲哚胺2,3雙加氧酶（indoleamine2,3-dioxygenase,IDO）、淋巴細胞活化因子3（lymphocyte activation gene-3,LAG-3）或OX-40的抗體的GBM小鼠模型中也實現(xiàn)了最佳客觀緩解率。

IDO是一種細胞內(nèi)酶，于高齡GBM患者的腦實質(zhì)中高表達，一般通過降低色氨酸水平抑制T細胞增殖并導致T細胞凋亡和Treg積累[43]。Ahlstedt等對IDO抑制劑與RT聯(lián)合治療療效進行研究，在小鼠接種腫瘤的第7天將10 mg IDO抑制劑注入小鼠腹腔，持續(xù)10天，并于接種后第7、11天給予RT（8 Gy），發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤較對照組及單次RT+IDO抑制劑組明顯變小，且具有明顯的生存優(yōu)勢[44]。

LAG-3也是一種抑制性受體，通過與主要組織相容性復合體Ⅱ類（MHCⅡ類）分子結合來下調(diào)T細胞活性。此外，LAG-3還增強了Tregs的內(nèi)在抑制活性。一項正在進行的Ⅰ期研究（NCT03250832）單獨評估了抗LAG-3抗體TSR-033以及與抗PD-1抗體的組合[45]。在其他實體腫瘤上目前已有實驗證明了RT和抗LAG-3聯(lián)合治療取得的良好效果[46]，但在GBM治療中仍缺少相關實驗。

OX-40是一種TNF家族共刺激因子，在激活記憶CD4+T細胞和CD4+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞上表達，與其配體OX40L相互作用充當共刺激信號[47]。Shibahara等[48]將人GBM細胞與OX40L共培養(yǎng)后得出，在GBM細胞中表達的OX40L可誘導T細胞活化，從而增強抗腫瘤適應性免疫反應。但RT與抗OX-40抗體聯(lián)合治療在GBM治療中的具體方案并無相關研究，不過一項抗PD-1耐藥的肺腫瘤模型研究將實驗分成三組：15 Gy分3次5 Gy分割（較低的立體定向劑量）、15 Gy分5次3 Gy分割（常規(guī)劑量）、24 Gy分兩次12 Gy（更高的立體定向劑量）。結果顯示，24 Gy分兩次12 Gy對原發(fā)性腫瘤生長產(chǎn)生了最大的抑制，對照組和僅抗OX40組（5次100 μg瘤內(nèi)注射，間隔4天）對腫瘤生長沒有明顯影響。對上述實驗治療順序帶來的效果分別進行觀察，認為首先給予RT，然后給予抗OX40在抑制小鼠抗PD-1耐藥性腫瘤的生長方面最有效[49]。這為隨后的GBM實驗研究提供了有效的思路。

3 總結與展望

由于GBM呈侵襲浸潤生長，與周圍正常腦組織界限不清，故手術難以將其完全切除，而放療和化療又存在放射抵抗和耐藥性，所以人GBM仍然是預后最差的腫瘤之一。RT可以在殺傷腫瘤細胞的同時激活抗腫瘤免疫反應，與免疫檢查點抑制劑產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，并在GBM的臨床前實驗中取得良好療效。然而放射治療對腫瘤的影響復雜多變，為優(yōu)化免疫治療效果，我們需進一步明確放療的分割劑量、最佳時間、順序，并探討與不同免疫檢查點抑制劑的組合應用，從而為GBM的治療提供新的有效策略。